D-malat +
NAD+
|
D-MDH
|
pyruvat + CO2 + NADH + H+
|
D
|
Lượng NADH tạo thành (đo được bằng
sự tăng độ hấp thụ cực tím của dung dịch)
tương đương với
lượng
D-malat có mặt.
D-malat dehydrogenase không phải là
100 % đặc trưng cho axit D-malic. Chất này phản ứng với axit L-tartaric ở tốc độ thấp
hơn nhiều. Nếu cần phải phân tích axit D-malic khi có mặt axit tartaric với nồng
độ cao như trong rượu vang thì mẫu phải được xử lý trước để loại bỏ axit
tartaric.
5. Thuốc thử
5.1. Yêu cầu chung
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích
và nước đạt loại
3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).
CHÚ THÍCH: Có thể thực hiện phép
thử sử dụng
các thuốc thử đơn lẻ.
5.2. Bộ kit thử kết hợp, bộ kit thử
Boehringer Mannheim2) bao gồm:
5.2.1. Chai 1 gồm khoảng 30
ml dung dịch chứa chất đệm HEPES. (axit 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine
ethansulfonic), pH = 9,0 và các chất ổn định.
5.2.2. Chai 2 gồm khoảng
210 mg NAD khô lạnh;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.3. Canxi hydroxit.
5.4. Etanol khoảng 98 %.
5.5. Kali hydroxit.
6. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường
của phòng thử nghiệm và các thiết bị,
dụng cụ sau:
6.1. Pipet dùng để thử enzym, được chia độ
dọc theo thân, có đầu tip phân phối dài, không chia độ.
6.2. Pipet, có độ chính xác tương
đương với 6.1, ví dụ: pipet
mao quản dịch chuyển
dương.
6.3. Cuvet, bằng thạch anh, thủy
tinh hoặc chất dẻo, có chiều dài đường quang 10 mm và hấp thụ không
đáng kể ở bước sóng
334 nm, 340 nm hoặc 365 nm.
6.4. Máy đo quang phổ vạch, có đèn thủy
ngân và bộ lọc để đo ở bước sóng
365 nm hoặc 334 nm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.6. Bình định mức, dung tích 50 ml.
6.7. Bộ lọc màng, có cỡ lỗ
0,2 mm.
7. Cách tiến hành
7.1. Chuẩn bị mẫu thử
7.1.1. Chuẩn
bị mẫu thông thường
Thông thường các mẫu không cần xử lý
trước, tuy nhiên có thể cần pha loãng và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào
thể tích, các kết
quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu cô đặc, có thể cũng tiến
hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến tỷ trọng tương đối đã biết.
Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải được nêu rõ. Dựa vào lượng mẫu
đã cân và hệ số pha
loãng, các kết quả có thể cũng được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm
có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng
thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử.
Làm trong các mẫu đục chứa nồng độ axit D-malic
thấp bằng cách ly tâm trước hoặc lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,2 mm (6.7).
7.1.2. Chuẩn bị các mẫu thử chứa
các mức axit tartaric cao
Lấy 25 ml nước quả và trộn với 125
mg canxi hydroxit (5.3) và 5 ml etanol (5.4) (xấp xỉ 98 %) trong 2 min. Chỉnh pH của
dung dịch đến khoảng từ 7 đến 8 bằng dung dịch kali hydroxit (5.5), chuyển định
lượng vào bình định mức 50 ml (6.6)
và pha loãng đến vạch. Làm trong dung dịch (như trong 7.1.1) và sử dụng dung dịch
trong không màu trong phép phân tích bằng enzym.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.2.1. Yêu cầu chung
Tiến hành phép xác định trong khoảng
nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C hoặc nhiệt độ
không đổi trong khoảng từ 25 °C đến 37 °C để thu được các kết quả tương tự.
Độ hấp thụ tối đa của NADH là ở bước sóng 340
nm. Khi sử dụng máy đo phổ có bước sóng thay đổi (6.5) thì chỉ đo ở bước sóng có
độ hấp thụ tối đa.
Khi sử dụng máy đo quang phổ vạch có đèn bay hơi thủy ngân (6.4) thì đo ở
bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.
