Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-6:2015 về Phụ gia thực phẩm - Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khuẩn

• Số hiệu: TCVN11039-6:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 11039-6:2015

PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 6: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Food additive - Microbiological analyses - Part 6: Detection and enumeration of staphylococcus aureus by colony count technique

Lời nói đầu

TCVN 11039-6:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo JECFA 2006, Combined compendium of food additive specifications, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and referenced in the food additive specifications;

TCVN 11039-6:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;

Bộ tiêu chuẩn TCVN 11039 Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm các phần sau:

- TCVN 11039-1:2015, Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa;

...

...

...

- TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát hiện và định lượng coliform và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp chuẩn);

- TCVN 11039-4:2015, Phần 4: Phát hiện và định lượng coliform và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp thông dụng);

- TCVN 11039-5:2015, Phần 5: Phát hiện Salmonella;

- TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc;

- TCVN 11039-7:2015, Phần 7: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN);

- TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men và nấm mốc.

PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 6: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Food additive - Microbiological analyses - Part 6: Detection and enumeration of Staphylococcus aureus by colony count technique

...

...

...

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

Phương pháp này thích hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa trên 100 tế bào S. aureus trên gam. Nếu nghi ngờ số lượng tế bào thấp hơn giới hạn nêu trên thì nên sử dụng phương pháp đếm số có xác suất lớn nhất theo TCVN 11039-7:2015.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 11039-7:2015, Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 7: Xác định Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus)

Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình trên bề mặt của môi trường cấy chọn lọc và cho phản ứng coagulase dương tính khi tiến hành thử nghiệm theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

...

...

...

4.1. Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc một lượng huyền phù ban đầu quy định. Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu.

4.2. Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35 °C và kiểm tra sau thời gian từ 18 h đến 24 h.

4.3. Tính số lượng Staphylococcus có phản ứng coagulase dương tính trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điển hình trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả cố ý nghĩa và được khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.

5. Môi trường cấy, dịch pha loãng và thuốc thử

5.1. Môi trường Baird-Parker (xem A.1).

5.2. Canh thang trypticase (tryptic) đậu tương (TSB), chứa natri clorua 10 % và natri pyruvat 1 % (xem A.2).

5.3. Thạch trypticase (trypton) đậu tương (TSA) (xem A.3).

5.4. Thạch toluidin xanh-axit deoxyribonucleic (ADN) (xem A.4).

5.5. Canh thang phenol đỏ cacbohydrat (xem A.5).

...

...

...

5.7. Dung dịch lysostaphin (xem A.6).

5.8. Dung dịch hydro peroxit, 3 % thể tích (xem A.7).

5.9. Dung dịch đệm muối phosphat, 0,02 M, chứa natri clorua 1 %.

5.10. Dầu parafin, vô trùng.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể là:

6.1. Buồng sấy, có dòng khí mỏng hoặc phòng được thông khí tốt, không có bụi và dự kiến mật độ vi sinh vật trong không khí ở khu vực làm việc không lớn hơn 15 khuẩn lạc trên mỗi đĩa sau 15 min phơi nhiễm.

6.2. Đĩa Petri, bằng chất dẻo (15 mm x 90 mm) hoặc thủy tinh (15 mm x 100 mm).

...

...

...

6.4. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 35 °C ± 1 °C.

6.5. Que cấy gạt, bằng thủy tinh, đường kính từ 3 mm đến 4 mm, dài từ 15 cm đến 20 cm, có một đầu được uốn cong một đoạn dài từ 45 mm đến 55 mm.

6.6. Thiết bị đếm khuẩn lạc, loại cơ học hoặc điện tử, có nguồn sáng thích hợp, đĩa lưới và bộ đếm.

6.7. Ống nghiệm vô trùng, kích thước 13 mm x 100 mm.

6.8. Nồi cách thủy, có thể đun đến sôi.

7. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

9. Cách tiến hành

9.1. Chuẩn bị dung dịch pha loãng

Trong các điều kiện vô trùng, chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân bằng cách chuyển 10 ml dung dịch mẫu thử đã pha loãng trước đó vào 90 ml dung dịch pha loãng (5.9), sử dụng các pipet (6.3) riêng cho từng nồng độ. Không làm mẫu nổi bọt. Lắc tất cả các dung dịch pha loãng 25 lần với biên độ 30 cm trong vòng 7 s.

