Quyết định 3113/1999/QĐ-BYT tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm phương pháp thử kích ứng trên da

• Số hiệu: 3113/1999/QĐ-BYT
• Loại văn bản: Quyết định
• Nơi ban hành: Bộ Y tế
• Người ký: Lê Văn Truyền
• Ngày ban hành: 11/10/1999

BỘ Y TẾ -----	CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc -------
Số: 3113/1999/QĐ-BYT	Hà Nội, ngày 11 tháng 10 năm 1999

QUYẾT ĐỊNH

BAN HÀNH TIÊU CHUẨN GIỚI HẠN VI KHUẨN, NẤM MỐC TRONG MỸ PHẨM VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ KÍCH ỨNG TRÊN DA.

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật bảo vệ sức khỏe nhân dân ban hành ngày 11/7/1989 và Điều lệ thuốc phòng bệnh, chữa bệnh ban hành kèm theo Nghị định số 23/HĐBT ngày 24/01/1991 của Hội đồng Bộ trưởng (nay là Chính phủ);
Căn cứ Pháp lệnh chất lượng hàng hóa ngày 27/12/1990 của Chủ tịch Hội đồng Nhà nước và Nghị định số 327/HĐBT ngày 19/10/1991 của Hội đồng Bộ trưởng (nay là Chính phủ) qui định thi hành Pháp lệnh chất lượng hàng hóa;
Căn cứ Nghị định số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng nhiệm vụ, quyền hạn và tổ chức bộ máy Bộ Y tế;
Căn cứ Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ quy định phân công trách nhiệm quản lý nhà nước về chất lượng hàng hoá;
Xét đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý dược Việt Nam;

QUYẾT ĐỊNH

Điều 1: Nay ban hành kèm theo Quyết định này :

1- Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm

2- Phương pháp thử Kích ứng trên da (áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm)

Điều 2: Quyết định này có hiệu lực sau 15 ngày kể từ ngày ký ban hành. Các quy định trước đây trái với quy định trong Quyết định này đều bị bãi bỏ.

Điều 3: Các Ông, Bà Chánh văn phòng, Chánh Thanh tra, Vụ trưởng Vụ điều trị, Vụ trưởng Vụ Khoa học -Đào tạo - Bộ Y tế, Cục trưởng Cục Quản lý dược Việt Nam, Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm, Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ, Giám đốc Sở y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương, Y tế ngành chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này.

THỨ TRƯỞNG BỘ Y TẾ Lê Văn Truyền

TIÊU CHUẨN

GIỚI HẠN VI KHUẨN, NẤM MỐC TRONG MỸ PHẨM

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm là văn bản qui định về số lượng tối đa vi khuẩn, nấm mốc không được phép vượt quá trong mỹ phẩm và phương pháp thử để xác định vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm.

1 - Giới hạn vi khuẩn và nấm mốc:

1.1. Trong mỹ phẩm, không được có các vi khuẩn sau:

- Staphylococcus aureus

- Candida albicans

- Pseudomonas aeruginosa

1.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không được lớn hơn 1000/1g hoặc 1 ml sản phẩm

1.3. Tổng số nấm mốc sống lại được không được lớn hơn 100/1g hoặc 1ml sản phẩm

1.4. Số lượng Enterobacteria và các vi khuẩn Gram âm khác không được lớn hơn 10/1g hoặc 1ml sản phẩm.

2 - Phương Pháp thử

2.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử nghiệm.

2.1.1. Lấy mẫu.

Theo tiêu chuẩn lấy mẫu kiểm nghiệm, một mẫu đem thử phải làm ít nhất trên 03 đơn vị đóng gói nhỏ nhất.

2.1.2. Pha chế mẫu thử nghiệm.

Tuỳ theo từng sản phẩm, lấy một lượng sản phẩm đại diện từ các đơn vị đóng gói (khoảng từ 10-50 g hoặc 10-50 ml sản phẩm) vào bình nón, thêm dung môi pha loãng thích hợp để pha loãng sản phẩm thành các nồng độ đem thử nghiệm thích hợp như: 10^-1, 10^-2, 10^-3 hoặc 1/2; 1/5; 1/20; 1/40 vv... sao cho khi đếm khuẩn lạc trên đĩa Petri có đường kính 90-100 mm, số lượng khuẩn lạc không vượt quá 300 trong một đĩa.

2.2. Dụng cụ và phương tiện thử nghiệm.

Thử nghiệm được tiến hành trong các điều kiện vô trùng, đảm bảo không có sự lây nhiễm các vi khuẩn từ ngoài vào mẫu thử. Các phương tiện và dụng cụ cần dùng gồm:

- Hộp Petri thuỷ tinh có đường kính 90- 100 mm

- Pipét chia vạch có thể tích 1; 5 và 10 ml.

- Bình nón dung tích 100; 250 và 500 ml.

- Ống nghiệm các loại 16- 160 mm; 18- 200 mm.

- Nồi cách thuỷ ổn định được nhiệt độ trong khoảng 35 - 45^0C.

- Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 32 ^0C  1^0C.

- Tủ sấy.

- Nồi hấp tiệt trùng

- Máy đo pH.

2.3. Hoá chất.

- Thạch dùng cho vi sinh vật

- Pepton dùng cho vi sinh vật.

- Natri clorid tinh khiết (NaCl)

- Glucose tinh khiết

- Di natri hydrophosphat tinh khiết

- Natri dihydrophosphat

- Kali dihydrophosphat tinh khiết

- Di kali hydrophosphat tinh khiết

- Acid lactic : dung dịch 20 % hoặc 30%.

- Acid citric : dung dịch 20%.

