TIÊU CHUẨN NGÀNH
28 TCN 199:2004
SALMONELLA TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH BẰNG KỸ THUẬT
POLYMERASE CHAIN REACTION
Salmonella in fishery products - Method for qualitative analysis
by Polymerase Chain Reaction
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định
phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật
Polymerase Chain Reaction (sau đây gọi tắt là PCR).
2. Tài liệu
tham khảo
- Rapid Identification of Salmonella
serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and
spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay. (CHENG
HSUN CHIU AND JONATHAN T.OU. - Journal of Clinical microbiology, p.2619-2622.
Oct. 1996).
- Specific detection of Salmonella
spp. by multiplex polymerase chain reaction. (JS. WAY, KL. JOSEPHSON, SD.
PILLAI, M. ABBASZADAGAN, CP. GERBA AND IL. PEPPER. - Appl. Environ. Microbiol.,
59 (5) : 1473 - 1479, 1993).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nordic commitees on food analysis
(NMKL) No 71, 5th ed., 1999, Salmonella - Detection in foods.
3. Giải thích
thuật ngữ
Trong Tiêu chuẩn này, các thuật ngữ
dưới đây được hiểu như sau :
3.1 Salmonella
Giống Salmonella là vi sinh
vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột enterobacteriaceae có hơn 2400 kiểu
huyết thanh. Salmonella là trực trùng Gram âm, kích thước khoảng
0,6 - 2,0 mm, hiếu khí, có thể di động, không tạo bào tử, sinh hơi lên men
dextrosa, sinh khí đihyđrosunfua.
Tất cả các khiểu huyết thanh Salmonella
đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong
thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này
nằm trong hệ thống gen SPI - 1 (Salmonella pathogenicity island) có mặt
trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori
đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen
luôn có mặt trong hệ thống gen inv.
3.2 Kỹ thuật PCR là kỹ thuật dùng để
khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự AND đích qua các chu kỳ gồm 3
bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym ADN
polymerase.
3.3 ADN đích (target ADN)
Trong kỹ thuật PCR, ADN đích được
hiểu là một đoạn ADN đặc trưng cho đối tượng cần phát hiện. Trong Tiêu chuẩn
này, ADN đích là một đoạn trong gen invA.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.5 Bắt cặp bổ sung là sự kết hợp
giữa hai mạch ADN hay một ADN mạch đơn với ARN có các trình tự bổ sung để tạo
nên một mạch kép.
3.6 ADN polymerase là enzym tổng hợp
nên mạch ADN mới từ một mạch khuôn. Phương pháp này sử dụng Taq ADN polymerase
là một ADN polymerase hoạt động ở nhiệt độ cao.
3.7 Mồi là một trình tự ADN hay ARN
ngắn bắt cặp với một mạch khuôn ADN có mang một đầu 3' - OH tự do giúp ADN
polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới.
4. Nguyên tắc
Phương pháp định tính này dựa vào
việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định
được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm
màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm. Nếu
trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại
có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không
có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm
khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.
5. Thiết bị,
dụng cụ, hoá chất và môi trường
5.1 Thiết bị, dụng cụ
5.1.1 Tủ ấm 37oC.
5.1.2 Máy luân nhiệt.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.1.4 Máy lắc ống nghiệm.
5.1.5 Thiết bị điện di ngang và bộ
nguồn điện di có điện thế hoạt động từ 80 đế 150 volt.
5.1.6 Hộp đèn soi UV có kính lọc
302mm.
5.1.7 Bộ chụp ảnh trên đèn UV.
5.1.8 Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5
ml chuyên dùng cho PCR.
5.2 Hoá chất, môi trường
5.2.1 Mồi
Gồm hai mồi invA1 và invA2
được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá
trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự
của hai mồi như sau :
invA1 : 5' -
TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3'
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích
được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE. Đệm TE có thành phần như sau : 10 mM
Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA.
5.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh
vật và các loại hoá chất khác
Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi
cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp
thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới
đây.
Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng
phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong trường hợp sử dụng các vật
liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và nước pha chế phải
đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh và sinh học phân tử.
