|
BỘ Y TẾ
-----
|
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-------
|
|
Số: 3351/2001/QĐ-BYT
|
Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2001
|
QUYẾT
ĐỊNH
VỀ
VIỆC BAN HÀNH “THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG STREPTOCOCCUS FAECALIS TRONG THỰC
PHẨM”
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
Căn cứ theo Nghị định
số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn
và tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công
trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hóa;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ-TTg ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính
phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ trưởng Vụ
Pháp chế, Chánh thanh tra – Bộ Y tế và Cục trưởng cục Quản lý chất lượng vệ
sinh an toàn thực phẩm,
QUYẾT ĐỊNH
Điều
1.
Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật
định lượng Streptococcus faecalis trong thực phẩm”.
Điều
2.
Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.
Điều
3.
Các ông, bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng
các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế dự phòng – Bộ Y tế; Cục trưởng Cục
Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các Tỉnh, Thành
phố trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu
trách nhiệm thi hành Quyết định này.
|
|
KT.
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
THỨ TRƯỞNG
Lê
Văn Truyền
|
THƯỜNG
QUY KỸ THUẬT
ĐỊNH
LƯỢNG STREPTOCOCCUS FAECALIS TRONG THỰC PHẨM
(Ban hành kèm theo
Quyết định số 3351/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP
Streptococcus
faecalis (S. faecalis) (Liên cầu phân) phát triển được trong môi trường có
Natri azit 0,04% tạo thành các khuẩn lạc màu đỏ hoặc nâu đỏ. Lựa chọn khẩu lạc
điển hình, xác định tính chất sinh vật hóa học theo thường quy.
II. PHẠM VI ÁP DỤNG
Áp dụng cho việc phát
hiện ô nhiễm S.faecalis trong sản phẩm thực phẩm
III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ và thiết bị
chuyên dụng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.
2. Môi trường, thuốc
thử
- Canh thang natri
azit.
- Thạch TTC natri
azit (Thạch Slanetz và Bartley).
- Canh thang azit
etyl màu tía.
- Các môi trường hóa
chất thông dụng.
IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Chuẩn bị môi
trường
Môi trường nuôi cấy,
canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hóa học được điều chế theo
công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và
được hấp tiệt trùng (110OC/30 phút hoặc 121OC/15 phút).
(Phụ lục kèm theo)
2. Chuẩn bị mẫu và
dung dịch mẫu thử
2.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được
cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể
đồng nhất.
2.2. Chuẩn bị dung
dịch mẫu thử 10-1
- Cân hoặc hút chính
xác 50g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc 50ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón
chứa sẵn 450ml nước đệm muối 3%.
- Lắc đều 2 – 3 phút.
Thu được dung dịch mẫu thử 10-1
2.3. Chuẩn bị dung
dịch mẫu thử 10-2, 10-3, 10-4...
- Hút chính xác 50ml
dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang bình nón chứa sẵn 450ml nước đệm
muối 3%.
- Lắc đều trong 2 - 3
phút. Thu được dung dịch 10-2.
- Tiếp tục làm tương
tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4,
10-5... (theo sơ đồ)
3. Các bước xét
nghiệm
3.1. Xét nghiệm định
tính
a) Tăng sinh
Cho 10ml (Hoặc 50; 100
ml) dung dịch thực phẩm đồng nhất 1:10 vào bình canh thang natri azit đặc theo
tỷ lệ 1:1, ủ ẩm 37OC/72 giờ. S.faecalis phát triển làm đục
môi trường và chuyển màu môi trường từ tím sang vàng.
b) Hình thể và tính
chất bắt mầu
- Từ ống canh thang
có mọc vi khuẩn, cấy chuyển sang đĩa thạch TTC natri azit, ủ ấm 37OC/18-24
giờ. Khuẩn lạc S.faecalis điển hình: nhỏ, lồi, bờ đều, có màu đỏ hoặc
nâu đỏ.
- Trích biệt khẩu lạc
làm tiêu bản nhuộm Gram: Vi khuẩn hình cầu, xếp thành chuỗi, bắt mầu thuốc
nhuộm Gram, Gr (+).
3.2. Định lượng
a) Phương pháp MPN
- Cấy 50ml dung dịch
mẫu thử 10-1 vào bình 50ml canh thang Natri azit đặc.
- Cấy 5 ống, mỗi ống
10ml dùng dịch mẫu thử 10-1 vào ống 10ml cạnh thang Natri azit đặc.
-
Cấy 5 ống, mỗi ống 1ml dùng dịch mẫu thử 10-1 vào ống canh thang
Natri azit
-
Cấy 5 ống, mỗi ống 1ml dung dịch mẫu thử 10-2 vào ống canh thang
Natri azit.
- Tiếp tục như vậy
với dãy sau có đậm độ pha loãng thấp hơn 10 lần so với dẫy trước nếu đậm độ vi
khuẩn quá nhiều.
- Ủ ấm 370C,
trong 3 ngày (72 giờ). S.faecalis phát triển làm đục môi trường và
chuyển mầu môi trường từ đỏ tía sang vàng.
* Xác định hình thể
và tính chất bắt mầu.
- Đánh dấu các ống
dương tính, cấy chuyển sang ống canh thang azit etyl màu tía, ủ ở nhiệt độ
44-45OC/24 giờ hoặc sang đĩa thạch TTC natri azit, ủ ấm
370C/18-24 giờ.