9.2. Phân lập

Đối với mỗi dung dịch pha loãng để đổ đĩa, chuyển vô trùng 1 ml vào 3 đĩa thạch Baird-Parker (5.1), phân phối 1 ml dung dịch mẫu thử vào ba đĩa (ví dụ 0,4 ml, 0,3 ml và 0,3 ml). Sử dụng que cấy vô trùng (6.5) dàn đều dung dịch mẫu thử trên bề mặt thạch. Để yên đĩa trên mặt phẳng ngang cho đến khi mẫu hấp thụ hoàn toàn (Khoảng 10 min cho đĩa vừa khô). Nếu dung dịch mẫu thử không hấp thụ hoàn toàn thì đặt đĩa trong tủ ấm trong 1 h, nắp đĩa hướng lên trên. Sau đó, lật ngược các đĩa và ủ từ 45 h đến 48 h ở 35 °C trong tủ ấm (6.4). Lựa chọn các đĩa có từ 20 đến 200 khuẩn lạc S. aureus điển hình, trừ khi chỉ có các đĩa ở độ pha loãng thấp hơn (> khuẩn lạc) xuất hiện khuẩn lạc S. aureus điển hình. Các khuẩn lạc S. aureus có hình tròn, nhẵn, lồi, ẩm ướt, đường kính từ 2 mm đến 3 mm trên các đĩa mọc thưa, màu xám đến đen, bao quanh bởi một quầng đục và thường có một vòng trong bên ngoài; các khuẩn lạc keo dính như bơ hoặc gôm khi chạm kim cấy vào.

9.3. Định lượng

Đếm và ghi lại số khuẩn lạc. Nếu trên một đĩa có nhiều kiểu khuẩn lạc thì đếm và ghi lại số lượng của từng kiểu. Có thể sử dụng các đĩa của độ pha loãng thấp nhất chứa ít hơn 20 khuẩn lạc. Nếu các đĩa có nhiều hơn 200 khuẩn lạc, gồm các khuẩn lạc S. aureus điển hình và các khuẩn lạc điển hình không xuất hiện tại các độ pha loãng cao hơn thì sử dụng các đĩa này để đếm S. aureus nhưng không đếm các khuẩn lạc không điển hình. Chọn nhiều hơn một khuẩn lạc của mỗi kiểu đã đếm và thực hiện phép thử coagulase (9.4.1). Cộng tất cả khuẩn lạc có phản ứng coagulase dương tính trên ba đĩa của cùng độ pha loãng và nhân với hệ số pha loãng. Báo cáo kết quả theo số S. aureus trên một gam mẫu thử.

9.4. Nhận biết S. aureus

9.4.1. Phép thử coagulase

...

...

...

Phản ứng coagulase chỉ được coi là dương tính khi đông tụ hoàn toàn và khối đông tụ không di chuyển khi nghiêng hoặc úp ngược ống. Trong trường hợp đông tụ một phần, trước đây đánh giá là phản ứng coagulase dương tính 2+ và 3+, cần được phân tích tiếp (xem Tài liệu tham khảo [4]). Thử nghiệm đồng thời các chủng cấy đã biết là dương tính và âm tính với các chủng cấy nghi ngờ, chưa rõ về hoạt tính coagulase. Nhuộm Gram tất cả chủng cấy nghi ngờ và quan sát hình thể. Phép thử ngưng kết latex có thể thay thế cho phép thử coagulase nếu cần thử nhanh.

9.4.2. Các phản ứng sinh hóa nhận biết bổ sung

9.4.2.1. Phản ứng catalase

Nhỏ một giọt hydro peroxit 3 % (5.8) lên phiến kính sạch. Lấy một ít sinh khối nuôi cấy trong ống thạch nghiêng TSA nghiền đều vào giọt hydro peroxit 3 %. Nếu sinh bọt khí thì phản ứng catalase dương tính. Phản ứng tiến hành đồng thời với chủng cấy âm tính và dương tính.

9.4.2.2. Sử dụng glucose trong điều kiện kị khí

Cho vòng cấy đầy vào đáy ống canh thang phenol đỏ cacbohydrat chứa glucose (0,5 %) (5.5). Để cho chất cấy chạm đến đáy ống. Phủ bề mặt canh thang bằng lớp dầu parafin vô trùng (5.10) với chiều dày ít nhất 25 mm. Ủ 5 ngày ở 35 °C trong tủ ấm (6.4). Nếu chất chỉ thị đổi sang màu vàng trên toàn bộ ống thì có axit sinh ra trong điều kiện kị khí, nghĩa là có mặt S. aureus. Thực hiện phép thử kiểm chứng đồng thời (kiểm chứng chủng cấy dương tính, âm tính và môi trường).

