Natri glutamat
|
6,35 g
|
Lactoza
|
10,0 g
|
Natri focmat
|
0,25 g
|
L( -) Xistin
|
0,02 g
|
L( -) Axit aspactic
|
0,02 g
|
L( +) arginin
|
0,024 g
|
Thiamin
|
0,001 g
|
Axit nicotinic
|
0,001 g
|
Axit pantothenic
|
0,001 g
|
Magiê sunfat ngậm 7
phân tử nước (MgS04.7H2O)
|
0,100 g
|
Sắt (III) amoni xitrat 1)
|
0,010 g
|
Canxi clorua ngậm 2 phân tử nước (CaCl2.2H2O)
|
0,010 g
|
Dikali hidro phôtphat (K2HPO4)
|
0,90 g
|
Amoni clorua
|
2,5 g
|
Thạch
|
12 g -18 2)
|
Nước
|
1 000 ml
|
1) Hàm lượng sắt nhỏ
nhất là 15% (m/m).
|
|
2) Tùy vào sức đông của
thạch.
|
|
5.3.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan amoni clorua trong nước. Cho thêm các
thành phần còn lại vào và đun đến sôi.
Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng
pH phải là 6,7 ở 25°C.
Phân phối môi trường này theo các thể tích
100 ml vào các vật chứa thích hợp.
Khử trùng 10 phút ở 115 °C trong nồi hấp áp lực (6.1).
5.3.1.3. Chuẩn bị các đĩa thạch
Rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.12)
từ 12 ml đến 15 ml môi trường đã làm mát
đến khoảng 45 °C và để cho đông đặc lại. Các đĩa này có thể bảo quản từ 0 °C đến + 5 °C đến
4 ngày.
Ngay trước khi sử dụng, làm
khô các đĩa này trong tủ sấy hoặc trong lò (6.3) ở 50 °C trong 30 phút,
tốt nhất là mở nắp và lật
sấp đĩa để mặt thạch hướng xuống dưới, hoặc cho đến
khi các hạt nhỏ trên mặt của môi trường biến mất.
Chú thích - Thạch nên để đủ khô 15
phút trước khi ria cấy
(1 ml).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.3.2.1. Thành phần
Trypton
20,0 g
Muối mật
1,5 g
Thạch
từ 12 g đến
18 g (tùy vào sức đông
của thạch)
Nước
1 000 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa tan các thành phần trong nước và đun đến
sôi. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ở 25°C.
Phân phối môi trường theo các lượng đến 500
ml vào các vật chứa thích hợp. Khử trùng 15 phút ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1).
5.3.2.3. Chuẩn bị các
đĩa thạch
Rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.12)
từ 12 ml đến 15 ml
môi trường đã làm mát đến khoảng 45 °C và để cho đông đặc lại. Các đĩa này có
thể bảo quản từ 0 °C đến + 5 °C đến 4 ngày.
Ngay trước khi sử dụng, làm
khô các đĩa này trong tủ sấy hoặc trong lò (6.3) ở 50 °C trong 30 phút,
tốt nhất là mở nắp và lật sấp đĩa để mặt thạch hướng xuống dưới, hoặc cho đến
khi các hạt nhỏ trên mặt của môi trường biến mất.
5.3.3. Thuốc thử phát hiện
indol (thuốc thử Vracko và Sherris)
5.3.3.1. Thành phần
4-Dimetylanimobenzaldehyt
5,0 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
100 ml
5.3.3.2. Chuẩn bị
Hòa tan 4-Dimetylanimobenzaldehyt trong axit
clohidric, bằng cách đun
nóng khi cần thiết. Thuốc
thử này có thể bảo quản ở nơi tối từ 0 °C đến +5 °C tối đa là 3 tháng.
6. Thiết bị và dụng cụ
thủy tinh
Đối với các yêu cầu chung, xem TCVN
6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) và TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261). Dụng cụ thủy tinh
phải bền khi khử
trùng lại.
Sử dụng các thiết bị thí nghiệm vi sinh thông
thường và đặc biệt
là:
6.1. Nồi hấp áp lực, có thể duy
trì nhiệt độ ở 115°C ± 1 °C và 121 °C ± 1 °C.
Về chi tiết xem TCVN 6404 : 1998 (ISO
7218).