Không sử dụng pipet phân phối một vạch
để lấy dung dịch. Có thể dùng pipet tự động thích hợp để bổ sung các
dung dịch enzym, co-enzym và dung dịch đệm. Sử dụng pipet dùng cho phép thử
enzym (6.1) hoặc pipet tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu.
Nên dùng axit D-malic làm dung dịch
chuẩn trong phép thử này.
7.2.2. Dung dịch thử trắng
Dùng pipet lấy 1,00 ml chất
đệm HEPES (5.2.1), 0,10 ml dung dịch NAD (5.2.2), 1,80 ml nước cho vào
cuvet. Trộn và sau 6 min, đọc độ hấp thụ (A1mẫu trắng) so với
không khí (không có cuvet trong đường quang).
7.2.3. Dung dịch mẫu thử
Dùng pipet lấy 1,00 ml chất
đệm HEPES (5.2.1), 0,10 ml dung dịch NAD (5.2.2), 1,70 ml nước và 0,10 ml dung
dịch mẫu thử cho vào cuvet. Trộn và sau 6 min, đọc độ hấp thụ (A1mẫu thử) so với
không khí (không có cuvet trong đường quang).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khi bổ sung 0,05 ml dung dịch D-MDH
(5.2.3) vào từng dung dịch nêu trong 7.2.2 và 7.2.3 thì phản ứng bắt đầu xảy ra.
Trộn và đợi cho đến khi kết thúc phản ứng (khoảng 20 min) và đọc độ hấp thụ (A2) của dung dịch
so với không khí. Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 20 min thì cứ sau 5 min
tiếp tục đọc độ hấp thụ
cho đến khi độ hấp thụ tăng với tốc độ không đổi và ngoại suy ngược lại
kể từ khi thêm dung dịch D-MDH
enzym cuối cùng. (Quy trình này cho
phép có phản ứng phụ và
được gọi là phản ứng trượt nêu trong Phụ lục A).
8. Tính kết quả
Dựa vào phản ứng của phép
xác định, có tỷ lệ tuyến tính giữa lượng NADH tạo thành (có chênh lệch độ hấp thụ) và nồng
độ axit D-malic, được tính theo Công thức (1):
DA = (A2
- A1)mẫu thử - (A2 - A1)mẫu
trắng
(1)
Tính nồng độ chất trong dung dịch pha loãng
bằng cách đo độ hấp thụ theo định luật Beer-Lambert. Hàm lượng axit D-malic của mẫu
(tính bằng gam trên lít), tính được theo Công thức (2):
(2)
Trong đó:
M là khối lượng phân
tử của axit D-malic (134,09 gmol-1);
V là tổng thể tích của
dung dịch thử trong
cuvet, tính bằng mililit (ml);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
d là chiều dài đường quang của cuvet,
tính bằng centimet (cm);
e là hệ số tắt của NADH:
ở bước sóng 340 nm = 6,3 (l.mmol-1.cm-1)
ở bước sóng 365 nm = 3,4 (l.mmol-1.cm-1)
ở bước sóng 334 nm = 6,18 (l.mmol-1.cm-1)
Nếu sử dụng các thể tích nêu trong 7.2
thì axit
D-malic, tính bằng gam trên lít (g/l), theo Công thức (3):
(3)
Cần tính đến mọi hệ số
pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích trong phép tính cuối
cùng. Nếu sản phẩm đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì
phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó.
Báo cáo hàm lượng axit D-malic bằng
gam trên lít (g/l) đến một chữ số thập phân.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm
về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ
các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác
với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục B.
9.1. Độ lặp lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả
thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau,
do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một
khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại
r.
Độ lặp lại là: r = 2,03 +
0,044 x r(axit D-malic) mg/l
Trong đó:
r(axit D-malic) là hàm lượng
đo được
9.2. Độ tái lập
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả
thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau,
do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới
hạn tái lập R.
