Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11135:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm - Phát hiện độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F

• Số hiệu: TCVN11135:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11135:2015

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F

Lời nói đầu

TCVN 11135:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2002.08 Detection of Botulinal Neurotoxins A, B, E, and F. Amplified ELISA System;

TCVN 11135:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

...

...

...

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện các độc tố thần kinh typ A, B, E và F do vi khuẩn Clostridium botulinum sinh ra (botulinal neurotoxin) khi nuôi cấy trong môi trường chất chiết nấm men glucose pepton trypton (TPGY) và môi trường canh thang thịt (CMM) nguyên chất.

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 9049:2012, Thực phẩm - Xác định Clostridium botulinum và độc tố của chúng bằng phương pháp vi sinh

3.  Nguyên tắc

Phương pháp này được dùng để phát hiện các độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F trong các môi trường nuôi cấy TPGY và CMM nguyên chất, sử dụng kỹ thuật ELISA (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn kết enzym). Các độc tố bị bắt giữ bởi các kháng thể immunoglobin G (IgG) được phủ trên các đĩa vi giếng (microtiter plate) và được phát hiện bằng cách sử dụng các IgG đã biotinyl hóa và các chất cộng hợp phosphatase kiềm streptavidin. Enzym gắn kết được quan sát bằng cách sử dụng cơ chất được khuếch đại.

4. Thuốc thử

...

...

...

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.2. Dung dịch đệm cacbonat-bicacbonat, 0,05 M, pH 9,6 ± 0,1

Hòa tan lượng chứa trong một viên nang bicacbonat (ví dụ: Cat.No.C-3041; Sigma, St. Louis, MO) trong 100 ml nước.

4.2. Dung dịch đệm casein, 1,0 %

Cho một túi bột muối đệm phosphat (PBS) (ví dụ: Sigma; Cat.No. P3813) vào 800 ml nước, 10 g casein không chứa vitamin (ví dụ: Research Organics, Cleveland, OH 44125-1083, www.resorg.com; Cat. No.1087C) và 3 ml dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 M (tương đương 4,0 g NaOH/100 ml nước).

Làm nóng đến khoảng 80 °C trong khi vẫn khuấy. Chỉnh đến pH 7,9 ± 0,1 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M; sau đó pha loãng đến 1 lít. Khử trùng ở 121 °C trong 20 min. pH cuối cùng phải là 7,6 ± 0,1.

4.3. Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 1 M.

4.4. Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F, ví dụ: Southeast Regional Laboratory, Atlanta, GA 30309-3998.

4.5. Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa, ví dụ: Atlanta, GA 30309-3998.

...

...

...

Cho lượng chứa trong một gói TBS, ví dụ: Sigma; Cat.No. T6664 hoặc loại tương tự vào 900 ml nước, chỉnh pH đến 7,5 ± 0,1 bằng axit clohydric 2 M, cho 0,05 ml Tween-20 (ví dụ: Curtin Matheson Inc., PO Box 1546, Houston, TX 77251-1546) hoặc tương đương và pha loãng đến 1 lít. Nồng độ cuối cùng của Tween là 0,005 %.

4.7. Chất cộng hợp (conjugate) phosphatase kiềm-ExtraVidin, ví dụ: Cat. No. E2636. Bảo quản dung dịch ở 4 °C.

4.8. Hệ cơ chất ELISA khuếch đại, gồm cơ chất và chất khuếch đại (ví dụ: Invitrogen Corp., PO Box 6482, Carlsbad, CA 92008, www.invitrogen.com; Cat. No. 19589-019).

4.9. Axit sulfuric (H₂SO₄), 0,3 M

Pha loãng axit sulfuric đậm đặc (96 % đến 98 %), bằng cách cho 1 ml axit này vào 59 ml nước.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1. Khay vi giếng hoặc đĩa 96 giếng.

5.2. Màng chất dẻo để bọc đĩa vi giếng.

...

...

...

5.4. Pipet dùng cho đĩa vi giếng, có thể phân phối được từ 0,2 μl đến 100 μl.

5.5. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 35 °C ± 2 °C.