5.2.2.1 Dung dịch đệm pepton
Pepton (C5H10O5):
10,0g
Natri clorua (NaCl): 5,0g
Đinatri hyđro phôt phat (Na2HPO4):
3,6 g
Kali đihyđro phôt phat (KH2PO4):
1,5g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hoà tan các thành phần trong nước
cất, đun tan, phân phối vào trong các bình chứa phù hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt
độ 121oC trong 15 phú. pH sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25oC.
5.2.2.2 Hỗn hợp dùng trong khuếch
đại PCR 1,1x
Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25
U/50 ml)
Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC):
75 mM
Sunphat amon (NH4)2
SO4: 20 nM
Tween 20: 0,01% (v/v)
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200
mM (mỗi loại)
Magiê clorua (MgCl2) 1,5
mM
Tất cả các thành phần trên được pha
chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong 1 tháng.
Có thể bảo quản ở nhiệt độ - 20oC trong 1 năm. Không nên rã đông và
tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể
ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có
kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong phương pháp này.
5.2.2.4 Agarose
Sử dụng trong kỹ thuật này là loại
dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ hơn 1000 bp.
5.2.2.5 Đệm điện di TAE 1x
Tris: 4,84 g
Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: 2 ml
Axit axetic băng: 1,14 ml
Nước cất cho đủ: 1000 ml
Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm
đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng với nước thành dung dịch 1x.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Glyxerol: 30 %
Xanh bromphenon: 0,25 %
Tris: 200 mM
Na2EDTA: 20 mM
Các thành phần trên được pha trong
nước cất, bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
5.2.2.7 Thuốc nhuộm AND: dung dịch
etyl bromua nồng độ 10 mg/ml
6. Phương
pháp tiến hành
6.1 Lấy mẫu
Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một
khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô
trùng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nhằm làm tăng số lượng Salmonella
trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn thương cũng được phục hồi và phát
triển. Giai đoạn này được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên
nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường
tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch
pepton đệm.
Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở
nhiệt độ 37,0oC ± 1,0oC trong khoảng 18 giờ ± 2 giờ.
6.3 Xử lý mẫu giải phóng ADN
Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh
khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để
giải phóng ADN. Cách xử lý như sau:
6.3.1 Lắc đều canh khuẩn tăng sinh.
Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000
vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối
bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại
bỏ phần nước.
6.3.2 Huyền phù sinh khối trong ống
với 0,5 ml nước cất vô trùng. Đun sôi cách thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền
dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ
tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành
phản ứng khuếch đại.
6.4 Khuếch đại
Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng
bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc
trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.
6.4.1 Chuẩn bị ống khuếch đại
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đối chứng dương: thay dịch khuôn ADN
mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết.
Đối chứng âm: thay dịch khuôn ADN
mẫu bằng nước cất vô trùng.
6.4.2 Chương trình khuếch đại
Các ống khuếch đại được đặt vào
trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau:
Duy trì nhiệt độ 95oC trong
5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu
kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95oC/60 giây; 54oC/45
giây và 72oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở
nhiệt độ 72oC trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20oC
cho đến khi điện di.
6.5 Điện di sản phẩm khuếch đại
6.5.1 Chuẩn bị gel điện di agarose
1%
Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x
được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng.
Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm
hoàn toàn trong đệm TAE.
6.5.2 Chuẩn bị dịch điện di
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.5.3 Điện di
Một giếng trong gel điện di được sử
dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã
chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế
100 vôn.
6.6 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm
khuếch đại
6.6.1 Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu
Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho
0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào trong khay chứa có miệng
rộng hơn bản gel điện di.
6.6.2 Nhuộm gel
Ngâm bản gel đã điện di vào dung
dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ
phần etyl bromua dư.
6.6.3 Quan sát, chụp hình
Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi
UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện
trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kết quả phân tích chỉ được xem xét
kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước
520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này.
Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella
khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính
khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác
hơn 520 bp.
8. Qui định
về đảm bảo an toàn
Trong quá trình tiến hành thao tác
phải thực hiện đúng các qui định sau đây:
8.1 Thuốc nhuộm etyl
bromua là một chất độc có thể gây ung thư cho người và động vật. Do đó, khi sử
dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ. Dung dịch sau khi sử dụng
phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.
8.2 Chỉ được bật đèn UV để quan sát
ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ.
8.3 Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên
quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu.
8.4 Phòng thí nghiệm phải được bố
trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau
khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.