TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 8350:2010
THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
AFLATOXIN ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Fish and fishery
products - Determination of aflatoxin content - Method using
high-performance liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8350 : 2010 được xây
dựng trên cơ sở AOAC 975.36 Aflatoxins in Food and Feeds. Romer Minicolumn
Method;
TCVN 8350 : 2010 do Cục Chế
biến, thương mại Nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu
chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
1. Phạm vi áp dụng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giới hạn phát hiện của
phương pháp là 1,5 mg/kg.
2. Nguyên tắc
Aflatoxin có trong mẫu thủy
sản bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng cloroform. Dịch
chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm
lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với
detector huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.
3. Thuốc thử và vật liệu
Chỉ sử dụng các thuốc thử và vật
liệu tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại
dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Metanol, loại dùng cho HPLC.
3.2 Cloroform, loại dùng cho HPLC.
3.3 n-hexan.
3.4 Ete etylic.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.6 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp
aflatoxin,
gồm aflatoxin B1 (100,0 mg/l), aflatoxin B2 (20,0 mg/l), aflatoxin G1 (100 mg/l) và aflatoxin G2 (20 mg/l).
3.7 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp
aflatoxin trong metanol, có nồng độ như 3.6
Chuẩn bị từ các ống chuẩn
aflatoxin. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức
và lượng metanol (3.1) thích hợp.
3.8 Dung dịch chuẩn trung gian
aflatoxin,
gồm aflatoxin B1 (10,0 mg/l),
aflatoxin B2 (2,0 mg/l),
aflatoxin G1 (10,0 mg/l)
và aflatoxin G2 (2,0 mg/l)
Hút chính xác 1,0 ml dung
dịch chuẩn gốc hỗn hợp (3.6) vào bình định mức 10 ml (4.3) rồi định mức tới
vạch bằng metanol (3.1).
3.9 Dung dịch chuẩn làm việc
aflatoxin
Hút chính xác lần lượt 0,0;
1,0; 2,0; 4,0; 8,0 và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (3.8) vào các bình
định mức 10 ml (4.3) rồi định mức tới vạch bằng metanol (3.1). Các dung dịch
chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau:
3.9.1 Dung dịch chuẩn 1,
gồm aflatoxin B1 (0,0 mg/l),
aflatoxin B2 (0,0 mg/l),
aflatoxin G1 (0,0 mg/l),
aflatoxin G2 (0,0 mg/l).
3.9.2 Dung dịch chuẩn 2,
gồm aflatoxin B1 (1,0 mg/l),
aflatoxin B2 (0,2 mg/l),
aflatoxin G1 (1,0 mg/l),
aflatoxin G2 (0,2 mg/l).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.9.4 Dung dịch chuẩn 4,
gồm aflatoxin B1 (4,0 mg/l),
aflatoxin B2 (0,8 mg/l),
aflatoxin G1 (4,0 mg/l),
aflatoxin G2 (0,8 mg/l).
3.9.5 Dung dịch chuẩn 5,
gồm aflatoxin B1 (8,0 mg/l),
aflatoxin B2 (1,6 mg/l),
aflatoxin G1 (8,0 mg/l),
aflatoxin G2 (1,6 mg/l).
3.9.6 Dung
dịch chuẩn 6, gồm aflatoxin B1 (10,0 mg/l), aflatoxin
B2 (2,0 mg/l), aflatoxin G1 (10,0 mg/l),
aflatoxin G2 (2,0 mg/l).
3.10 Dung dịch pha động
Pha hỗn hợp các dung môi
axetonitril, metanol và nước theo tỉ lệ 2:2:6 (thể tích).
3.11 Silicagel đã hoạt hóa
Cân 50,0 g silicagel tinh
khiết (cỡ hạt từ 60 mesh đến 200 mesh) để vào tủ sấy trong 2 h ở nhiệt độ 110 0C.
Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong cloroform
15 min trước khi nhồi cột.
3.12 Bông thuỷ tinh.
4. Thiết bị, dụng cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Bình cầu thủy tinh, dung tích 100 và 250 ml.
4.3 Bình định mức, dung tích 5 và 10 ml.
4.4 Ống ly tâm thuỷ tinh, dung tích 250 ml.
4.5 Pipet.
4.6 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min.
