Mồi
|
Trình tự
|
Sản phẩm
|
WSE/1 (146F1)
|
5'-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3'
|
1447 bp
|
WSE/2 (146R1)
|
5'-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3'
|
WSI/3 (146F2)
|
5'-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3'
|
941 bp
|
WSI/4 (146R2)
|
5'-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3'
|
5.1.2 Dung dịch mồi
Dùng
dung dịch đệm TE (5.1.3) để pha loãng mồi đến nồng độ 25 mM.
5.1.3 Dung dịch đệm TE
Chuẩn
bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM,
dùng HCl để chỉnh pH 7,6.
5.2 Thuốc thử tách chiết DNA dùng dung dịch đệm
5.2.1 Thành phần
Tris 50 mM
Tris
(hydroxymetyl)-aminometan (6,06 g trong 1 l)
EDTA 1 mM
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
NaCl 500 mM
Natri clorua (29,22
g trong 1 l)
SDS 1 %
Natri dodecyl
sulfat (10 g trong 1 l)
Proteinaza K 10
µg/ml
Chỉ thêm vào trước
khi thực hiện tách chiết
5.2.2 Pha chế dung
dịch đệm
Hòa tan Tris, EDTA và
NaCl với lượng nước cất vô trùng ít hơn thể tích cuối cùng. Giữ cho dung dịch
luôn được khuấy đảo đều, chỉnh pH về giá trị 8,0 bằng HCl. Khi pH thấp, EDTA sẽ
tan dễ dàng. Cuối cùng thêm lượng SDS cần thiết vào dung dịch và thêm nước cho
đủ thể tích cuối cùng. Hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 min. Dung
dịch dung dịch đệm sau khi pha được bảo quản ở 4 oC.
CHÚ
THÍCH Trước khi sử dụng dung dịch đệm ly trích, thì bổ sung thêm proteinaza K với
nồng độ như trên (5.2.1). Ví dụ: thêm 50 µl dung dịch proteinaza K nồng độ gốc
20 mg/ml vào mỗi 10 ml dung dịch đệm ly trích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.3 Thuốc thử tách chiết DNA dùng hệ thống cột ly tâm
5.3.1 Dung
dịch đệm mô
Chuẩn bị 20
ml dung dịch gồm urê 4 M, Tris 200 mM, NaCl 20 mM, EDTA 200 mM, có pH 7,4. Bảo
quản ở 25 oC.
5.3.2 Dung
dịch đệm giải
Chuẩn bị 20
ml dung dịch gồm guaninidin-HCl 6M, urê 10 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 20
%, có pH 4,4. Bảo quản ở 25 oC.
5.3.3 Proteinaze
K, là
chất lyophilizat dùng để bất hoạt enzym nucleaza.
5.3.4 Dung
dịch đệm để loại bỏ chất ức chế
Chuẩn bị 33
ml dung dịch gồm guanidin-HCl 5 M, Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Thêm 20 ml etanol
tinh khiết. Bảo quản ở 25 oC.
5.3.5 Dung
dịch đệm rửa
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.3.6 Dung
dịch đệm rửa giải
Chuẩn bị 40
ml dung dịch Tris-HCl 10 mM, có pH 8,5. Bảo quản ở 25 oC.
5.4 Hỗn hợp phản ứng PCR từng thành phần
5.4.1 Hỗn hợp
phản ứng PCR - bước 1 (100 µl/ống phản ứng)
Nước thêm vào
72,6 µl
Dung dịch đệm
(không chứa Mg2+) 10,0 µl
MgCl2
50 mM 3,0 µl
dNTP 10 mM 2,0
µl
Mồi WSE/1
20 µM 5,0 µl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
DNA
polymeraza 5U/µl 0,4 µl
DNA đích 2
µl
5.4.2 Hỗn
hợp phản ứng PCR - bước 2 (100 µl/ống phản ứng)
Nước thêm
vào 64,6 µl
Dung dịch
đệm (không chứa Mg2+) 10,0 µl
MgCl2
50 mM 3,0 µl
dNTP 10 mM 2,0
µl
Mồi WSI/3
20 µM 5,0 µl
Mồi WSI/4
20 µM 5,0 µl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dung dịch
phản ứng PCR của bước 1: 2 µl
CHÚ THÍCH Nếu
dung dịch đệm PCR đã có sẵn MgCl2 thì sẽ không cần bổ sung thêm. Để
bảo quản hỗn hợp PCR trong tủ đông thì không bổ sung emzym và mồi; khi sử dụng
sẽ bổ sung. Thể tích của một hỗn hợp phản ứng PCR cần pha bằng thể tích phản
ứng trừ thể tích mẫu (DNA đích thêm vào). Có thể sử dụng thuốc thử và các sản
phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu
hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây (5.5).
