Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8375:2010 về thủy sản và sản phẩm thủy sản - Xác định hàm lượng metyltestosteron

• Số hiệu: TCVN8375:2010
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2010

Nồng độ trong mẫu, µg/kg		Thể tích chuẩn hỗn hợp SMD2, µl	Thể tích nội chuẩn hỗn hợp ISMD2, µl
Metyltestosteron /dietylstilbestrol	Metyltestosteron-d3/ dietylstilbestrol-d6
0	2,0	0	100
0,5	2,0	25	100
1,0	2,0	50	100
1,5	2,0	75	100
2,0	2,0	100	100

Cân 5,0 g mẫu thử đã nghiền vào ống nghiệm nhựa 50 ml có nắp. Thêm chính xác 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn ISMD2 (hàm lượng nội chuẩn trong mẫu là 2 µg/l), để yên 30 min.

Thêm 15 ml dung dịch đệm Tris 0,1 M (pH 9,5) chứa 5 mg subtilisin vào các ống nghiệm đã chuẩn bị ở 5.1.2, 5.1.3, 5.1.4. Lắc và trộn đều trong 2 min bằng máy lắc (vortex). Ủ hỗn hợp trong 2 h ở 52 ^0C trong tủ ủ. Sau đó làm lạnh hỗn hợp đến nhiệt độ phòng.

Thêm 10 ml TBME. Lắc và trộn đều trong 10 min bằng máy lắc. Ly tâm mẫu với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min. Dùng pipet hút lớp TBME sang ống nghiệm 50 ml mới. Thêm 10 ml TBME vào cặn mẫu. Lắc và trộn đều trong 10 min bằng máy lắc. Ly tâm mẫu với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min. Dùng pipet hút lớp TBME sang cùng ống nghiệm 50 ml chứa TBME trước đó. Thổi khô dung dịch TBME trong ống nghiệm dưới dòng khí nitơ ở 55 ^0C.

Thêm 4 ml hỗn hợp metanol : nước (tỷ lệ 4 : 1 theo thể tích) vào ống nghiệm, lắc đều.

Thêm 6 ml hexan. Lắc mạnh trong 30 s. Ly tâm trong 5 min với tốc độ 3 000 r/min. Loại bỏ lớp hexan.

Thêm 4 ml hexan. Lắc mạnh trong 30 s. Ly tâm trong 5 min với tốc độ 3 000 r/min. Loại bỏ lớp hexan.

Cô dung dịch trong ống nghiệm dưới dòng khí nitơ ở 55 ^oC đến khi còn khoảng 0,5 ml. Thêm 3 ml hỗn hợp metanol : nước (tỷ lệ 1 : 9 theo thể tích). Lắc đều.

Hoạt hóa cột Oasis HLB bằng 3 ml metanol và 3 ml nước. Hoạt hóa cột amino bằng 3 ml hỗn hợp axeton : metanol (tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích).

Cho dung dịch mẫu qua cột Oasis HLB đã hoạt hóa. Rửa cột 3 lần, lần 1 dùng 3 ml metanol 5 % trong hỗn hợp ammoni 2 % trong nước (theo thể tích), lần 2 dùng 3 ml metanol 40 % trong hỗn hợp ammoni 2 % trong nước (theo thể tích), lần 3 dùng 3 ml nước. Giải hấp bằng 3 ml dung dịch giải hấp (hỗn hợp axeton : metanol, tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích).

...

...

...

Tiêm 20 µl dung dịch vào hệ thống LC-MS/MS.

– Pha động A: nước HPLC

– Pha động B: metanol HPLC

– Thành phần pha động thay đổi theo thời gian (chế độ gradient) được mô tả ở Bảng 2.

Bảng 2 – Thành phần pha động theo thời gian

Thời gian, min

Pha động A, % thể tích

Pha động B, % thể tích

Tốc độ dòng, ml/min

...

...

...

60

40

0,7

12

30

70

0,7

22

30

...

...

...

