Trypton
|
5,0 g
|
Chất chiết nấm men
|
2,5 g
|
Dextrose
|
1,0 g
|
Thạch
|
15g
|
Nước
|
1 000 ml
|
4.4.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên trong nước. Có thể
đun nóng nước để hòa tan các
thành phần.
Thêm thạch và đun đến sôi, thỉnh thoảng khuấy cho đến khi
tan hết thạch.
Phân phối môi trường vào các ống hoặc bình thủy tinh
có dung tích
thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (5.1) ở 121 °C. Chỉnh pH sao cho
sau khi khử trùng, pH đạt 7,0 ± 0,2, nếu cần.
5 Thiết bị, dụng cụ
Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng
một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc
tính thích hợp.
Sử dụng các thiết bị của phòng thử
nghiệm vi sinh và cụ thể là:
5.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để
khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).
5.2 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 35 °C ± 1 °C.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.4 Pipet, có dung tích danh định 1 ml, 5 ml
và 10 ml, được chia vạch đến 0,1 ml.
5.5 pH mét, có độ chính
xác ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
5.6 Nhiệt kế, có thể đo với
khoảng nhiệt độ thích hợp.
5.7 Thiết bị cấy xoắn.
5.8 Lưới đếm (xem Hình 1)
Sử dụng cùng lưới đếm cho cả đĩa Petri
100 mm và đĩa Petri 150 mm. Sử dụng màn chắn
đối với đĩa 100 mm. Lưới đếm được chia thành tám phần hình quạt bằng nhau; mỗi
hình quạt được chia bởi bốn dây
cung đánh số 1, 2, 3 và 4 từ mép ngoài của
lưới đếm. Các đường kẻ bên trong các hình cung được
bổ sung để thuận tiện cho việc đếm. Hình vành khăn là vùng nằm giữa hai dây cung bên
trong hình quạt, số
lượng vùng đã
đếm
(ví dụ: 3) là số hình vành khăn được đếm bên trong một hình quạt. Thiết bị cấy
đĩa xoắn sẽ cấy mẫu lên đĩa
thạch theo cùng cách thức giữa các lần.
CHÚ THÍCH: Khi các khuẩn lạc được đếm bằng lưới, thể
tích mẫu sẽ lớn hơn vì đếm từ mép
ngoài về phía tâm đĩa.
![](00916095_files/image001.jpg)
Hình 1 - Lưới
đếm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.10 Cốc có mỏ loại
nhỏ dùng một lần, dung tích 5
ml.
5.11 Túi polyetylen, dùng để bảo
quản các đĩa đã chuẩn bị.
5.12 Xyranh, với đầu tip
Luer để chống tắc nghẽn kim.
6 Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải
là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận
chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu
chuẩn này. Xem
tiêu chuẩn cụ thể có
liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm
thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.
7 Chuẩn bị mẫu thử
Mẫu được trộn đều để thu được các phần mẫu thử
đồng nhất.
8 Cách tiến hành
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sử dụng bộ phân phối vô trùng tự động
khi chuẩn bị các đĩa thạch. Thể
tích thạch được phân phối vào các đĩa
cần giống nhau vì tỉ lệ nhiễm tạp
là thấp so với việc rót thạch thủ công trong phòng thử nghiệm. Khi dùng tủ cấy,
sử dụng bộ phân
phối tự động. Rót các lượng thạch giống nhau vào tất cả các đĩa sao cho thạch
có cùng độ dày, để đầu kim của thiết bị cấy xoắn duy trì góc tiếp xúc
như nhau. Các đĩa thạch phải bằng phẳng trong quá trình để nguội.
Trước khi đổ đĩa, nên sử dụng phương
pháp sau đây: dùng bộ phân phối tự động hoặc rót một lượng thạch cố định (khoảng
15 ml cho đĩa 100 mm; 50 ml cho đĩa 150 mm) đã khử trùng ở nhiệt độ từ 60 °C đến 70 °C vào từng đĩa
Petri (5.3). Để cho thạch đông đặc trên bề mặt phẳng và đặt các đĩa đã rót thành từng
chồng không nhiều
hơn 10 đĩa. Đặt các đĩa thạch đã đặc
vào các túi polyetylen (5.12), làm kín túi bằng nhiệt và úp ngược, ở nhiệt độ từ
0 °C đến 4,4 °C. Giữ các đĩa thạch đã
rót ở nhiệt độ
phòng trước khi cấy.
