TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 8340:2010
NHUYỄN THỂ HAI
MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ (ASP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (PHẦN 1)
Bivalve molluscs
- Determination of amnestic shellfish poisons (ASP) content
- Method using high-performance liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8340 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm
thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,
Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
TCVN 8340:2010
NHUYỄN THỂ HAI
MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ (ASP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (PHẦN 1)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây
mất trí nhớ (ASP) trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC).
Giới hạn phát hiện của phương pháp
là 0,2 mg/g.
2. Nguyên
tắc
Độc tố ASP (axit domoic) được chiết từ thịt
nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng dung dịch axit clohydric 0,1 M. Xác định hàm lượng axit domoic
bằng HPLC dùng detector UV ở bước sóng 242 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
3. Thuốc
thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết
phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC
hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
3.2 Metanol, loại dùng cho HPLC.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.4 Dung dịch natri hydroxit (NaOH), nồng độ 0,1 M.
3.5 Dung môi chiết
Pha hỗn hợp metanol (3.2) và nước
theo tỷ lệ thể tích 1:1.
3.6 Pha động của HPLC
Pha 100 ml axetonitril (3.1) với
khoảng 400 ml nước trong bình định mức dung tích 1 000 ml (4.2). Sau đó, thêm
1,0 ml dung dịch axit trifloaxetic (TFA) (loại dùng để đo quang) và định mức
bằng nước đến vạch. Loại bỏ khí hoà tan trong pha động bằng cách để trong máy
siêu âm (4.8) trong khoảng 10 min.
3.7 Dung dịch đệm xitrat, nồng độ 0,5 M, pH 3,2
Hoà tan 40,4 g axit xitric ngậm 1
phân tử nước và 14,0 g triamoni xitric với 400 ml nước trong bình định mức dung
tích 500 ml (4.2). Sau đó, thêm 50 ml axetonitril (3.1) và định mức bằng nước
đến vạch.
3.8 Dung dịch axit domoic chuẩn
Pha chính xác
axit domoic chuẩn (độ tinh khiết 98 %) thành các dung dịch chuẩn có nồng độ từ
0,1 mg/ml đến 10 mg/ml bằng hỗn hợp axetonitril (3.1) và nước theo tỷ lệ
thể tích 1:10.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4. Thiết
bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của
phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Bình định mức, dung tích 500 ml và 1 000 ml.
4.3 Cốc thuỷ tinh, dung tích 500 ml.
4.4 Ống đong, dung tích 2 ml và 250 ml.
4.5 Giấy đo pH hoặc dụng cụ đo pH
4.6 Rây, cỡ số 5.
4.7 Máy nghiền tốc độ cao, 10 000 r/min.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.9 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min.
4.10 Màng lọc mao quản, cỡ lỗ 0,45 mm.
4.11 Cột trao đổi anion SAX, dung tích 3 ml, chứa khoảng 500 mg
hạt silicagel đã được hoạt hoá với silan amoni bậc 4, LC-8.
4.12 Hệ thống HPLC, được trang bị detector UV.
4.13 Cột sắc ký loại RP C18, dài 25 cm, đường kính trong 4,6 mm, có chứa hạt silicagel
đường kính từ 5 mm đến 10 mm.
5. Cách tiến hành
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Rửa sạch vỏ của nhuyễn thể trước khi
mở để lấy thịt. Rửa nhanh thịt nhuyễn thể trong nước để loại bỏ cát sạn và các
tạp chất khác. Cần tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể.
5.1.2 Cân khoảng 150 g thịt nhuyễn thể và
cho lên rây cỡ số 5 (4.6), để yên trong 5 min để loại bỏ hết nước. Sau đó, mẫu
được nghiền trong máy nghiền tốc độ cao (4.7) cho đến khi đồng nhất.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.1 Phương pháp tách chiết độc tố
ASP cùng với độc tố gây liệt cơ (PSP)
5.2.1.1 Cân khoảng
100,0 g mẫu thịt nhuyễn thể đã được đồng nhất (xem 5.1.2), chính xác đến 0,1 mg, cho vào một cốc dung tích 500
ml (4.3). Thêm 100 ml dung dịch axit clohydric nồng độ 0,1 M (3.3) rồi khuấy
đều. Kiểm tra độ pH bằng giấy đo pH hoặc dụng cụ đo pH (4.5). Độ pH của hỗn hợp
phải nhỏ hơn 4, tốt nhất là bằng 3. Điều chỉnh pH nếu cần thiết.
CHÚ THÍCH Điều chỉnh độ pH của hỗn hợp như
sau:
- giảm độ pH bằng cách thêm từng giọt dung dịch axit clohydric
5 M (3.3) rồi khuấy đều.
- tăng độ pH bằng cách cho thêm từng giọt dung dịch natri
hydroxit 0,1 M (3.4). Khi thêm natri hydroxit, phải khuấy mạnh và liên tục để
tránh hiện tượng kiềm hoá cục bộ.
5.2.1.2 Đun sôi hỗn hợp thu được trong 5
min, sau đó để nguội đến nhiệt độ trong phòng. Kiểm tra lại độ pH của hỗn hợp
và điều chỉnh độ pH đến khoảng từ 2 đến 4 (chú ý pH không được vượt quá 4,5).
5.2.1.3 Chuyển hỗn hợp sang ống đong dung
tích 250 ml (4.4) rồi thêm nước tới vạch 200 ml. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm
với tốc độ 3 000 r/min trong thời gian 10 min. Lọc lớp nước trong phía trên qua
màng lọc (4.10). Dịch lọc thu được dùng để phân tích trên thiết bị HPLC (4.12).