5.6. Máy rửa đĩa vi giếng, có cài đặt chương trình.

5.7. Máy lắc đĩa vi giếng.

5.8. Máy đọc đĩa vi giếng, có các bộ lọc cỡ lỗ 490 nm và 630 nm.

5.9. Pipet dùng một lần, dung tích 1 ml, 5 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng là 0,01 ml, 0,1 ml và 0,1 ml.

5.10. Bể chứa pipet đa kênh.

6. Cách tiến hành

6.1. Yêu cầu về an toàn

...

...

...

6.2. Quy trình ELISA khuếch đại

Chuẩn bị 1 đĩa vi giếng (5.1), cho từng loại độc tố cần kiểm tra. Đánh dấu đĩa typ A, B, E hoặc F. Sử dụng micropipet (5.4) để hút các kháng độc tố gốc. Pha loãng kháng độc tố (4.4) với dung dịch đệm bicacbonat (4.2), trong các ống nghiệm thủy tinh theo quy định của nhà cung cấp. Chuyển các kháng độc tố pha loãng vào các kênh của bể chứa pipet đa kênh (5.10). Sử dụng pipet đa kênh 8 vị trí (5.3) hút 100 μl dung dịch pha loãng thích hợp của các kháng độc tố typ A, B, E hoặc F từ các kênh của bể chứa, phân phối vào từng giếng của mỗi đĩa vi giếng. Cần có bốn đĩa (mỗi đĩa cho một typ: A, B, E và F). Các đĩa được phủ bằng màng chất dẻo (5.2) và bảo quản ở 4 °C ± 2 °C qua đêm.

Lấy đĩa ra khỏi tủ bảo quản ở 4 °C ± 2 °C và rửa đĩa 5 lần trong TBS-T (4.6), thời gian giữa các lần rửa cách nhau 45 s ± 5 s. Sử dụng máy rửa đĩa (5.6) hoặc thiết bị cơ học khác. Không sử dụng chai dạng bóp để rửa. Cho dung dịch đệm casein (4.2) đầy đến miệng các giếng của mỗi đĩa (khoảng 300 μl) và để trong tủ ấm (5.5) từ 60 min đến 90 min ở 35 °C ± 2 °C. Không rửa đĩa khi lấy ra. Các đĩa vẫn phủ màng chất dẻo trong thời gian rã đông dịch cấy thử nghiệm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tháo tấm phủ, loại bỏ dung dịch đệm casein và cho mẫu thử đã rã đông và mẫu kiểm chứng vào từng cặp giếng (100 μl cho mỗi giếng). Khi thêm thuốc thử phải thực hiện từ bên trái đĩa sang bên phải của đĩa. Ủ các đĩa chứa các chất cấy độc tố và mẫu kiểm chứng trong 2 h ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C.

Ủ lặp lại các độc tố kiểm chứng đặc hiệu typ A, B, E và F đã biết trên các đĩa tương ứng. Ủ 100 μl dung dịch đệm casein trong các cặp giếng thay cho các chất cấy thử nghiệm hoặc kiểm chứng để kiểm chứng mẫu trắng. Chuẩn bị các thuốc thử kháng thể dán nhãn biotin typ A, B, E và F (4.5) như hướng dẫn kèm theo khoảng 15 min đến 30 min trước khi sử dụng và trong khi ủ các mẫu thử nghiệm. Pha loãng các kháng độc tố đã biotin hóa trong dung dịch đệm casein theo hướng dẫn đi kèm. Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch TBS-T như trên. Cho các kháng độc tố đã pha loãng typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa (100 μl cho mỗi giếng) vào các đĩa thích hợp tương ứng đã dán nhãn và ủ ấm khoảng 60 min ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C.