5.5 Hỗn hợp phản ứng PCR – dạng chuẩn bị sẵn để dùng cho PCR hạt
5.5.1 Thành
phần
Thành phần
của hỗn hợp phản ứng PCR gồm: mỗi dNTP có nồng
độ 200 µM trong Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM và MgCl2 1,5 mM, 2,5 đơn
vị Taq DNA polymeraza tinh khiết, có pH 9,0. Trước khi sử dụng hạt phải được
hoàn nguyên đến thể tích cuối 25 µl.
5.5.2 Hỗn hợp
phản ứng PCR hạt bước 1
PCR hạt 01
hạt
Nước thêm vào
23,0 µl
Mồi WSE/1
0,5 µl (0,31 µM)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
DNA đích 1
µl
5.5.3 Hỗn hợp
phản ứng PCR hạt bước 2
PCR hạt 01
hạt
Nước thêm vào
23,5 µl
Mồi WSI/3 0,5
µl (0,31 µM)
Mồi WSI/4 0,5
µl (0,31 µM)
Dung dịch
phản ứng PCR của bước 1: 0,5 µl
5.6
Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X)
Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit
boric trong 600 ml nước. Thêm 40 ml EDTA 0,5 M (5.7), và thêm nước cho đủ 1 l.
Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi
sử dụng pha loãng với nước thành dung dịch 1X.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa
tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4
M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min. Bảo
quản ở nhiệt độ phòng.
5.8
Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần
Chuẩn
bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol
FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM [sử dụng dung dịch EDTA (5.7)]. Bảo quản
ở nhiệt độ –20 °C.
5.9
Dung dịch DEPC
Dung
dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % (thể tích), lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để
qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 min. Bảo
quản ở nhiệt độ –20 °C.
5.10
Thạch agaroza 1,5 %
Cân 1,5 g
agaroza trong 100 ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng làm tan hoàn toàn agaroza.
Để nguội từ 55 °C đến 60 °C, lắc đều, tránh tạo bọt khí.
5.11 Bảng thạch agaroza
Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, đổ
thạch
agaroza (5.10) vào khuôn với bề dày khoảng
3 mm đến 5 mm. Để nguội và đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt thạch
agaroza vào trong máng điện di, các giếng
của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE 1X cho ngập mặt thạch
agaroza trước khi cho sản phẩm khuếch đại
vào để điện di.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hút 5 µl dung
dịch etidi bromua (10 mg/ml) hoà tan trong 100 ml nước.
Bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng –20 °C.
5.13
Thang DNA
Sử dụng thang
đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 341 bp. Có thể sử dụng sản
phẩm khuếch đại có kích thước 341 bp đã biết trước.
6.
Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng các
thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như
sau:
6.1 Máy chu
trình nhiệt,
có thể thực hiện chính xác và lặp lại chu trình thời gian và nhiệt độ được quy
định trong 7.4.5.
6.2 Máy lắc
vortex.
6.3 Máy ly
tâm lạnh,
có thể hoạt động với tốc độ tối đa trên 13 000 r/min.
6.4 Hệ thống
phát hiện các sản phẩm PCR, bao gồm:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
b) khuôn,
khay, lược dùng để tạo bảng thạch
agaroza
c) bàn đọc
kết quả, với tia UV bước sóng 302 nm
d) bộ phận
chụp ảnh để lưu kết quả, ví dụ: máy đọc Gel- Doc (nếu có).
