TIÊU
CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
5522:1991
ST SEV 5805-86
SẢN PHẨM THỰC PHẨM − PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH SỐ VI KHUẨN CHỦNG
Lactobacillus
Food
products −
Method
for enumeration of Lactobacillus bacteria
Lời nói đầu
TCVN 5522:1991 phù
hợp với ST SEV 5805-86;
TCVN 5522:1991 do Trung tâm Tiêu chuẩn Đo lường
Chất lượng khu vực I biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị,
Uỷ ban Khoa học Nhà nước (nay là Bộ Khoa học và Công nghệ) ban hành;
Tiêu chuẩn này được
chuyển đổi năm 2008 từ Tiêu chuẩn Việt Nam cùng số hiệu thành Tiêu chuẩn Quốc gia
theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm
a khoản 1 Điều 6 Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 của Chính phủ quy định
chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SẢN
PHẨM THỰC PHẨM − PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỐ VI KHUẨN CHỦNG LACTOBACILLUS
Food
products −
Method
for enumeration of Lactobacillus bacteria
1. Bản chất của phương
pháp
Phương pháp dựa trên
việc nuôi cấy một lượng sản phẩm nhất định hoặc mẫu pha loãng của nó trong môi
trường thạch thường hoặc môi trường dinh dưỡng lỏng, nuôi dưỡng các mẫu cấy này
ở 30 0C ± 1 0C trong 5 ngày hoặc ở
37 0C ± 1 0C trong 3 ngày, đếm
các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng chúng trong 1 g (cm3) trong môi trường chọn
lọc rắn hoặc đếm số có xác suất cao nhất của chúng trong môi trường lỏng.
2. Lấy mẫu
2.1. Mẫu để phân tích được
lấy và chuẩn bị theo TCVN 4887:1989 (ST SEV 3014-81) và TCVN 5525:1991 (ST SEV
3015-81).
2.2. Khối lượng (thể tích)
mẫu cân dùng để chuẩn bị mẫu pha loãng ban đầu phải lấy không ít hơn 10,0 g (cm3) ± 0,1 g (cm3), còn để cấy trực
tiếp trong môi trường dinh dưỡng, không ít hơn 1 g (cm3).
3 Dụng cụ, thiết bị
Các dụng cụ và thiết bị
qui định trong TCVN 4887:1989 (ST SEV 3014-81) được sử dụng để phân tích, ngoài
ra thêm:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
− Tủ ấm, đảm bảo giữ
nhiệt ở 30 oC ± 1 oC và 37 oC ± 1 oC;
− Tủ cấy kỵ khí;
− Bơm chân không;
− Hộp cấy vi sinh có
đường kính trong 90 mm ± 2 mm hoặc 100 mm ± 2 mm;
− Pipet dung tích 1
ml và 10 ml;
− Kính hiển vi;
− Phiến kính thủy
tinh;
− Giá để ống nghiệm;
− Que cấy vi sinh.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
− Pepton.
− Tripton.
− Dịch chiết nấm men.
− D-glucoza.
− Tvin-80.
− Natri axetat.
− Amoni xitrat.
− Triamoni xitrat.
− Axit axetic băng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
− Dikali hydro
phosphat (K2 HPO4).
− Magie sulfat (MgSO4.7H2O).
− Mangan sulfat (MnSO4.2H2O).
− Mangan sulfat (MnSO4.4H2O).
− Sắt sulfat (FeSO4.7H2O).
− Natri clorua
(NaCl).
− Thạch dùng cho vi sinh.
− Các dung dịch để
nhuộm màu theo Gram, theo TCVN 5449:1991 (ST SEV 3833-82).
− Hydro peroxit (H2O2) dung dịch 3 %.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
− Dung dịch
muối-pepton theo TCVN 4887:1989 (ST SEV 3014-81).
− Axit socbic, dung
dịch kiềm, chuẩn bị như sau:
Hòa tan 1,0 g axit socbic
trong 100 ml dung dịch natri hydroxit 1 N. Dung dịch nhận được được tiệt trùng
bằng phương pháp lọc theo TCVN 4887:1989 (ST SEV 3014-81).
