a) Mẫu dò chưa được lai
trong dung dịch
|
b) Mẫu dò đã được
lai tạo thành trong huỳnh quang nhận
|
CHÚ DẪN:
1 Cơ chất ADN
2 Phân tử nhận
3 Phân tử cho
Hình 2 - Nguyên
tắc của mẫu dò lai
3.11
Mẫu dò dạng kẹp tóc (molecular
beacon)
Mẫu dò huỳnh quang bao gồm ba phần khác nhau:
phần trung tâm bổ sung trình tự
acid nucleic đích, cộng với đầu 5’ và đầu 3’ là bổ sung, phân tử phát và phân tử dập tắt được
gắn vào hai đầu mút của mẫu dò.
CHÚ THÍCH: Nguyên lý của tín hiệu phân
tử được minh họa
ở Hình 3.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a) Mẫu dò dạng kẹp
tóc không lai trong dung dịch
b) Mẫu dò dạng kẹp
tóc tạo thành trong phân tử phát huỳnh quang
CHÚ DẪN:
1 Cơ chất ADN
2 Phân tử huỳnh quang (phân tử phát)
3 Phân tử dập tắt
Hình 3 - Nguyên
tắc của mẫu dò dạng kẹp tóc
3.12 Mẫu dò phát hiện
trình tự ADN vi sinh vật gây bệnh đặc hiệu (probe for
detection of a specitic pathogen DNA sequence)
Mẫu dò với một trình tự bổ sung vào ADN vi sinh
vật gây bệnh có phân tử phát ra tín hiệu với bước sóng xác định và được phát hiện
bằng hệ thống phát hiện quang học.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu dò với phân tử phát huỳnh quang được
thiết kế để xác nhận quá trình khuếch đại
CHÚ THÍCH 1: Mẫu dò phát ra
tín hiệu sẽ phân biệt được rõ với tín hiệu của mẫu dò được thiết kế cho việc
phát hiện vi sinh vật gây bệnh cụ
thể.
CHÚ THÍCH 2: Việc áp dụng nội
kiểm cần phải sử dụng một
thiết bị có thể phát hiện
được tín hiệu có bước sóng khác nhau.
3.14
Chuẩn tham chiếu (passive reference)
Các phân tử huỳnh quang có mặt trong hỗn
hợp phản ứng được dùng để chuẩn hóa tín hiệu
CHÚ THÍCH: Là khi các phân tử huỳnh quang bắt cặp với các trình
tự acid nucleic hoặc các phân tử khác không tham gia vào phản ứng.
3.15
Mức độ phát hiện huỳnh quang nền (baseline
fluorescence detection level)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Điểm mà phản ứng đạt được mức độ huỳnh
quang trên mức nền.
3.16
Huỳnh quang nền (background fluorescence)
Nền “background”
Mức độ huỳnh quang nội tại được tạo ra
từ thuốc thử và vật liệu phụ đang dùng.
3.17
Điểm cắt của chu kỳ ngưỡng (threshold
cycle crossing
point)
Điểm trên đường cong khuếch đại khi tín
hiệu huỳnh quang tăng lên cao hơn mức ban đầu hoặc cắt tại một ngưỡng đã xác định trước.
4 Nguyên tắc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phân tích real-time PCR nhìn chung bao
gồm:
a) Khuếch đại trình tự đích đặc hiệu bằng
PCR với sự có mặt của mẫu dò huỳnh quang
b) Gắn mẫu dò huỳnh quang
trong mỗi chu trình khuếch đại
c) Tạo ra tín hiệu huỳnh quang bằng sự
kích thích trong mỗi chu trình
d) Phát hiện tín hiệu huỳnh quang bằng
hệ thống phát hiện huỳnh quang
e) Phân tích số liệu
CHÚ THÍCH: Đối với mục đích
sàng lọc, có thể dùng tín hiệu
huỳnh quang từ cơ chất gắn với ADN sợi đôi.
4.2 Mẫu dò dùng cho
real-time PCR
4.2.1 Sử dụng mẫu dò thủy giải
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu dò này lai với trình tự acid nucleic đích.
Trong bước kéo dài, enzym polymerase có hoạt tính 5’-3’
exonuclease bám kết mẫu dò lai. Sau khi gắn kết, reporter sẽ tách ra khỏi quencher,
làm tăng cường độ huỳnh quang của reporter. Tín hiệu huỳnh quang tạo thành tỷ lệ thuận với
việc tạo thành sản phẩm PCR đặc
hiệu.
Đầu 3’ của mẫu dò cần đóng để tránh bị
kéo dài trong quá trình chạy PCR.