6.2. Tủ ấm, có thể duy
trì nhiệt độ ở 37°C ± 1 °C và ở 44°C ± 0,5°C.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.4. Tủ lạnh (để bảo quản
môi trường và thuốc thử đã chuẩn bị), có thể duy trì nhiệt độ từ 0°C đến 5°C.
6.5. Màng xelulo axetat, có cỡ lỗ từ 0,45 mm đến 1,2 mm và đường kính
85 mm.
6.6. Đèn tia cực tím (UV)
sóng dài, có
bước sóng từ
360 nm đến 366
nm, có gắn
với bộ lọc thích hợp để loại bỏ phóng
xạ UV dưới 310 nm.
6.7. Bộ kẹp đầu tù vô trùng, có chiều dài khoảng
12 cm.
6.8. pH-met, có độ chính
xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
6.9. Pipet, đã hiệu chuẩn
để dùng cho vi khuẩn học có dung tích danh định là 1 ml, được chia độ 0,1 ml và miệng có đường
kính từ
2
mm đến 3 mm.
6.10. Ống đong, để chuẩn bị
môi trường và thuốc thử.
6.11. Chai hoặc bình cầu, để khử trùng
và bảo quản môi trường nuôi cấy.
6.12. Đĩa Petri, làm bằng thủy tinh hoặc
plastic, có đường kính khoảng 90 mm hoặc 100 mm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7. Lấy mẫu
Điều quan trọng là phòng thí nghiệm phải
nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong
quá trình vận chuyển và bảo quản.
Lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn
này. Nên lấy mẫu theo phương pháp quy định trong
TCVN 6400 1998 (ISO 707).
8. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6263 :1997
(ISO 8261).
9. Cách tiến hành
Chú thích - Nếu cần kiểm tra độ
lặp lại có thỏa mãn hay
không (xem điều 11), tiến
hành hai phép xác định
riêng
rẽ theo 9.1 đến 9.5.
9.1. Phần mẫu thử, huyền
phù ban đầu và các dung dịch pha loãng
Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu
(dung dịch pha loãng đầu tiên) và các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo
TCVN 6263 :1997 (ISO 8261).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.2.1. Dùng bộ kẹp vô trùng (6.7) đặt màng
xelulo axetat lên mỗi
bề mặt đã khô của
hai đĩa có chứa thạch glutamat (5.3.1.3) 1 cách vô trùng, chú ý tránh tạo bọt
khí ở dưới màng. Dàn đều các màng một cách nhẹ nhàng bằng que gạt vô trùng
(6.13).
Dùng pipet vô trùng (6.9), lấy 1 ml mẫu
thử hoặc huyền phù ban đầu cho vào giữa
mỗi màng. Dùng que vô trùng (6.13), phết đều chất cấy lên khắp bề mặt của
màng, không để tràn khỏi màng.
9.2.2. Dùng một pipet vô trùng khác (6.9), cấy
các thể tích bằng nhau của các dung dịch mẫu thử pha loãng tiếp theo hoặc huyền
phù ban đầu lên các màng khác, như quy định trong 9.2.1.
9.2.3. Để các đĩa đã nuôi cấy trong tư thế nằm ngang ở nhiệt
độ phòng khoảng 15 phút cho đến khi chất cấy ngập vào trong thạch. Nuôi ấm các
đĩa này 4 h trong tủ ấm (6.2) để ở
37 °C với các màng/mặt thạch hướng lên trên.
9.3. Chuyển sang môi trường chọn lọc và nuôi ấm
9.3.1. Dùng bộ kẹp
vô trùng (6.7) chuyển các màng từ thạch glutamat (5.3.1.3) sang các đĩa thạch
trypton - mật (5.3.2.3).
Cảnh báo - Màng ẩm ướt sẽ dính chặt
vào mặt thạch. Tránh tạo bọt khí. Không sử dụng que gạt.
9.3.2. Nuôi ấm các đĩa này từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm
(6.2) để ở 44 °C với các màng/mặt thạch hướng lên trên. Không chồng các đĩa
cao quá ba chiếc.
9.4. Phát hiện tính sinh
indol do các khuẩn lạc trên màng lọc.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.4.2. Dùng pipet lấy 2 ml thuốc thử indol
(5.3.3) cho vào đĩa đã mở nắp đặt ở tư thế nằm ngang.