8.2 Quy
trình cấy
Sử dụng thiết bị cấy xoắn (5.7) cấy lên bề mặt
đĩa thạch đã chuẩn bị (8.1) để đếm vi sinh vật trong các dung dịch chứa từ 500 đến
500 000 vi sinh vật trên mililit. Trong dải đếm được quy định, không cần sử dụng các chai
pha loãng hoặc pipet và các thiết bị phụ trợ khác. Khoảng cách giữa các mẻ là tối thiểu và thời gian để
kiểm tra thiết bị là ít hơn 2 min. Thiết bị cấy giảm dần lượng mẫu theo đường
xoắn Acsimet lên bề mặt đĩa thạch. Thể tích mẫu của bất kì phần nào của đĩa đều biết
trước. Sau khi cấy, các khuẩn
lạc mọc dọc theo đường xoắn. Nếu các khuẩn lạc trên một phần của đĩa có khoảng
cách thích hợp so với phần khác thì đếm chúng trên lưới đếm (5.8) đã hiệu chuẩn
thể tích với diện tích của phần đĩa.
Kiểm tra hàng ngày góc nghiêng của đầu
tip và chỉnh lại nếu cần (sử dụng chân không để giữ nắp trên bề mặt
đầu tip; đầu típ ở vị trí đúng hướng nếu mặt phẳng của nắp song song
và cách bề mặt nền khoảng 1 mm). Cho chất lỏng di chuyển qua hệ thống bằng chân
không. Trước khi đưa mẫu vào, làm sạch đầu tip bằng cách tráng bằng
dung dịch natri hypoclorit (4.1)
trong 1 s, sau đó tráng tiếp bằng nước pha loãng vô trùng (4.3) trong 1 s. Thực hiện bước tráng giữa
các lần thực hiện mẫu để giảm thiểu nhiễm chéo. Sau khi tráng, đưa mẫu vào đầu
tip của ống teflon
bằng chân không, sử dụng van hai chiều. Khi ống teflon và xyranh
(5.13) đã chứa đầy mẫu thì đóng
van gắn với xyranh.
Đặt đĩa thạch lên mặt phẳng, đặt đầu tip lên bề mặt thạch và khởi động motor
của thiết bị cấy xoắn
(5.7). Trong quá trình cấy, ghi
nhãn các nắp đĩa Petri. Sau
khi cấy xong, nhấc
đầu cấy ra khỏi bề
mặt thạch và dừng
thiết
bị. Lấy đĩa thạch
đã cấy ra và đậy nắp. Di chuyển đầu cấy về vị trí khởi động. Tráng
hệ thống bằng hypoclorit (4.1) và nước, sử dụng chân không, sau đó đưa mẫu mới
vào. Lật ngược
các đĩa và đặt ngay đĩa vào tủ ấm (5.2) trong 48 h ± 3 h ở 35 °C ± 1 °C.
8.3 Kiểm
soát vô trùng
Kiểm soát sự vô trùng của thiết bị cấy đĩa xoắn
sau mỗi dãy mẫu, dùng nước pha loãng vô trùng (4.3) để đổ đĩa.
CHÚ Ý: Các đĩa thạch
rót sẵn không được nhiễm khuẩn bề mặt và giữ nhiệt độ của đĩa không thấp hơn nhiệt độ
phòng (nếu không, nước có thể tích tụ trên bề mặt thạch). Không được để đĩa quá
khô, biểu hiện qua bề mặt thạch
óng ánh hoặc có các nếp nhăn lớn. Đĩa thạch không được đọng các giọt nước trên bề mặt
hoặc các đĩa thạch có độ dày chênh lệch quá 2 mm, cũng không nên bảo quản đĩa thạch ở nhiệt độ từ
0 °C đến 4,4 °C quá một
tháng. Tốc độ dòng bị giảm qua ống cho thấy có sự tắc nghẽn hoặc
có vật cản trong hệ thống. Để làm hết tắc nghẽn, tháo van ra khỏi xyranh
(5.13), lắp xyranh bơm tay cố ống nối chứa nước và bơm áp suất vào. Dùng etanol
để tráng nhằm loại bỏ các chất bẩn bám trên thành của hệ thống. Hòa tan các chất bẩn còn sót
bằng axit cromic. Tráng kỹ bằng nước sau khi làm sạch,
8.4 Hiệu chuẩn
lưới đếm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
![](00916095_files/image002.gif)
Trong đó:
C1 là số khuẩn lạc
đếm được trong một diện tích lưới;
C2 là số đếm vi
sinh vật trên mililit.