4.2.2 Sử dụng mẫu dò lai
Người ta dùng 2 mẫu dò lai có mặt
trong phản ứng PCR theo các oligonucleotide đặc hiệu thêm vào các mồi PCR. Mỗi mẫu
dò này chứa một phân tử huỳnh quang,
một làm phát huỳnh quang (donor) và một làm chất nhận huỳnh quang (acceptor)
lai với các trình tự axit nucleic đích. Sau khi lai, cả hai chất ở trong một
khoảng cách gần sao cho việc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xảy ra
trên bước sóng kích thích và chất nhận huỳnh quang phát hiện được tín hiệu. Tín
hiệu huỳnh quang tạo ra tỷ lệ thuận với sản phẩm PCR đặc hiệu.
Đầu 3’ của các mẫu dò cần đóng để
tránh bị kéo dài trong quá trình chạy PCR.
4.2.3 Sử dụng mẫu dò dạng kẹp
tóc
Mẫu dò dạng kẹp tóc là một oligonucleotide đặc
hiệu có mặt trong phản ứng PCR cùng với các cặp mồi PCR.
Khi các mẫu dò dạng kẹp tóc liên kết với
trình tự đích bổ sung tại nhiệt độ lai, chúng trải qua quá trình chuyển đổi thích nghi
làm tách ra xa.
Điều này dẫn đến quá trình lai-đích-mẫu dò dài hơn và ổn định hơn so
với thân. Sự phân tách reporter và quencher làm cho reporter phát tín hiệu (xem
Tài liệu tham khảo [3]). Tín hiệu huỳnh quang tạo ra tỷ lệ thuận với sản phẩm
PCR đặc hiệu.
5 Yêu cầu chung
trong phòng thử nghiệm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6 Thuốc thử và vật
liệu thử
6.1 Yêu cầu chung
Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng
các thuốc thử tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước
tinh khiết tương đương không có axit nucleic và nuclease thích hợp cho phân tích sinh học
phân tử.
Không sử dụng các thuốc thử, ví dụ các
thành phần của canh thang
tăng sinh, những chất này có thể ảnh hưởng đến việc phát hiện
tín hiệu huỳnh quang của máy.
Những yêu cầu cụ thể áp dụng cho từng
loại thuốc thử cụ thể
được nêu trong
6.2 đến 6.6.
6.2 ADN polymerase và chất đệm cho phản
ứng
6.2.1 ADN polymerase
Sử dụng polymerase chịu nhiệt (có thể có hoạt
tính phiên mã ngược) cho PCR. Enzym này nên được dùng theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
CHÚ THÍCH: Enzym này có thể là tự nhiên hoặc
là enzym tái tổ hợp về mặt di truyền, đã được tinh sạch.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mỗi ADN polymerase cần có những điều
kiện thực nghiệm khác nhau.
6.2.2 Chất đệm phản ứng
Chất đệm phản ứng phải
phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).
6.3 Deoxyribonucleotide
triphosphat (dNTP) dùng cho phản ứng PCR
Các dNTP được sử dụng phải phù hợp với
TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).
6.4 Mồi
Các cặp mồi được dùng phải phù hợp với
TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).
6.5 Mẫu dò huỳnh
quang dùng cho real-time PCR
Các oligonucleotide phải có chất lượng
phù hợp, được thiết kế để phát hiện trình tự có mặt trong sản phẩm PCR đặc hiệu.
Trình tự mẫu dò cần được bổ sung phù hợp với trình tự của ADN đích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hiệu quả khuếch đại của mẫu thử sẽ được
kiểm tra bằng đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung vào bình phản ứng như phần chiết
ADN của mẫu thử. Có thể dùng
cùng một cặp mồi để khuếch đại của
đoạn ADN kiểm chứng và khuếch đại của đích ADN (kiểm soát khuếch đại bên trong đồng đẳng)
hoặc một cặp mồi khác (kiểm soát khuếch đại bên trong không đồng đẳng). Hệ thống
đích và hệ thống kiểm soát khuếch đại bên trong cần có hiệu quả khuếch đại giống
nhau. Nồng độ đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung nên càng thấp càng tốt để có thể
phát hiện được hàm lượng chất ức chế nhỏ nhất và cho kết quả dương tính
tương tự. Ngoài ra, cần biết chắc rằng kiểm soát khuếch đại bên trong không ảnh
hưởng đến mức
phát hiện của đoạn gen đích. Những lý do sau làm giảm những tương tác không tốt
đến mức độ phát hiện
- Hiệu quả khuếch
đại của đối chứng khuếch đại bên trong đồng đẳng hơi thấp hơn ADN
đích;
- Nồng độ mồi đối
với kiểm soát khuếch đại bên trong không đồng đẳng được giảm.
Chất kiểm soát khuếch đại bên trong có thể
được đưa vào mẫu ở giai đoạn
đầu của phép phân tích và ở cùng thời gian hoạt động để kiểm soát quy trình
tách chiết.