Rửa các đĩa 5 lần bằng dung dịch TBS-T như trên. Bổ sung 100 μl dung dịch chất cộng hợp phosphatase kiềm-ExtraVidin (4.7), (pha loãng 1 μl/10 ml dung dịch đệm casein) vào từng giếng và ủ trong 60 min ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C. Rửa đĩa 5 lần bằng TBS-T với lần cuối ngâm trong dung dịch đệm rửa (4.6) khoảng 10 min ± 2 min. Loại bỏ hết dung dịch đệm rửa bằng cách úp đĩa và vỗ nhẹ trên khăn giấy. Hoàn nguyên cơ chất GIBCO và các dung dịch khuếch đại bằng cách cho dung dịch chất pha loãng thích hợp vào chai đựng cơ chất đông khô và chất khuếch đại (4.8). Sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất sản phẩm này. Thêm 50 μl dung dịch cơ chất GIBCO và ủ khoảng 11 min đến 13 min ở 25 °C ± 2 °C trên máy lắc đĩa (5.7) (khoảng 100 r/min), sau đó thêm 50 μl dung dịch khuếch đại GIBCO và ủ 2 min đến 10 min mà không lắc.

6.3. Đọc đĩa

Cho dung dịch chất khuếch đại vào đĩa gần với máy đọc đĩa (4.8). Đọc độ hấp thụ ở 490 nm và 630 nm (bộ lọc chuẩn) khi các phép kiểm chứng dương tính đạt độ hấp thụ từ 0,8 đến 1,2 và các phép kiểm chứng âm tính được chấp nhận. Lấy độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm trừ đi độ hấp thụ ở bước sóng 630 nm. Dừng phân tích (cho hiện màu) bằng cách thêm 50 μl dung dịch axit sulfuric 0,3 M (4.9), có thể đọc độ hấp thụ sau đó (trong khoảng 2 h). Thuốc thử dừng phản ứng được cho vào ở thời gian bất kỳ (từ 2 min đến 12 min) sau khi thêm chất khuếch đại vào lúc các phép kiểm chứng dương tính cho độ hấp thụ khoảng 1,0 và các phép kiểm chứng âm tính là chấp nhận được (không quá 0,2 trên mức nền).

6.4. Giải thích kết quả

Phép thử dương tính là khi có giá trị độ hấp thụ > 0,2 trên giá trị độ hấp thụ quan sát được trong các giếng kiểm chứng âm tính. Có thể có phản ứng chéo giữa các mẫu độc tố. Nếu các đĩa không được rửa sạch hoàn toàn, thì có thể quan sát thấy hấp thụ nền cao hơn trong tất cả các giếng.

...

...

...

Các kết quả ELISA dương tính là giả định về độc tố C. botulinum và phải được khẳng định bằng phương pháp chuẩn quy định trong TCVN 9049:2012.

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) các kết quả thu được;

d) ngày kết thúc thử nghiệm;

e) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả.

...

...

...

(Tham Khảo)

KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM LIÊN PHÒNG

Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng về việc phát hiện các độc tố botulinum (≥ 1 MLD/ml) trong TPGY^a bằng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn

Typ độc tố

A

B

E

F

Mức độc tố^b)

...

...

...

Cao không có A

Thấp

Thấp không có A

Cao

Cao không có B

Thấp

Thấp không có B

Cao

Cao không có E

...

...

...

Thấp không có E

Cao

Cao không có F

Thấp

Thấp không có F

Số phòng thử nghiệm

10

10

10

...

...

...

10

10

10

10

10

10

10

10

10

...

...

...

9

9

Số phép thử

60

340

60

340

120

280

...

...

...

280

60

340

60

340

110

290

98

261

...

...

...

+ ELISA

60

16

60

6

119

20

103

9

...

...

...

22

59

11

101

83

91

26

+ AOAC^c)

60

...

...

...

60

0

120

0

120

0

60

0

60

...

...

...

110

0

98

0

Khi bình phương^d)

14,1

4,17

...

...

...

3,12

17,4

6,75

57,9

...

...

...

Độ nhạy, %

+ ELISA

100

100

99,2

...

...

...

98,3

98,3

91,8

87,5

...

...

...

100

100

100

100

100

...

...

...

100

100

100

Tỷ lệ âm tính giả trong tổng số các mẫu dương tính, %

+ ELISA

0

...

...

...

0

0,8

14,2

1,7

1,7

...

...

...

8,2

12,5

+ AOAC

0

0

...

...

...

0

0

0

0

...

...

...

Độ đặc hiệu, %

+ ELISA

95,3

98,5

92,9

...

...

...

96,8

94,5

97,3

71,4

90

...

...

...

100

100

100

100

...

...