− Môi trường Rogoz lỏng,
chuẩn bị như sau: cho vào bình định mức dung tích 1 l: 10,0 g tripton; 5,0 g
dịch chiết nấm men; 20,0 g D-glucoza; 1,0 ml tvin-80; 6,0 g kali dihydro phosphat;
2,0 g amoni xitrat; 25,0 g natri axetat; 1,32 ml axit axetat băng; 0,575 g
magie sulfat; 0,12 g mangan sulfat (MnSO4.2H2O); 0,034 g sắt sulfat, thêm nước cất đến
vạch định mức. Hòa tan các chất bằng cách đun trên bếp cách thủy tinh và điều
chỉnh sao cho sau khi tiệt trùng pH của dung dịch đạt 5,4 ± 0,1 ở 25 oC. Rót môi trường vào
các ống nghiệm đã tiệt trùng theo từng lượng 10 ml và tiệt trùng trong nồi hấp
ở 121 oC ± 1 oC trong 15 min. Các
ống nghiệm đựng môi trường được bảo quản ở 4 oC ± 1 oC, không quá 30 ngày.
− Môi trường thạch
Rogoz: chuẩn bị như môi trường Rogoz lỏng và thêm từ 15 g đến 18 g thạch. Sau
khi hòa tan các thành phần, rót môi trường vào các bình đã tiệt trùng và tiệt
trùng trong nồi hấp ở 121 oC ±
1 oC trong 15 min. Môi trường
đã chuẩn bị được bảo quản ở 4 oC ± 1 oC không quá 30 ngày.
− Môi trường MRS
lỏng, chuẩn bị như sau: cho vào bình định mức dung tích 1 l: 10,0 g pepton; 4,0
g chất dịch chiết nấm men; 20,0 g glucoza; 8,0 g nước thịt; 1,0 cm3 tvin-80; 2,0 g kali
dihydro phosphat; 5,0 g natri axetat; 2,0 g triamoni xitrat; 0,2 g magie sulfat;
0,05 g mangan sulfat (MnSO4.4H2O), thêm nước cất đến vạch định mức, hòa tan các chất
bằng cách đun nhẹ trên bếp cách thủy và điều chỉnh sao cho sau khi tiệt trùng
pH của dung dịch là 6,2 ± 0,1 ở 25 oC. Rót từng lượng 10 ml môi trường vào các ống
nghiệm đã được tiệt trùng và tiệt trùng trong nồi hấp ở 121 oC ± 1 oC trong 15 min. Các
ống nghiệm đựng môi trường dinh dưỡng được bảo quản ở 4 oC ± 1 oC không quá 30 ngày.
− Môi trường thạch
MRS: chuẩn bị như môi trường MRS lỏng, có thêm từ 15 g đến 18 g thạch. Sau khi
hòa tan các thành phần, rót môi trường vào các bình đã được tiệt trùng và tiệt
trùng trong nồi hấp ở 121 oC
± 1 oC trong 15 min. Bảo
quản môi trường đã chuẩn bị ở 4 oC ± 1 oC không quá 30 ngày.
Khi cần thiết, để
tăng tính chọn lọc, sau khi tiệt trùng cho thêm 1 ml dung dịch kiềm của axit socbic
vào 1000 ml môi trường thạch hoặc lỏng.
5 Tiến hành phân tích
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.1.1 Từ mẫu được lấy theo
Điều 2 chuẩn bị mẫu ban đầu và dãy mẫu pha loãng 10 lần để có thể xác định số
lượng vi khuẩn chủng Lactobacillus dự đoán trước trong 1,0 g (ml) sản
phẩm xét nghiệm.
5.1.2 Từ mẫu hoặc các mẫu
đã được pha loãng tương ứng cấy từng lượng 1,0 ml song song vào 2 hộp petri; rót
13 cm3 ± 2 cm3 môi trường thạch nóng
chảy đã làm nguội đến 45 oC
± 1 oC vào mẫu trên. Nhanh chóng
khuấy kĩ các chất chứa trong hộp và để cho thạch đông lại.
5.1.3 Mẫu cấy được ủ trong
điều kiện hạn chế thâm nhập oxy ở 30 oC ± 1 oC trong 5 ngày hoặc ở 37 oC ± 1 oC trong 3 ngày.