6.5 Tủ đông, có
thể hoạt động ở nhiệt độ không lớn hơn –20 oC.
6.6 Tủ lạnh, có
thể hoạt động ở nhiệt độ từ 2 oC đến 8 oC.
6.7 Tủ thao
tác vô trùng.
6.8 Cân phân
tích,
có thể cân chính xác đến 0,001 g.
6.9 Micropipet, dung
tích 10 µl, 20 µl, 100 µl và 1 000 µl; có đầu típ (với dung
tích nhỏ hơn hoặc bằng 10 µl phải sử dụng đầu típ có lọc).
6.10 Ống phản
ứng,
chuyên dùng cho PCR, dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.12 Ống góp, dùng bọc
ngoài ống lọc tinh.
7. Cách tiến hành
7.1
Chuẩn bị mẫu
7.1.1 Đối với mẫu
tôm hậu ấu trùng (postlarvae)
Lượng mẫu
dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 15 cá thể; lấy phần đuôi, không lấy gan
tuỵ.
7.1.2 Đối với
mẫu tôm bố mẹ
Lượng mẫu
dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 15 cá thể; lấy phần đuôi, không lấy gan
tuỵ.
7.1.3 Đối với
mẫu tôm thương phẩm
Lượng mẫu cần
dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg, lấy ở phiến mang tôm, hoặc chân
bơi, chân bò hoặc phần cơ hoặc 100 µl dịch bạch huyết của tôm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Lượng mẫu
dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg: lấy mang, cuống mắt, phần cơ hoặc 100
µl dịch bạch huyết.
7.2
Tách chiết RNA
Sử dụng một
trong hai quy trình tách chiết DNA theo thuốc thử mục (5.2) hoặc (5.3) để tách
chiết DNA. Theo quy trình tách chiết DNA (7.2.2) dịch DNA được lọc tinh khiết
hơn so với quy trình (7.2.1).
7.2.1 Tách
chiết DNA dùng dung dịch đệm
Cho khoảng
100 mg đến 200 mg mẫu (7.1) vào ống phản ứng dung tích 1,5 ml, bổ sung 600 µl
dung dịch đệm (5.2.2). Nghiền
nhuyễn mẫu.
Ủ mẫu đã nghiền ở 95 0C
trong 10 min. Sau đó ly tâm với tốc độ 12 000 r/min trong 10 min. Chuyển
200 µl dịch nổi phía trên vào ống phản ứng sạch dung tích 1,5 ml. Thêm 400 µl
etanol 95 %.
Lắc mẫu bằng máy lắc
Vortex rồi ly tâm với tốc độ 12 000 r/min trong 5 min. Gạn bỏ dung
dịch etanol, giữ lại cặn. Làm khô cặn DNA.
Hoà tan phần cặn trên
với dung dịch DEPC (5.9)
hoặc dung dịch đệm TE (5.1.3).
CHÚ THÍCH Do nguồn
mẫu khác nhau, chứa lượng DNA khác nhau, vì vậy cần điều chỉnh nồng độ DNA bằng
cách hoà tan DNA vào các thể tích dung dịch DEPC hoặc dung dịch TE phù hợp theo
lượng cặn DNA thu hồi được. Xác định hàm lượng DNA thu được bằng cách đo giá
trị mật độ quang (OD) của dịch pha loãng theo tỉ lệ 1: 5 (10 µl dịch DNA thu
được 40 µl nước) ở bước sóng 260 nm (OD260) hoặc bằng cách tiến hành
điện di 10 µl dịch DNA thu được ở nồng độ thạch agaroza 1,5 %.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.2.2 Tách chiết
DNA dùng hệ thống cột ly tâm
Cho khoảng
100 mg đến 200 mg mẫu (7.1) vào ống phản ứng dung tích 1,5 ml, thêm 200 µl dung
dịch đệm mô (5.3.1), nghiền mẫu bằng chày nghiền vô trùng.