...

100

100

100

Tỷ lệ dương tính giả trong tổng số các mẫu âm tính, %

+ ELISA

...

...

...

1,5

7,1

3,2

5,5

...

...

...

28,6

10

+ AOAC

0

0

...

...

...

0

0

0

0

0

...

...

...

0

Sự thống nhất giữa phương pháp ELISA và AOAC, %^e)

96

99

95

94

...

...

...

94

97

77

91

CHÚ THÍCH:

...

...

...

^b^) Kết quả cao là các mẫu chứa độc tố ở mức cao; Kết quả thấp là các mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không có B là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ E; Không có F là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ F.

^c) Kết quả dương tính giả định. Phương pháp AOAC đã được thực hiện chỉ trong phòng thử nghiệm nghiên cứu.

^d) Khi bình phương được xác định bởi McNemar là (la - bl - 1)^2/(a-b), trong đó: a là các phần mẫu thử (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm tính bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm tính bằng ELISA và dương tính bằng AOAC. Giá trị khi bình phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ < 0,05.

e) Tỷ lệ thống nhất phản ánh số lượng phép xác định tương đương giữa các phương pháp ELISA và AOAC.

Bảng A.2- Kết quả thử nghiệm liên phòng về việc phát hiện các độc tố botulinum (≥ 1 MLD/ml) trong CMM^a) bằng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn

Typ độc tố

A

B

E

...

...

...

Mức độc tố^b)

Cao

Cao không có A

Thấp

Thấp không có A

Cao

Cao không có B

Thấp

Thấp không có B

...

...

...

Cao không có E

Thấp

Thấp không có E

Cao

Cao không có F

Thấp

Thấp không có F

Số phòng thử nghiệm

10

...

...

...

10

10

10

10

10

10

10

10

10

...

...

...

10

10

9

9

Số phép thử

60

340

60

340

...

...

...

280

120

280

60

340

60

340

110

290

...

...

...

261

Các phép thử giả định dương tính

+ ELISA

55

8

58

0

119

22

...

...

...

17

45

1

46

11

60

33

52

24

...

...

...

50

0

50

0

120

0

120

0

30

...

...

...

30

0

50

0

44

0

Khi bình phương^d)

11,1

...

...

...

17,4

1,3

14,1

2,89

...

...

...

13,3

Độ nhạy, %

+ ELISA

100

100

...

...

...

91,7

75

76,7

54,5

...

...

...

+ AOAC

83,3

83,3

100

100

...

...

...

50

50

45,5

44,9

Tỷ lệ âm tính giả trong tổng số các mẫu dương tính, %

...

...

...

0

0

0,8

8,3

0

...

...

...

37

45,5

46,9

+ AOAC

16,7

...

...

...

0

0

50

50

...

...

...

55,1

Độ đặc hiệu, %

+ ELISA

97,6

100

...

...

...

92,1

93,9

99,7

96,7

88,6

...

...

...

90,8

+ AOAC

100

100

100

...

...

...

100

100

100

100

Tỷ lệ dương tính giả trong tổng số các mẫu âm tính, %

...

...

...

2,4

0

7,9

6,1

...

...

...

3,3

11,4

9,2

+ AOAC

0

...

...

...

0

0

0

0

0

...

...

...

0

0

Sự thống nhất giữa phương pháp ELISA và AOAC, %^e)

97

99

94

...

...

...

93

96

97

79

81

...

...

...

CHÚ THÍCH:

^a) CMM là canh thang thịt

^b^) Kết quả cao là các mẫu chứa độc tố ở mức cao; Kết quả thấp là các mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không có B là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ E; Không có F là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ F.

^c) Kết quả dương tính giả định. Phương pháp AOAC đã được thực hiện chỉ trong phòng thử nghiệm nghiên cứu.

^d) Khi bình phương được xác định bởi McNemar là (la - bl - 1)^2/(a-b), trong đó: a là các phần mẫu thử (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm tính bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm tính bằng ELISA và dương tính bằng AOAC. Giá trị khi bình phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ < 0,05.

e) Tỷ lệ thống nhất phản ánh số lượng phép xác định tương đương giữa các phương pháp ELISA và AOAC.