9.4.2.3. Sử dụng ofmannitol trong điều kiện kị khí

Tiến hành theo 9.4.2.2, sử dụng mannitol làm cacbohydrat trong mỗi trường, S. aureus thường dương tính nhưng một số chủng âm tính. Thực hiện phép thử kiểm chứng đồng thời.

9.4.2.4. Nhạy cảm với lysostaphin

...

...

...

9.4.2.5. Sinh nuclease bền nhiệt

Khi phản ứng coagulase không cho kết quả rõ ràng thì cần thực hiện phép thử sinh nuclease bền nhiệt để quan sát sự đổi màu từ xanh lam sang hồng tươi. Đây không phải là phép thử thay thế cho phản ứng coagulase mà là phép thử bổ trợ, đặc biệt đối với các phản ứng dương tính 2+. Chuẩn bị các lam kính bằng cách dàn 3 ml thạch toluidin xanh-axit deoxyribonucleic (5.6) trên bề mặt lam kính. Khi thạch đông đặc thì khoan các giếng đường kính 2 mm (từ 10 đến 12 giếng trên mỗi lam kinh) trên bề mặt và loại bỏ các nút thạch. Nhỏ khoảng 0,01 ml huyền phù vi khuẩn đã gia nhiệt (đun sôi cách thủy 15 min) sử dụng cho phản ứng coagulase vào giếng trên mặt thạch. Ủ các lam kính trong tủ ấm 4 h ở 35 °C. Nếu xuất hiện quầng màu hồng tươi rộng ít nhất 1 mm bao quanh giếng thì phản ứng dương tính.

9.4.3. Các đặc tính

Một số đặc tính điển hình của hai loài Staphylococcus và các loài Micrococcus được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 - Các đặc tính điển hình của S. aureus, S. epidermidis và Micrococcus

Đặc tinh

S. aureus

S. epidermidis

Micrococcus

...

...

...

+

+

+

Sinh coagulase

+

-

-

Sinh thermonuclease

+

...

...

...

-

Nhạy cảm với lysostaphin

+

+

-

Sử dụng glucose trong điều kiện kị khí

+

+

-

...

...

...

+

-

-

(+) Hầu hết (≥ 90%) các chủng dương tính;

(-) Hầu hết (≥ 90%) các chủng âm tính.

10. Biểu thị kết quả

Kết quả định lượng theo 9.3 được báo cáo theo số S. aureus trên một gam mẫu thử.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường và thuốc thử

A.1. Môi trường Baird-Parker

...

...

...

A.1.1.1. Thành phần

Trypton

10 g

Chết chiết thịt bò

5 g

Chất chiết nấm men

1 g

Natri pyruvat

10 g

...

...

...

12 g

Liti clorua ngậm sáu phân tử nước (LiCl·6H₂O)

5 g

Thạch

20 g

Nước cất

1 lít

A.1.1.2. Chuẩn bị

Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,0 ± 0,2. Nếu cần sử dụng ngay thì duy trì môi trường đã tan chảy ở nhiệt độ từ 48 °C đến 50 °C trước khi bổ sung tăng sinh. Nếu không cần sử dụng ngay thì bảo quản môi trường đông đặc ở 4 °C ± 1 °C đến 1 tháng. Làm tan chảy môi trường trước khi sử dụng.

...

...

...

A.1.2.1. Thành phần

Kali telurit^1) (K₂TeO₃)

1,0 g

Nước cất

100 ml

^1) Chỉ sử dụng kali telurit sẵn có phù hợp đối với phép thử này (xem A.1.2.2).

A.1.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan hoàn toàn kali telurit trong nước bằng cách đun nóng rất nhẹ. Bột kali telurit phải dễ tan. Nếu có mặt chất không hòa tan màu trắng trong nước thì loại bỏ bột đó. Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm để khử trùng. Dung dịch có thể được bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ + 3 °C ± 2 °C. Loại bỏ dung dịch nếu có kết tủa màu trắng.

A.1.3. Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (nồng độ khoảng 20 % hoặc theo chỉ dẫn của nhà sản xuất).

...

...

...

A.1.4.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (A.1.1)

100 ml

Dung dịch kali telurit (A.1.2)

1,0 ml

Nhũ tương lòng đỏ trứng (A.1.3)

5,0 ml

A.1.4.2. Chuẩn bị

Làm tan chảy môi trường cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy đến khoảng 47 °C.

...

...

...