Tiếp tục thêm
50 µl proteinaza K (5.3.3), trộn đều dung dịch, ủ ống này ở 55 oC
trong 1 h.
Thêm 200 µl
dung dịch đệm giải (5.3.2), trộn đều ngay và đem ủ ở 70 oC trong 10
min.
Làm ấm lọ
dung dịch đệm rửa giải (5.3.6) ở 70 oC.
Ly tâm các
ống phản ứng dung tích 1,5 ml ở tốc độ 13 000 r/m trong 30 s nhằm loại bỏ mô
chưa thuỷ phân.
Chuyển 200 µl
phần dịch nổi sang các ống phản ứng 1,5 ml mới chứa sẵn 100 µl isopropanol.
Trộn đều và chuyển toàn bộ dung dịch sang các ống lọc tinh có gắn ống góp.
Ly tâm các
ống với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần
dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.
Thêm
500 µl dung dịch đệm loại bỏ chất ức chế (5.3.4) vào các ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min.
Bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ly tâm các ống góp
chứa ống lọc tinh ở tốc độ 13 000 r/min trong 20 s để loại bỏ hoàn toàn dung
dịch đệm rửa từ các ống lọc tinh này.
Chuyển các ống lọc
tinh sang ống phản ứng mới, dung tích 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch đệm rửa
giải đã được làm ấm ở 70 oC, ly tâm với tốc
độ 8 000
r/min trong 1 min.
Loại
bỏ các ống lọc tinh, thu được dung dịch DNA ở trong ống phản ứng. Dịch tách chiết DNA sử dụng ngay cho phản ứng khuếch đại
hoặc bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng –20 oC.
7.3 Chuẩn bị các
mẫu kiểm chứng cho phản ứng PCR
7.3.1 Mẫu kiểm soát
Dung
dịch nước cất hai lần hoặc dung dịch DEPC.
7.3.2 Mẫu kiểm
chứng âm tính
Mẫu tôm không
bị bệnh đã biết trước hoặc có thể sử dụng mồi đặc hiệu cho nhóm giáp xác mười
chân thay cho việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu ở trên (5.1.1): mồi xuôi: 143F
5'-TGC-CTT-ATC-AGCTNT-CGA-TG-TAG-3' và mồi ngược: 145R
5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3'; sản phẩm thu được sau khi khuếch đại là
848 bp.
7.3.3 Mẫu kiểm
chứng dương tính
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.4
Khuếch đại DNA bước 1
7.4.1 Mẫu thử
Hút 2 µl dịch
DNA của mẫu vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1
µl dịch DNA của mẫu vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).
7.4.2 Mẫu
kiểm soát
Hút 2 µl
(7.3.1) vào ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1 µl dịch DNA của
mẫu vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).
7.4.3 Mẫu
kiểm chứng âm tính
Hút 2 µl
(7.3.2) vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1 µl (7.3.3)
vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).
7.4.4 Mẫu
kiểm chứng dương tính
Hút 2 µl
(7.3.3) vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1 µl (7.3.2)
vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.4.5 Đặt các ống vào máy chu trình nhiệt để thực
hiện phản ứng chuỗi trùng hợp theo chu kỳ luân nhiệt như sau:
Số chu kỳ
Nhiệt độ, oC
Thời gian
Bước
1
94
2 min
Biến tính ban đầu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
94
30 s
Biến tính
55
30 s
Lai/ bắt cặp
72
30 s
Kéo dài mạch
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
72
5 min
Kéo dài mạch
4
Giữ ổn định
7.5 Khuếch
đại DNA bước 2
7.5.1 Sau khi có sản phẩm
khuếch đại DNA bước 1, chuyển 10 µl sản phẩm PCR khuếch đại này vào mỗi ống hỗn
hợp PCR bước 2 (5.4.2). Hoặc chuyển 0,5 µl sản phẩm PCR khuếch đại DNA bước 1
vào mỗi ống hỗn hợp PCR-hạt bước 2 (5.5.2).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu kiểm soát: sản
phẩm khuếch đại DNA từ bước 1 của mẫu kiểm soát cho vào một ống phản ứng PCR
bước 2.