Quá trình chiết độc tố và phân tích
trên hệ thống HPLC phải được thực hiện trong vòng 24 h.
CHÚ THÍCH: Phương
pháp này đơn giản nhưng độ chính xác không cao, vì axit domoic đã bị phân hủy
một phần trong môi trường axit. Chỉ được sử dụng phương pháp này trong trường
hợp hàm lượng axit domoic trong mẫu nhỏ hơn hoặc bằng 5 mg/g. Khi hàm lượng axit domoic lớn hơn 5 mg/g, phải kiểm chứng lại bằng phương
pháp Quilliam (5.2.2).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.2.1 Cân khoảng 4,0 g mẫu thịt nhuyễn
thể đã được đồng nhất (xem 5.1.2) cho vào một ống ly tâm. Thêm 16,0 ml dung môi
chiết (3.5).
5.2.2.2 Đồng nhất hỗn
hợp bằng máy nghiền tốc độ cao (4.7) với tốc độ 10 000 r/min trong thời gian 3 min. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm
với tốc độ 3 000 r/min trong thời gian 10 min. Lọc lớp nước trong phía trên qua
màng lọc (4.10) để thu được dịch lọc.
5.2.2.3 Tinh chế dung dịch chiết
a) Điều kiện hoạt hoá cột trao đổi ion
Cho lần lượt 6,0 ml metanol (3.2),
3,0 ml nước và 3,0 ml dung môi chiết (3.5) qua cột trao đổi ion (4.11). Sau khi
điều kiện hoá cột, phải giữ mức dung môi trong cột cao hơn mặt trên của phần
nhồi cột.
b) Tinh sạch dịch chiết
Cho 5,0 ml dung dịch chiết đã qua
lọc (xem 5.2.2.2) chảy từ từ qua cột trao đổi ion đã được hoạt hoá (4.11) với
tốc độ chảy khoảng 1 giọt/s. Loại bỏ dịch qua cột.
Cho 5,0 ml hỗn hợp axetonitril (3.1)
và nước theo tỷ lệ thể tích 1:9 đi qua cột với tốc độ 1 giọt/s. Thêm 0,5 ml
dung dịch đệm xitrat (3.7) khi mức dung dịch rửa xuống gần bề mặt gel của cột.
Loại bỏ dịch qua cột.
c) Thu hồi độc tố
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chú ý không được để cột trao đổi ion
bị khô trong quá trình tinh chế dung dịch chiết.
5.3 Phân tích độc tố ASP
5.3.1 Điều kiện phân tích
- cột sắc ký HPLC (4.13);
- pha động chạy sắc ký (3.6);
- chế độ đẳng nhiệt ở 40 oC;
- tốc độ dòng trong khoảng từ 1,0 ml/min đến 1,5 ml/min;
- thể tích mỗi lần bơm là 20 ml;
- bước sóng cài đặt cho detector UV là 242 nm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bơm các dung
dịch axit domoic chuẩn nồng độ từ 0,1 mg/ml đến 10,0 mg/ml (3.8) vào
thiết bị HPLC và dựng đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ thu được của các dung
dịch axit domoic chuẩn. Khi đường chuẩn tuyến tính và đi qua gốc tọa độ thì khi
xác định hàm lượng độc tố ASP trên mẫu thử, chỉ sử dụng một dung dịch axit
domoic chuẩn có nồng độ gần với hàm lượng axit domoic tương đương có trong mẫu.
Đường chuẩn lúc này được xây dựng từ độ hấp thụ của dung dịch axit domoic chuẩn
sử dụng và gốc toạ độ.
5.3.3 Xác định độc tố ASP
Bơm các dịch
chiết thu được (xem 5.2.1.3 hoặc 5.2.2.3) vào thiết bị HPLC. Mỗi dịch chiết
được bơm 2 lần và xác
định độ hấp thụ trung bình cho mỗi dịch chiết.
Bơm các dung dịch axit domoic chuẩn vào thiết bị HPLC với tần
suất 2 h bơm 1 lần.
6. Tính kết quả
Hàm lượng độc tố ASP (tính theo axit
domoic) trong mẫu thử thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ, CASP, được
tính bằng microgam trên gam sản phẩm (mg/g)
theo công thức sau:
trong đó:
AS là độ hấp thụ trung bình của dung
dịch mẫu thử, tính theo diện tích pic;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CC là nồng độ của dung dịch axit
domoic chuẩn, tính bằng miligam trên mililit (mg/ml);
m là khối lượng của mẫu thử, tính
bằng gam (g);
F là hệ số pha loãng dịch chiết trước
khi bơm vào thiết bị HPLC.
7. Độ lặp lại và độ thu hồi
7.1 Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVs,
tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liên tiếp của cùng một dung dịch axit domoic
chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu
hồi, R, được xác định bằng cách đo 5 mẫu chuẩn đã biết chính xác hàm
lượng độc tố ASP. Độ thu hồi thu được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %,
độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.
8. Báo cáo thử nghiệm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a) mọi thông tin cần
thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã
sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử
dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không
được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất
kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu
được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] AOAC 959.08 Paralytic Shellfish
Poison. Biological Method.
[2] Intergovernmental
Oceanographic Commission, IOC Manuals & Guides No. 33, 1995, Manual on
Harmful Marine Microalga, p.113-134.