VÍ DỤ: C1 = 31 + 30 (khuẩn lạc), C2 = 4,1 x 104 vi sinh vật/ml
![](00916095_files/image003.gif)
8.5 Kiểm tra
số đếm đĩa xoắn
Sau khi ủ, đặt đĩa xoắn vào giữa
lưới đếm bằng cách điều chỉnh giá đỡ. Chọn hình quạt bất kì và bắt đầu đếm các khuẩn
lạc từ mép ngoài của hình vành khăn
thứ nhất về phía
tâm, đến khi đếm được 20 khuẩn lạc. Kết thúc việc đếm khuẩn lạc còn lại trong hình vành khăn tại điểm đếm
đến khuẩn lạc thứ 20. Bất
kì khuẩn lạc mọc
không đều trong mẫu đều được kiểm
soát bằng cách đếm các hình
vành khăn tương ứng của hình quạt đối
diện và ghi lại kết quả.
9 Tính và biểu thị kết
quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
VÍ DỤ: Hai hình vành khăn của mỗi hình quạt đã đếm đối diện
nhau của đĩa tương ứng 31 và 30
khuẩn lạc. Thể
tích mẫu chứa trong các hình vành khăn sẫm màu là 0,0015 ml
Số vi sinh vật =
vi sinh vật/ml
Nếu 4 hình vành khăn của hình quạt
chứa ít hơn 20 đơn vị hình thành khuẩn
lạc (CFU) thì
đếm số CFU trên toàn bộ đĩa. Nếu số khuẩn lạc vượt quá 75 trong hình vành khăn thứ hai, thứ
ba hoặc thứ tư là hình vành khăn chứa khuẩn lạc thứ 20 thì số vi sinh vật ước
tính sẽ thấp vì lỗi trùng lặp do các khuẩn lạc chồng lên nhau. Trong trường
hợp này, đếm mỗi hình vành khăn gần kề theo chu vi trong tất cả 8 hình quạt,
đếm ít nhất 50 khuẩn lạc, ví dụ nếu 2 hình vành khăn đầu tiên của hình quạt chứa 19
khuẩn lạc và hình
vành khăn thứ ba chứa khuẩn lạc thứ 20 và thứ 76 (hoặc lớn hơn) thì đếm các khuẩn lạc
trong hình vành khăn thứ
nhất và thứ hai liền kề theo chu vi, tại tất cả 8 hình quạt. Tính thể
tích chứa trong các hình vành khăn đã đếm của các hình quạt và chia thành số
khuẩn lạc.
Khi có ít hơn 20 CFU đếm được trên
toàn bộ đĩa thì báo cáo kết quả là “ít hơn 500 số đếm khuẩn lạc ước tính trên mililit".
Nếu số khuẩn lạc đếm được lớn hơn 75 ở hình vành khăn thứ nhất của hình quạt thì báo
cáo kết quả là “lớn hơn
500 000 số đếm Khuẩn lạc ước tính trên
mililit”. Không đếm các đĩa xoắn phân bố khuẩn lạc không đều do lỗi phân phối. Báo cáo các
kết quả của các đĩa
này là “sự cố của phòng thử nghiệm”. Nếu khuẩn lạc mọc lan rộng trên toàn bộ đĩa thì bỏ đĩa này.
Nếu khuẩn lọc mọc
lan rộng trên một nửa diện tích đĩa thì chỉ đếm các khuẩn lạc phân bố tốt trên
diện tích không mọc lan rộng.
Tính số đếm khuẩn lạc trừ khi phát hiện
có mặt các chất ức chế trong mẫu, khuẩn lạc mọc lan rộng quá mức hoặc sự cố của
phòng thử nghiệm. Làm
tròn số đếm như trên.
Báo cáo các số đếm theo số đếm khuẩn lạc
hoặc số đếm khuẩn lạc ước
tính trên mililit.
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:
a) mọi thông tin
cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
c) phương pháp
thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
đ) mọi chi tiết thao tác không được
quy định trong tiêu
chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI
LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 4884:2005
(ISO 4833:2003) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng
vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ
C
[2] TCVN 4884-1:2015
(ISO 4833-1:2013) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh
vật - Phần 1: Đếm khuẩn lạc ở 30 °C bằng kỹ thuật
đổ đĩa
[3] TCVN 4884-2:2015
(ISO 4833-2:2013) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh
vật - Phần 2: Đếm khuẩn lạc ở 30 °C bằng kỹ thuật
cấy bề mặt