Việc hạn chế thâm
nhập oxy được thực hiện theo một trong các cách sau đây:
5.1.3.1 Rót lên môi trường dinh
dưỡng đã đóng rắn một lớp thứ hai, khoảng 5 ml; môi trường thạch nóng chảy đã
làm lạnh đến 45 oC ± 1 oC rồi để yên cho thạch
đông lại.
5.1.3.2 Đặt các hộp cấy vi
sinh vào tủ cấy kị khí, đóng tủ lại và dùng máy hút chân không tạo chân không từ
86,6 kPa đến 93,3 kPa.
5.1.3.3 Đặt các hộp cấy vi
sinh vào môi trường khí chứa 95 % khí nitơ và 5 % khí cacbonic.
5.1.3.4 Khi không có sự thống
nhất trong việc đánh giá chất lượng sản phẩm thì việc nuôi cấy được tiến hành
trong môi trường khí theo 5.1.3.3.
5.2 Xác định số vi khuẩn
chủng Lactobacillus có xác suất lớn nhất trong môi trường lỏng Rogoz
hoặc MRS
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.2 Lấy 1,0 cm3 từ tất cả các mẫu pha
loãng cấy song song vào 3 ống nghiệm đã chứa sẵn 10 cm3 môi trường Rogoz hoặc
MRS. Việc hạn chế thâm nhập oxy được thực hiện bằng cách rót vào mỗi ống nghiệm
chứa môi trường một lượng paraphin lỏng đã tiệt trùng đủ để tạo thành lớp
paraphin dày khoảng 2 cm.
5.2.3 ủ các mẫu cấy cho đến
khi xuất hiện các dấu hiệu phát triển nhưng không quá 5 ngày ở 30 oC ± 1 oC và không quá 3 ngày ở
37 oC ± 1 oC.
5.2.4 Các ống nghiệm được
coi là dương tính nếu trong đó xuất hiện sự vẩn đục của môi trường.
5.2.5 Để khẳng định rằng
các vi sinh vật đã phát triển là thuộc chủng Lactobacillus, từ các ống
nghiệm dương tính tiến hành cấy chuyển sang môi trường dinh dưỡng thạch bằng que
cấy vi sinh sao cho có được sự phát triển của các khuẩn lạc biệt lập. Việc nuôi
cấy tiến hành theo 5.2.3.
5.3 Vi khuẩn chủng Lactobacillus
trên môi trường đông đặc tạo thành các khuẩn lạc không màu đường kính từ 1
mm đến 3 mm có hình dạng thấu kính hoặc hình sao. Để khẳng định các khuẩn lạc
trưởng thành là thuộc chủng Lactobacillus, tiến hành kiểm tra không ít
hơn 5 khuẩn lạc điển hình theo cách sau:
1. Nhuộm màu Gram theo
qui định hiện hành. Vi khuẩn chủng Lactobacillus là trực khuẩn Gram dương
tạo thành các chuỗi xích ngắn hoặc dài.
2. Thử trên catalaza
theo qui định hiện hành. Vi khuẩn chủng Lactobacillus là vi khuẩn
catalaza âm.
6 Đánh giá kết quả
phân tích
6.1 Kết quả được đánh giá
theo từng mẫu riêng biệt.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.3 Nếu trong 80 % trường
hợp, tức là không ít hơn 4 khuẩn lạc trong số 5 khuẩn lạc được khẳng định là
thuộc chủng Lactobacillus thì tất cả các khuẩn lạc đặc trưng phát triển trong
hộp thì coi là thuộc nhóm này.
Trong các trường hợp
còn lại, số vi khuẩn chủng Lactobacillus được xác định từ tỉ lệ phần
trăm của khuẩn lạc đã được khẳng định trên tổng số khuẩn lạc đặc trưng được lấy
để kiểm tra.
6.4 Khi cấy trong môi trường
Rogoz lỏng hoặc MRS lỏng, số vi khuẩn chủng Lactobacillus có xác suất
cao nhất được xác định theo số lượng các ống nghiệm có kết quả dương tính.
6.5 Kết quả được xử lí,
tính cho 1 g (cm3) sản phẩm và ghi lại
theo TCVN 5591:1991 (ST SEV 3015-81).