- Trích biệt khuẩn
lạc điển hình làm tiêu bản nhuộm Gram
* Đọc kết quả:
- Nếu ở đáy ống xuất
hiện màu đỏ tía và môi trường trở nên đục thì kết luận dương tính.
- Tra bảng MPN ở nồng
độ tương ứng, tính số vi khuẩn/g
Ví dụ:
Nồng độ 10-1:
có 3 ống (+);
Nồng độ 10-2:
có 1 ống (+);
Nồng độ 10-3:
có 0 ống (+);
Tra bảng MPN, xác
định trong 1g mẫu thử có 43 con vi khuẩn
b) Phương pháp cấy
đếm trên đĩa thạch
* Cấy trên môi trường
đặc:
- Phương pháp này sử
dụng môi trường thạch TTC natri azit, tiến hành giống như cấy đếm tổng số vi
khuẩn hiếu khí.
- Ủ ấm 37OC/24
giờ.
- Khuẩn lạc điển
hình: Lồi, nhỏ, bờ đều, mặt nhẵn, màu đỏ hoặc nâu đỏ.
- Trích biệt khuẩn
lạc điển hình, nhuộm Gram để xác định hình thể và tính chất bắt mầu.
- Từ khuẩn lạc điển
hình, cấy chuyển sang canh thang azit etyl, ủ ấm 44 - 45OC/24 giờ. S.
faecalis phát triển làm đục đều môi trường và chuyển mầu môi trường sang
đỏ.
* Đọc kết quả
Số lượng S.faecalis
có trong 1g thực phẩm được biểu thị bằng trung bình cộng tổng số khuẩn lạc có
trên đĩa thạch ở cùng nồng độ pha loãng, nhân với hệ số pha loãng.
Ví dụ: Độ pha loãng 10-2:
- Đĩa thạch hoặc ống
nghiệm 1 có: 10 khuẩn lạc
- Đĩa thạch hoặc ống
nghiệm 2 có: 14 khuẩn lạc
- Số khuẩn lạc có
trong 1g thực phẩm được tính
|
X =
|
10 + 14
|
x 100 = 120
(khuẩn lạc)
|
|
2 x 10
|
Như vậy: trong 1g
thực phẩm có 1,2 ´ 102 vi
khuẩn S.faecalis
3. Phương pháp màng
lọc (dùng cho thực phẩm dạng lỏng có thể thấm qua màng lọc)
Lọc 100ml dùng dịch
thực phẩm, sau đó đặt màng lọc lên trên đĩa thạch TTC natri azit rồi tiến hành
như đếm trên đĩa.
Sơ
đồ định lượng S. faecalis
PHỤ
LỤC
MỘT
SỐ MÔI TRƯỜNG THƯỜNG DÙNG ĐỂ XÉT NGHIỆM S.faecalis
1. Canh thang Natri
azit
Pepton 20,0g
Đường glucoza 15,0g
Natri chlorua (NaCl) 5,0g
K2HPO4
2,7g
Natri azit 0,4g
Bromocresol màu tía 0,015g
Nước cất 1000ml
Cách pha:
- Cho tất cả (trừ
natri azit) vào nồi rồi đun cho tan, lọc, chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt
trùng là 7,2. Hấp 121OC/15 phút.
- Natri azit: Pha
trong nước cất cho tan (thường pha ở tỷ lệ 1%), lọc vô khuẩn, đóng vào bình tối
màu để bảo quản ở 4OC. Cho vào canh thang đã hấp và để nguội (khoảng
50OC) tùy theo thể tích để đạt nồng độ cuối cùng là 0,04%.
- Canh thang đặc cũng
được pha như trên nhưng tất cả các chất đều có khối lượng gấp đôi (trừ nước).
2. Thạch TTC Natri
azit (Thạch Slanetz & Bartley)
Pepton 20,0g
Cao nấm men 5,0g
Đường glucoza 2,0g
K2HPO4
4,0g
Natri azit 0,4g
Triphenyltetrazoiumchlorit
(TTC) 0,1g
Agar 15,0g
Nước cất 1000ml
pH 7,2
Cách pha
- Cho tất cả các chất
(trừ natri azit và TTC) vào nồi rồi đun sôi cho tan, lọc, chỉnh pH và hấp tiệt
trùng 121OC/15 phút. Để nguội khoảng 50OC. Cho dung dịch
natri azit và TTC vào để đạt nồng độ tương ứng là 0,04% và 0,01%.
- Pha TTC như pha
natri azit ở trên.
3. Canh thang azit
etyl màu tía
Pepton 20,0g
Đường glucoza 15,0g
Natri chlorua (NaCl) 5,0g
K2HPO4
2,7g
Natri azit 0,4g
Azit etyl màu tía 0,00083g
Nước cất 1000ml
Cách pha: Như pha
canh thang natri azit
4, Nước pepton 0,1%
Pepton 1,0g
Nước cất 1000ml
* Chỉnh pH = 7,2
Sơ đồ định lượng
P. aeruginosa
a) Xác định nồng độ
formaldehyd ban đầu:
b) Pha dung dịch
formaldehyd nồng độ 10 ppm:
10 x ppm (1000 x
ppm) 10-1 10-1 10-2
UV - VIS
đông lại đem
- Quinolin Qui
nolin
Sơ đồ định lượng Sơ
đồ định lượng Sơ đồ định lượng
Sơ đồ định lượng
B.cereus trong thực phẩm