0,7

22,1

15

85

0,7

23,1

15

85

0,7

...

...

...

60

40

0,7

28

60

40

0,7

– thể tích tiêm: 20 µl

– tốc độ dòng: 0,7 ml/min

...

...

...

– nhiệt độ cột: 35 ^oC

5.3.2 Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ

Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ để xác định metyltestosteron

– nguồn ion hóa: ESI (+)

– điện thế mao quản: 1 kV

– điện thế bộ tách chiết: 2,0 V

– điện thế RF: 0,0 V

– nhiệt độ nguồn: 120 ^oC

– nhiệt độ khử dung môi: 400 ^oC

...

...

...

– bộ phân tích

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0

+ năng lượng ion hoá 1: 0,5 eV

+ điện thế cửa vào: –1 V

+ điện thế cửa ra: 1 V

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0

+ năng lượng ion hoá 2 : 3

...

...

...

+ áp suất chân không: 4,5 x 10^-3 mbar

+ chế độ vận hành: chuẩn

Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ để xác định dietylstilbestrol

– nguồn ion hóa: ESI (-)

– điện thế mao quản: 2 kV

– điện thế bộ tách chiết: 2,0 V

– điện thế RF: 0,0 V

– nhiệt độ nguồn: 120 ^oC

– nhiệt độ khử dung môi: 400 ^oC

...

...

...

– bộ phân tích

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0

+ năng lượng ion hoá 1: 1 eV

+ điện thế cửa vào: –1 V

+ điện thế cửa ra: 1 V

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0

+ năng lượng ion hoá 2: 1,5

...

...

...

+ áp suất chân không: 4,5 x 10^-3 mbar

+ chế độ vận hành: chuẩn

– các điều kiện phân ly MS/MS:

Bảng 3 – Các điều kiện phân ly MS/MS

Tên chất

Ion sơ cấp, m/z

Ion thứ cấp, m/z

Thời gian Dwell, s

Điện thế cone, V

...

...

...

Metyltestosteron

303

96,5 ^a)

108,6

0,1

0,1

35

35

...

...

...

26

Dietylstilbestrol

267,2

237,0 ^a)

222,5

0,1

0,1

45

...

...

...

31

41

Metyltestosteron-d₃

306

96,5

0,1

35

26

Dietylstilbestrol-d₆

...

...

...

225,5

0,1

45

41

^a) Phân ly 303 > 96,5 và 267,2 > 237,0 có cường độ cao, được sử dụng trong tính kết quả.

5.3.3 Thứ tự tiêm mẫu

– tiêm các dịch mẫu xây dựng đường chuẩn.

– tiêm dịch mẫu trắng.

– tiêm các dịch mẫu thử nghiệm. Tính hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol trong mẫu thử nghiệm.

...

...

...

Xây dựng đồ thị hệ số tín hiệu RF của dịch mẫu xây dựng đường chuẩn (trục tung) với nồng độ chất chuẩn metyltestosteron/ dietylstilbestrol bổ sung (trục hoành) theo phương pháp hồi quy tuyến tính:

RF = ax + b

Trong đó:

b          là tung độ góc của đường chuẩn;

a          là hệ số góc của đường chuẩn;

x           là nồng độ chất chuẩn metyltestosteron bổ sung trong mẫu (µg/kg);

RF        là hệ số tín hiệu, được tính theo:

Trong đó:

...

...

...

Sp_IS             là diện tích píc của ion thứ cấp của metyltestosteron-d₃ (306 > 96,5)/ dietylstilbestrol-d₆ (273,2 > 225,5).

Hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol có trong mẫu, C, được biểu thị bằng microgam trên kilogam (µg/kg) theo công thức sau:

C = (RF – b) / a

Trong đó:

RF            là hệ số tín hiệu của mẫu thử;

a, b           xem 5.4.

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

...

...

...

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU

A.1 Các sắc ký đồ tiêu biểu trong xác định metyltestosteron

A.1.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng

...

...

...