6.7 Thuốc thử để
ngăn ngừa lây nhiễm chéo
Ngăn ngừa nhiễm chéo theo TCVN 7682
(ISO 20838).
7 Thiết bị, dụng cụ
7.1 Yêu cầu chung
Trang thiết bị phần cứng được dùng
theo TCVN 11134 (ISO 22174).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.2 Các thiết bị, dụng cụ cụ
thể
Ngoài các trang thiết bị của phòng thử
nghiệm và các thiết bị, dụng cụ nêu trong TCVN 11134 (ISO 22174), cần
sử dụng các thiết
bị cụ thể như sau:
7.2.1 Máy chu trình nhiệt, được trang
bị
a) nguồn năng lượng phù hợp để giải
phóng các phân tử huỳnh quang
b) hệ thống phát hiện thích hợp để
phát hiện tín hiệu huỳnh quang được sinh ra trong quá trình PCR
Việc sử dụng các kiểm chứng
bên trong cần phải có những thiết bị có thể phát hiện được những tín hiệu với
bước sóng khác nhau.
7.2.2 Bình phản ứng, nắp đậy phải
chịu được việc gia nhiệt lặp lại ở nhiệt độ 100 °C sau đó làm lạnh xuống
4 °C mà không ảnh
hưởng đến tín hiệu
huỳnh quang được tạo ra trong quá trình khuếch đại.
8 Mẫu phòng thử nghiệm
Chất chiết có chứa các axit nucleic
tách được từ nền mẫu thích hợp với phạm vi áp dụng phù hợp với mẫu
phòng thử nghiệm
với điều kiện đảm bảo không gây ức chế phản ứng PCR hay ảnh hưởng đến việc
phát ra tín hiệu huỳnh quang.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.1 Chuẩn bị mẫu
Việc tách chiết và/hoặc tinh sạch axit
nucleic của mẫu thử cần thực hiện theo các phương pháp thích hợp, ví dụ
ISO 20837.
Dung dịch axit nucleic được tạo ra cần
có đủ lượng axit nucleic đích cho phân tích định lượng và có thể phát hiện được
từ 1 đến 10 vi sinh vật đích hoặc đương lượng di truyền virus trong
mẫu thử. Phương pháp
làm giàu hoặc phương pháp cô đặc virus hoặc vi sinh vật đích dùng cho phương
pháp định lượng chỉ cần một lượng
nhỏ các đích
trong mẫu thử.
Dung dịch axit nucleic được tạo nên chứa
ít chất ức chế mà ảnh hưởng đến phản ứng PCR và
các chất này không ảnh hưởng đến sự phát ra của tín hiệu huỳnh quang
CHÚ THÍCH: Huỳnh quang thường được giữ
trong bình phản ứng tối màu cùng với một số chất phù hợp.
Phân tích định lượng cần
có quy trình chuẩn bị mẫu để đảm bảo đủ số lượng
axit nucleic của virus hoặc vi sinh vật đích có trong dung dịch axit nucleic được
tạo ra được sao chép cao.
9.2 Khuếch đại
9.2.1 Yêu cầu chung
Việc khuếch đại axit nucleic đặc hiệu
được thực hiện in vitro trong phòng thí nghiệm thông qua phản ứng chuỗi
trùng hợp ADN polymerase với sự có mặt của các cặp mồi, oligonucleotide, chất đệm
phản ứng và mẫu dò huỳnh quang trong chất đệm phản ứng xác định.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong
quá trình khuếch đại.
ARN có thể được phát hiện khi dùng kỹ
thuật real-time PCR nếu trình tự được chuyển thành trình tự ADN bổ sung bằng
phương pháp phiên mã ngược.
9.2.2 Các tham số của chu
trình
9.2.2.1 Mẫu dò thủy giải
Về cơ bản, quá trình khuếch đại
sử dụng chu trình 2 bước bao gồm bước biến tính, gắn mồi, bắt cặp với mẫu dò và bước kéo
dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp và kéo dài
9.2.2.2 Mẫu dò lai
Quá trình khuếch đại sử dụng chu trình
3 bước bao gồm bước biến tính, bắt cặp mồi và mẫu dò và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh
quang được tạo ra trong bước bắt cặp
9.2.2.3 Mẫu dò dạng kẹp
tóc
Về cơ bản, quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 3
bước bao gồm bước biến tính, gắn mồi và mẫu dò dạng kẹp tóc và bước kéo dài.
Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các mẫu kiểm chứng được nêu trong TCVN
11134:2015 (ISO 22174:2005).