A.1.5. Chuẩn bị các đĩa thạch

Đổ một lượng thích hợp môi trường hoàn chỉnh (A.1.4) vào đĩa Petri vô trùng để thu được môi trường thạch dày khoảng 4 mm và để cho đặc lại.

Trước khi làm khô, các đĩa có thể được bảo quản đến 24 h ở nhiệt độ + 3 °C ± 2 °C.

CHÚ THÍCH: Đối với các đĩa sản xuất công nghiệp, cần tuân thủ các chỉ dẫn của nhà sản xuất về thời gian bảo quản.

Trước khi sử dụng, làm khô các đĩa, tốt nhất là mở nắp ra và úp bề mặt thạch xuống dưới, đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 °C đến 50 °C, cho đến khi các giọt nước biến mất trên bề mặt của môi trường.

A.2. Canh thang trypticase (tryptic) đậu tương chứa natri clorua 10 % và natri pyruvat 1 %

A.2.1. Thành phần

Trypticase hoặc tryptose

17 g

...

...

...

3 g

Natri clorua

100 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

2,5 g

Dextrose

2,5 g

Natri pyruvat

10 g

...

...

...

1 lít

A.2.2. Chuẩn bị

Chỉnh đến pH 7,3. Đun nhẹ nếu cần. Phân phối 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,3 ± 0,2. Bảo quản trong một tháng ở 4 °C ± 1 °C.

A.3. Thạch trypticase (tryptic) đậu tương

A.3.1. Thành phần

Trypticase pepton

15 g

Phyton pepton

5 g

...

...

...

5 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

A.3.2. Chuẩn bị

Gia nhiệt có khuấy để hòa tan thạch. Đun sôi 1 min. Phân phối vào các ống hoặc bình thích hợp. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,3 ± 0,2.

A.4. Thạch toluidin xanh-ADN

A.4.1. Thành phần

...

...

...

0,3 g

Thạch

10 g

Canxi clorua (dạng khan)

1,1 mg

Natri clorua

10 g

Toluidin xanh O

83 mg

...

...

...

6,1 g

Nước cất

1 lít

A.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan tris(hydroxymethyl)aminometan trong 1 lít nước cất. Chỉnh pH đến 9,0. Bổ sung các thành phần còn lại, trừ toluidin xanh O và đun đến sôi để hòa tan.

Hòa tan toluidin xanh O vào môi trường. Phân phối vào các bình nón có nút cao su. Nếu sử dụng ngay thì không cần khử trùng. Môi trường vô trùng bền ở nhiệt độ phòng trong 4 tháng.

A.5. Canh thang phenol đỏ cacbohydrat

A.5.1. Thành phần

Trypticase hoặc proteose pepton No. 3

...

...

...

Natri clorua

5 g

Chất chiết thịt bò (tùy chọn)

1 g

Phenol đỏ (7,2 ml dung dịch phenol đỏ 0,25 %)

0,018 g

Glucose

5 g

Nước cất

...

...

...

A.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan glucose vào canh thang cơ bản này. Phân phối các phần 2,5 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống lên men 6 mm x 50 mm đã lật ngược. Hấp áp lực 10 min ở 118 °C. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Cách khác, hòa tan các thành phần trên, trừ glucose, trong 800 ml nước cất có đun và thỉnh thoảng khuấy. Phân phối các phần 2,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống lên men đã lật ngược. Hấp áp lực 15 min ở 118 °C và để nguội. Hòa tan glucose trong 200 ml nước cất và khử trùng bằng cách cho dung dịch qua bộ lọc giữ vi khuẩn. Thêm vô trùng 0,5 ml dịch lọc vào mỗi ống canh thang đã khử trùng sau khi làm nguội đến 45 °C. Lắc nhẹ để trộn. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2.

A.6. Dung dịch lysostaphin

Hòa tan 2,5 mg lysostaphin trong dung dịch muối đệm phosphat 0,02 M chứa natri clorua 1 %.

A.7. Thuốc thử hydro peroxit

Dung dịch chứa khoảng 2,5 g đến 3,5 g hydro peroxit (H₂O₂) trong mỗi 100 ml. Dung dịch này có thể chứa các chất bảo quản thích hợp nhưng tổng nồng độ không quá 0,05 %.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:1999, With Amd. 1:2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch - Phần 1: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Baird-Parker

...

...

...

[3] AOAC 987.09, Staphylococcus aureus in Foods. Most Probable Number Method for Isolation and Enumeration

[4] Sperber, W.H. and Tatini, S.R. 1975. Interpretation of the tube coagulase test for identification of Staphylococcus aureus. Appl. Microbiol. 29:502-505