Metyltestosteron-d₃: thời gian lưu 11,86 min, 306 > 96,5

Metyltestosteron: thời gian lưu 11,86 min, 303 > 108,6, 303 > 96,5

A.1.2 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm metyltestosteron tại nồng độ 2,5 µg/kg

Metyltestosteron-d₃: thời gian lưu 11,88 min, 306 > 96,5

Metyltestosteron: thời gian lưu 11,90 min, 303 > 108,6, 303 > 96,5

A.1.3 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm metyltestosteron tại giới hạn phát hiện (0,5 µg/kg)

Metyltestosteron-d₃: thời gian lưu 11,78 min, 306 > 96,5

...

...

...

A.2 Các sắc ký đồ tiêu biểu trong xác định dietylstilbestrol

A.2.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng

A.2.2 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm dietylstilbestrol tại nồng độ 2,5 µg/kg

A.2.3 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm dietylstilbestrol tại giới hạn phát hiện (0,5 µg/kg)

Dietylstilbestrol: thời gian lưu 8,90 min, 267,2 > 237, 267,2 > 222,5

...

...

...

(Tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

B.1 Dữ liệu về độ chụm của phương pháp xác định metytestosteron

STT

Loại mẫu

Số lượng mẫu

Nồng độ chuẩn trong mẫu,

µg/kg

Kết quả phân tích

...

...

...

µg/kg

Độ thu hồi,

%

Độ lặp lại,

%

1

Cá cảnh

15

0,5

...

...

...

98

6

15

1,0

1,06

106

5

15

1,5

...

...

...

107

5

2

Cá tra

15

0,5

0,47

94

7

...

...

...

1,0

0,98

98

6

15

1,5

1,56

104

6

...

...

...

Cá basa

15

0,5

0,48

96

8

15

1,0

0,98

...

...

...

6

15

1,5

1,48

99

5

B.2 Dữ liệu về độ chụm của phương pháp xác định metytestosteron

STT

Loại mẫu

...

...

...

Nồng độ chuẩn trong mẫu,

µg/kg

Kết quả phân tích

Kết quả trung bình,

µg/kg

Độ thu hồi,

%

Độ lặp lại,

%

...

...

...

Tôm các loại

15

0,5

0,48

96

6

15

1,0

1,02

...

...

...

5

15

1,5

1,59

106

6

2

Cá tra

15

...

...

...

0,46

92

7

15

1,0

0,99

99

7

15

...

...

...

1,47

98

6

3

Cá basa

15

0,5

0,45

90

...

...

...

15

1,0

0,95

95

5

15

1,5

1,46

97

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] George Kaklamanos, Georgios Theodoridis, Themistoklis Dabalis, Journal of Chromatography A, (2009)

[2] A. Onal, Food Chem. 103 (2007) 1475

[3] N. Innocente, M. Biasutti, M. Padovese, S. Moret, Food Chem. 101 (2007) 1285

[4] G. mo Dugo, F. Vilasi, G.L. La Torre, T.M. Pellicano, Food Chem. 95 (2006) 672

[5] Y.I. Yashin, A.Y. Yashin, J. Anal. Chem. 59 (2004) 1121

[6] A.L. Cinquina, A. Cali, F. Longoa, L. De Santis, A. Severoni, F. Abballe, J. Chromatogr. A 1032 (2004) 73

[7] S. Cortacero-Ramırez, D. Arraez-Roman, A. Segura-Carreteo, A. Fernandez-Gutierrez, Food Chem. 100 (2007) 383

...

...

...

[9] G. Saccani, E. Tanzi, P. Pastore, S. Cavalli, M. Rey, J. Chromatogr. A 1082 (2005) 43

[10] F. Calbiani, M. Careri, L. Eviri, A. Mangia, L. Ristara, I. Zagnoni, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 3779

[11] F. Gosetti, E. Mazzucco, V. Gianotti, S. Polati, M.C. Gennaro, J. Chromatogr A 1149 (2007) 151.