Real-time PCR cho phép phát hiện cùng
một lúc tín hiệu huỳnh quang của vi sinh vật gây bệnh cụ thể và của mẫu kiểm
soát khuếch đại bên trong. Do đó, khi thực hiện phương pháp này cần có mẫu kiểm
soát khuếch đại bên trong.
9.4 Phân tích số liệu huỳnh quang
9.4.1 Đường khuếch đại
9.4.1.1 Yêu cầu chung
Trong quá trình khuếch đại, số sản phẩm PCR
phát hiện được
tăng lên. Việc tăng tín
hiệu huỳnh quang liên quan đến tăng các sản phẩm PCR. Điều này được hiển thị trên đường
cong khuếch đại (xem Hình 4).
Đường cong khuếch đại điển hình gồm ba
giai đoạn đặc trưng cho quy trình PCR.
CHÚ DẪN:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
v số lượng chu trình khuếch đại
1 Pha hàm số mũ
2 Pha tuyến tính
3 Pha ổn định
Hình 4 - Đường
khuếch đại
9.4.1.2 Pha 1: Pha hàm mũ
Pha hàm mũ có dải chu trình độ chụm
cao đặc trưng bởi hiệu quả
khuếch đại cao và không đổi. Trong pha hàm mũ, mối tương quan giữa sản phẩm PCR với nhiệt
độ ban đầu được thể hiện theo Công thức (1):
Nc = N (1 + η)v (1)
Trong đó:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
N là số phân tử đích ban đầu
η là hiệu quả của hệ thống
v là số chu trình khuếch đại.
9.4.1.3 Pha 2: Pha tuyến tính
Pha tuyến tính đặc trưng bởi mức độ ảnh
hưởng mà độ dốc của đường khuếch đại giảm đến độ ổn định. Ở thời điểm
này một hoặc nhiều thành phần giảm
xuống dưới nồng độ tới hạn và hiệu
quả khuếch đại bắt đầu giảm. Pha được gọi
là tuyến tính vì khuếch đại xấp xỉ cấp số cộng chứ không phải là cấp số nhân.
9.4.1.4 Pha 3: Pha ổn định
Ở giai đoạn này, việc khuếch đại PCR sẽ không
còn và tín hiệu huỳnh quang duy trì ở trạng thái ổn định (xem Tài liệu
tham khảo [4]).
9.4.2 Đánh giá dữ liệu huỳnh quang
Mẫu phân tích tạo ra đồ thị khuếch đại với
ít nhất pha 1 của đường cong khuếch đại điển hình. Đường cong khuếch đại của
các mẫu cắt ngang một ngưỡng xác định được thiết lập sau số chu trình nhất định.
Mẫu với tính hiệu huỳnh
quang trên ngưỡng được coi là dương tính.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.4.3.1 Yêu cầu chung
Phương pháp định lượng xác định tín hiệu
huỳnh quang tương ứng với số lượng trình tự axit nucleic đích được tạo ra trong pha khuếch
đại của phản ứng PCR. Phương pháp này được dùng để xác định lượng hoặc
axit nucleic đích ban đầu trong mẫu
Axit nucleic đích được định lượng dựa trên
đường chuẩn (stADNard curve)
Có thể dùng các phương pháp định lượng
khác nếu giá trị của chúng được xác định.
9.4.3.2 Phương pháp đường chuẩn dùng
cho định lượng
Có thể sử dụng gốc ADN hoặc
ARN đích tinh sạch và ổn định với nồng độ đã biết để chuẩn bị đường chuẩn
bằng một dãy pha loãng.
Hiệu quả khuếch đại của đường cong chuẩn và axit nucleic đích phải gần giống
nhau. ADN plasmid và ARN sao
chép in vitro được dùng phổ biến khi xây dựng đường chuẩn.
Nồng độ đích cần nằm trong dải đường chuẩn.
Có thể áp dụng một số điểm hiệu
chuẩn thích hợp
và lặp lại bao trùm dải định lượng [ví dụ: có ít nhất
bốn điểm với
hai điểm lặp lại (tổng của các giá trị 4x2) hoặc sáu điểm hiệu chuẩn
với một phép đo tại mỗi điểm (tổng
là sáu giá trị)].
10 Đánh giá và tài
liệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các kết quả PCR được liệt kê trong Bảng
2 của TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).
THƯ
MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] ISO 20837, Microbiology
of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction
(PCR) for the detection of food-borne pathogens -
Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật
trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi
polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về
chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính]
[2] Forster, T.
Intermolecular energy migration and fluorescence. Ann. Phys. 1948, 2, p.55-75
[3] Bustin, S.A.
Quantification of
mARN using real-time RT-PCR:
Trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 2002,29, p.23-39
[4] APPLIED
BIOSYSTEMS, ABI Prism® 7900HT Sequence Detection System use’s manual. Applied
Biosystems, Foster City, CA, 2001.