4.7 Bể siêu âm.
4.8 Hệ thống cô quay chân không.
4.9 Màng lọc mao quản, kích thước 0,4 mm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.11 Cột thủy tinh, có khóa teflon, loại dài
500 mm, đường kính trong 20 mm và loại dài 500 mm, đường kính trong 8 mm.
4.12 Cột sắc
ký pha đảo LC18, dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm,
kích thước hạt từ
5 mm đến 10 mm,
hoặc loại tương đương.
4.13 Hệ thống HPLC, được trang bị detector
huỳnh quang.
5. Cách tiến
hành
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Dùng cân phân tích (4.1) cân
50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly
tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.4).
5.1.2 Thêm
100,0 ml cloroform (3.2) vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 min bằng máy
nghiền (4.10). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.6) trong khoảng 5 min ở
tốc độ 5 000 r/min. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng cloroform rồi
cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.2).
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã
được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn
bị với mẫu thử theo 5.1.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn
3 (3.9.3) vào 10,0 g mẫu trắng. Đồng nhất mẫu bằng máy nghiền (4.10). Tiến hành
chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1. Phải chuẩn bị mẫu xác
định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng.
5.4 Làm sạch dịch chiết
5.4.1 Chuẩn bị cột
Đặt 1 lớp bông thủy tinh
(3.12) vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon (4.11). Đóng khóa và cho cloroform
tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g natri sulfat khan (3.5), 20,0 g
silicagel đã hoạt hóa (3.11), 15,0 g natri sulfat khan (3.5).
Để tránh khô cột, luôn giữ
mực cloroform cao hơn lớp natri sulfat khan trên cùng khoảng 1,5 cm.
5.4.2 Làm sạch dịch chiết
5.4.2.1 Cô dịch chiết thu được
(5.1.2) trên hệ thống cô quay chân không (4.8) đến khi còn khoảng 5,0 ml ở
nhiệt độ 40 0C. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu (5.2) vào
cột làm sạch đã chuẩn bị (5.4.1) và tráng rửa bình cầu bằng cloroform. Điều
chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 ml/min đến
1,5 ml/min. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel.
5.4.2.2 Thêm vào cột lần lượt 50,0
ml n-hexan (3.3), 50,0 ml ete etylic (3.4). Điều chỉnh tốc độ dung môi
chảy qua cột ở 1,0 ml/min. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột.
5.3.2 Giải hấp các aflatoxin khỏi
cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp cloroform và metanol theo tỉ lệ 97:3 (thể
tích) với tốc dộ 1,0 ml/min. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung
tích 100 ml (4.2). Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không (4.8) ở
nhiệt độ 40 0C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V)
dung dịch pha động (3.10) trong bình định mức 5 ml (4.3). Tiến hành phân tích
hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo 5.5.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.5 Tiến hành phân tích trên
HPLC
5.5.1 Điều kiện phân tích
– cột sắc ký: cột
(4.12);
– nhiệt độ cột: 35
0C;
– pha động: hỗn
hợp axetonitril, metanol và nước (3.10);
– tốc độ dòng: 1,0
ml/min;
– bước sóng cài đặt cho
detector huỳnh quang: (kích hoạt) Ex 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm;
– thể tích tiêm: 20
ml.
5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn
(3.9) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2
lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa
các diện tích pic thu được và nồng độ axit oxolinic theo quan hệ tuyến tính.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung
dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch
mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
6 Tính kết
quả
Hàm lượng các aflatoxin có
trong mẫu thử, C,
biểu thị bằng microgam trên kilogam (mg/kg) được tính theo công thức sau:
trong đó
Y là hiệu số giữa diện
tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính
theo đơn vị diện tích;
a là tung độ góc của
đường chuẩn y = ax + b;
b là hệ số góc của đường
chuẩn y = ax + b;
V là thể tích
dịch chiết thu được sau khi làm sạch (xem 5.4.2), tính bằng mililit (ml).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7. Độ
lặp lại và độ thu hồi
7.1 Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS,
tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ
hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu
hồi của mẫu, R, được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng
dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.3). Độ thu hồi tính
được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn
hơn 90 %.
8. Báo
cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải
ghi rõ:
a) mọi thông tin cần
thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã
sử dụng, nếu biết;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
d) mọi thao tác không
được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn và bất
kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu
được.