Độ tái lập là: R = 6,46 + 0,108
x r(axit D-malic) mg/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết
mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu);
- viện dẫn tiêu chuẩn này;
- ngày và phương pháp lấy mẫu
(nếu biết);
- ngày nhận mẫu;
- ngày thử nghiệm;
- kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;
- độ lặp lại của phương pháp đã được
đánh giá;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- mọi thao tác không quy định trong
tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng
đến kết quả thử nghiệm.
Phụ lục A
(Tham khảo)
Thông
tin về việc xử lý các phản ứng “trượt”
Phản ứng "trượt" là do phản ứng phụ của
enzym, khi có mặt của các
enzym khác trong nền mẫu, hoặc tác động tương hỗ của một hoặc nhiều thành phần
nền mẫu với đồng hệ số của phản ứng enzym.
Trong phản ứng thông thường độ
hấp thụ giữ
nguyên giá trị không đổi sau thời
gian chính phụ thuộc
vào tốc độ của
phản ứng của loại
enzym cụ thể, điển hình từ
10 min đến 20 min. Tuy nhiên, khi xuất hiện phản ứng phụ thì độ hấp
thụ không đạt đến giá trị ổn định nhưng tăng đều theo thời gian và quy trình này thường
được gọi là phản ứng
“trượt”.
Nếu có phản ứng phụ xảy
ra thì độ hấp thụ của dung dịch sẽ đo được ở khoảng cách đều nhau (2 min đến 5 min) sau
thời gian cần để dung dịch chuẩn đạt đến độ hấp thụ cuối cùng. Khi độ hấp thụ
tăng với tốc độ không đổi
thì lấy 5 số đọc
đến 6 số đọc và sau đó ngoại suy bằng
đồ thị hoặc phép toán học đối với độ hấp thụ của dung dịch có ở một điểm khi
enzym cuối dùng được thêm vào (T0). Sử dụng chênh lệch độ hấp thụ (Af - Ai) để tính nồng độ cơ
chất.
![](00914968_files/image003.jpg)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục B
(Tham khảo)
Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng
thử nghiệm
Các thông số sau đây thu được trong
phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:1986 (Đối với tài liệu liên quan
đến phương pháp, xem Thư mục tài liệu tham khảo). Phép thử do Hiệp hội Quả quốc tế,
Paris, Pháp tổ chức thực hiện.
Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm
1991
Số lượng các phòng thử nghiệm 24/18
Số lượng mẫu 3 có bổ sung axit
D-malic
Loại mẫu:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B nước táo;
C nước nho đỏ.
Bảng B.1 - Kết
quả của phép thử liên phòng thử nghiệm
Mẫu
A
B
C
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại
sau khi trừ ngoại lệ
19
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15
Số lượng phòng thử nghiệm
ngoại lệ
5
-
3
Số lượng các kết quả được chấp nhận
77
101
61
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
80,3
98,2
514,4
Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (mg/l)
1,62
2,64
8,75
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr)
[%]
2,0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,7
Giới hạn lặp lại (r) (mg/l)
4,5
7,5
24,8
Độ lệch chuẩn tái lập (sR)
(mg/l)
4,90
6,53
21,87
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6,1
6,8
4,3
Giới hạn tái lập (R)
(mg/l)
13,7
18,5
61,9
CHÚ THÍCH: Có mối
liên hệ tuyến tính giữa r,
R và hàm lượng r.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
THƯ MỤC TÀI
LIỆU THAM KHẢO
[1] D-Malic acid enzymatic method: Official
Journal of the European Communities, L 272, Volume 33, pages 106 - 108, puslished
3.10.90
[2] Determination of the D-malic acid
content: No. 64, 1994. In: The collected Analyses of the
International Federation of Fruit Juice
Producers.
Loose-leaf edition, as of 1996-Zug: Swiss Fruit Union.
[3] Methods of enzymatic food
analysis, Boehringer
Mannheim.
1) ISO 5725:1986. Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory test dùng
để thu được dữ liệu về
độ chụm. Tiêu chuẩn này đã hủy
và được thay bằng bộ tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm 6 phần) và đã được chấp nhận
thành bộ TCVN 6910 (ISO 5725).
2) Boehringer
Mannheim là ví dụ về
sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra tạo thuận lợi cho người
sử dụng tiêu chuẩn này và không
ấn định phải sử dụng
chúng.