Mẫu kiểm chứng âm
tính: sản phẩm khuếch đại DNA từ bước 1 của mẫu kiểm chứng âm tính cho vào một
ống phản ứng PCR bước 2.
Mẫu kiểm chứng dương
tính: sản phẩm khuếch đại DNA từ bước 1 của mẫu kiểm chứng dương tính cho vào
một ống phản ứng PCR bước 2.
Đánh số cho các ống
và đậy chặt nắp ống. Ly tâm nhẹ để dung dịch tụ xuống đáy ống trước khi cho các
ống vào máy chu trình nhiệt.
7.5.2 Đặt các ống vào máy
chu trình nhiệt để thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp theo chu kỳ luân nhiệt (7.4.5).
7.5.3 Giữ các sản phẩm
khuếch đại bước 2 ở 4,0 0C cho đến khi điện di.
7.6 Điện
di
7.6.1 Cho từ 5 µl đến 7 µl
dung dịch đệm tải mẫu (5.8) vào các ống sản phẩm khuếch đại (7.5.3), trộn đều.
7.6.2 Hút từ 5 µl đến 7 µl
dịch tương ứng từ các ống (7.6.1), theo thứ tự: thang DNA, mẫu kiểm chứng dương
tính, mẫu kiểm chứng âm tính và các mẫu, nhỏ vào từng giếng trên bảng thạch
(5.11).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH Dung dịch
đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm của bromophenol blue; màu xanh
nhạt của xylen xyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách
giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di. Sau đó,
lấy thạch agaroza từ buồng điện di ra để nhuộm với etidi bromua.
7.6.4 Nhuộm etidi bromua:
Đặt bảng thạch agaroza vừa điện di vào khay nhựa sạch, đổ dung dịch etidi bromua (5.12) ngập bảng thạch.
7.6.5 Lắc nhẹ
trong khoảng 20 min. Vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa với nước cất
trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề mặt bảng thạch.
7.6.6 Đặt bảng
thạch trên bàn đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm hoặc chụp hình ảnh bằng
máy Gel- Doc (nếu có).
7.7 Đọc kết quả
7.7.1 Dưới ánh
sáng của tia UV, các đoạn cDNA có gắn etidi bromua phát quang tạo thành vạch
sáng.
7.7.2 Đối chiếu
các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu kiểm chứng dương tính
và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.
7.7.3 Cách đọc kết
quả:
Kết quả điện di
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Vạch 1447 bp
Vạch 941 bp
Kết quả
Thang DNA
Phân vạch rõ ràng
và sáng theo kích thước sử dụng
Điện di tốt
Mẫu kiểm chứng dương tính
Có
Có
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không
Có
Đạt yêu cầu
Không
Không
Mẫu kiểm chứng
dương tính hỏng, enzym hỏng
Có
Không
Không đạt yêu cầu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không
Không
Không ngoại nhiễm
Có
Có
Bị ngoại nhiễm
Có
Không
Không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu
Có
Có
Không phát hiện
WSSV
Không
Có
Âm tính với WSSV
Không
Không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Có
Không
Không chấp nhận kết
quả. Phân tích lại mẫu
8. Diễn
giải kết quả
8.1
Kết quả âm tính với WSSV
Kết
quả được coi là âm tính khi:
a)
mẫu thử không có vạch sáng kích thước 941 bp và không có vạch sáng kích thước 1447
bp, hoặc vạch sáng kích thước khác với mẫu kiểm chứng dương tính;
b)
có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;
c)
không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8.2
Kết quả dương tính với WSSV
Kết
quả được coi là dương tính khi:
a)
mẫu thử có vạch sáng kích thước 941 bp, có thể có hoặc không có vạch sáng kích
thước 1447 bp;
b)
có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;
c)
không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;
d)
thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.
9. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử
nghiệm phải ghi rõ:
–
mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
–
phương pháp thử sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
–
mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều kiện được coi
là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có);
–
kết quả thử nghiệm thu được.