9.4.3. Dùng bộ kẹp vô trùng (6.7) lấy màng ra
khỏi mặt thạch tương ứng và
cho vào thuốc thử indol. Nếu cần, phải để nghiêng sao cho tất cả bề mặt của màng
được thuốc thử indol làm cho ướt. Sau 5 phút, dùng pipet loại bỏ thuốc thử
còn lại.
9.4.4. Các khuẩn lạc indol dương tính cho
màu hồng trong vài
phút. Nếu cần để ổn định,
đặt màng này dưới đèn tia cực tím (6.6)
trong 30 phút.
9.5. Đếm khuẩn lạc
Đếm các khuẩn lạc indol dương tính
(màu hồng) trên các
màng, tốt nhất là trên các màng có từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc màu hồng.
Các chi tiết về kỹ thuật đếm
khuẩn lạc xem TCVN 6264 :1997 (ISO 6610).
10. Tính toán và biểu
thị kết quả
10.1. Tính toán
Tính số CFU của E.Coli giả định,
N, trong một gam hoặc trong một mililit sản phẩm theo công thức sau :
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
trong đó
là tổng số khuẩn
lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại hai lần pha loãng liên tiếp;
n1: là số đĩa được
giữ lại của độ pha loãng thứ nhất;
n2 là số đĩa được
giữ lại của độ pha loãng thứ hai;
d là hệ số pha
loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
Chú thích
1) Hệ số pha loãng 10-2 nghĩa là 10-2 g hoặc 10-2 ml mẫu thử chưa pha loãng (ở
trạng thái lỏng) đã được lấy để thử.
2) Độ pha loãng thấp hơn là độ pha loãng
có nồng độ mẫu thử cao hơn.
10.2. Biểu thị kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Lấy kết quả là số đơn vị khuẩn lạc CFU
của E.Coli giả định trong 1 mililít (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong 1 gam (sản
phẩm dạng khác), biểu thị bằng một số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của
10.
10.2.2. Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử
(sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) có chứa ít hơn 10 khuẩn
lạc thì báo cáo kết quả như sau:
- ít hơn 10 CFU của E.Coli giả định trong một
mililít (sản phẩm lỏng)
- ít hơn 10 x 1/d CFU của E.Coli giả định trong một gam (sản
phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.
10.2.3. Nếu tất cả các đĩa đều
chứa nhiều hơn 300 khuẩn lạc, thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần
150 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất.
Báo cáo kết quả theo "số lượng đơn vị
hình thành khuẩn lạc E.Coli giả định ước
tính
trong
một
gam hoặc một mililít".
10.3. Thí dụ về cách tính
Việc đếm khuẩn lạc E.Coli giả định ở
44
°C
cho các kết quả sau :
- độ pha loãng thứ nhất (10-2) được giữ lại
chứa: 138 và 125 khuẩn lạc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Làm tròn kết quả như quy định trong
10.2.1 thu được 14 000 hoặc 1,4 x 104 CFU của E.Coli giả định trong
một gam hoặc trong một mililít sản phẩm.
11. Độ lặp lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được
từ hai lần thử riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng
nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thí nghiệm dùng
cùng thiết bị, trong một
khoảng thời gian ngắn, không được vượt quá 50% của kết quả thấp hơn.
Chú thích
1) Nếu các trường hợp không thỏa mãn
yêu cầu về độ lặp lại là 5%, hoặc
lớn hơn thì cần xem xét nguồn
gốc có khả năng gây ra sai lỗi.
2) Định nghĩa về độ lặp lại xem TCVN 4550 :1988 (ISO
5725).
12. Báo cáo kết quả
Ban báo cáo kết quả phải ghi rõ:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- phương pháp đã áp dụng;
- kết quả thử thu được; và
- nếu kiểm tra độ lặp lại, ghi kết quả cuối cùng
thu được.
Báo cáo kết quả cũng phải đề cập đến tất
cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi
tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.
Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả các
thông tin cần thiết về việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử.
Phụ
lục A
(tham khảo)
Thư mục
[1] TCVN 6400 :1998 (ISO 707) Sữa và sản
phẩm sữa. Các phương pháp lấy mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[3] ISO 5725-3 : 1994 Độ chính xác của các
phương pháp đo và kết quả. Phần 2 - Phương pháp cơ bản để xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương
pháp đo chuẩn.
[4] ISO 6391 Thịt và sản phẩm thịt - Định
lượng E.Coli -
Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 °C dùng màng lọc.