- Natri hydroxyd tinh khiết (NaOH)

- Dung dịch natri hydroxyd 0,1N

- N- dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid

- Magnesi clorid

- Cetrimid (Cetyl trimethyl amoni bromid)

- Magnesi sulfat ngậm nước (MgSO₄. 7H₂O)

- Glycerin

- Tween 80.

- Đỏ trung tính.

- Tím tinh thể

- Xanh Brilliant.

2.4. Môi trường

2.4.1. Các môi trường dùng để pha loãng, đếm các vi khuẩn , nấm mốc.

2.4.1.1. Nước Pepton

Pepton: 1g

Natri clorid: 8,5g

Nước cất: 1000 ml

2.4.1.2. Nước muối sinh lý

Natri clorid: 8,5 g

Nước cất: 1000 ml

2.4.1.2. Môi trường thạch Sabouraud

Pepton: 10g

Glucose: 40g

Thạch: 15-20 g

Nước cất: 1000 ml

pH sau khi tiệt trùng: 5,6  0,2

Cách pha: Hoà tan các chất trong nước, đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn. Đóng vào các bình dung tích 250 ml, mỗi bình 150 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp 110^0C trong thời gian 15-20 phút. Môi trường có thể bảo quản ở 4 ^0C và sử dụng trong vòng 30 ngày.

2.4.1.3. Môi trường thạch thường

Pepton: 10 g

Natri clorid: 5 g

Thạch: 15-20 g

Nước cất: 1000 ml

pH sau khi hấp tiệt trùng: 7,4 -7,6

2.4.2 . Các môi trường dùng để phân lập vi khuẩn, nấm mốc.

2.4.2.1. Môi trường thạch Cetrimid

Gelatin pancreatic: 20,0 g

Magnesi clorid: 1,4 g

Glycerin: 10,0 ml

Cetrimid: 0,3 g

Thạch: 13,6 g

Nước cất: 1000 ml

Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng 7,2  0,2.

2.4.2.2. Môi trường thạch để phát hiện Fluorescin của Pseudomonas

Casein pancreatic: 10,0 g

Pepton: 10,0 g

Dikali hydrophosphat khan: 1,5 g

Magnesi sulfat ngậm nước: 1,5 g

Thạch: 15,0 g

Glycerin: 10,0 g

Nước cất : 1000 ml.

Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng 7,2  0,2.

2.4.2.3. Môi trường thạch để phát hiện Pyocyanin của Pseudomonas.

Gelatin pancreatic: 20,0 g

Magnesi clorid khan: 1,4 g

Kali sulfat khan: 10,0g

Thạch : 15,0g

Glycerin: 10,0 ml

Nước cất: 1000 ml.

Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng là 7,2  0,2.

2.4.2.4. Môi trường RAT.

Bột gạo: 15,0g

Tween 80: 10 ml

Thạch : 13,5 g

Nước cất : 1000 ml

pH sau khi tiệt trùng : 4,5- 5,5

2.4.2.5. Môi trường thạch muối mật có lactose và glucose, chỉ thị tím tinh thể, đỏ trung tính

Cao men bia: 3,0 g

Gelatin pancreatic : 7,0 g

Muối mật: 1,5 g

Lactose: 10,0 g

Natri clorid: 5,0 g

D- glucose monohydrat: 10,0 g

Thạch : 15,0 g

Đỏ trung tính: 30 mg

Tím tinh thể: 2 mg

Nước cất: 1000 ml.

Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,4  0,2. Đun tới sôi, nhưng không đun trong nồi hấp.

2.4.2.6. Canh thang làm giầu Enterobacteriaceae -Mossel

Gelatin pancreatic : 10,0 g

D-glucose monohydrat: 5,0 g

Mật bò khô: 20,0 g

Kali dihydrophosphat: 2,0 g

Di natri hydrophosphat: 8,0 g

Xanh Brilliant: 15 mg

Nước cất: 1000 ml.

Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2  0,2. Đun ở 100^0C trong 30 phút và làm lạnh ngay.

2.4.2.7. Môi trường thạch Manitol-muối.

Casein pancreatic: 5,0 g

Pepton: 5,0 g

Cao thịt: 1,0 g

Natri clorid: 75,0g

D-manitol: 10,0 g

Đỏ phenol: 25 mg

Thạch: 15,0 g

Cách pha: Trộn, đun nóng, khuấy đều, sau đó đun sôi 1phút để hoà tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng : 7,4  0,2

2.4.2.8. Môi trường lỏng Casein đậu tương.

Casein pancreatic: 5,0 g

Bột đậu tương (thuỷ phân bởi papain) : 3,0 g

Natri clorid: 5,0 g

Dikali hydrophosphat: 2,5 g

Glucose: 2,5 g

Nước cất 1000 ml

Cách pha: Hoà tan các chất rắn vào nước, đun nóng nhẹ cho tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp, đem tiệt trùng. pH sau khi tiệt trùng 7,3 - 0,2.

2.5. Tiến hành nuôi cấy, xác định và phân lập

2.5.1. Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc sống lại được

2.5.1.1. Pha loãng sản phẩm: tiến hành theo mục 2.1.2

2.5.1.2. Cấy truyền:

- Trước tiên cấy kiểm tra pipet trên một đĩa môi trường phát hiện vi khuẩn và một đĩa môi trường phát hiện nấm mốc.

- Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi hộp Petri 1ml sản phẩm đã pha loãng, mỗi độ pha loãng cấy vào 2 hộp để xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí sống lại được và 2 hộp để xác định số lượng nấm mốc sống lại được.

2.5.1.3. Đổ đĩa:

Đun nóng chảy hoàn toàn các loại môi trường dùng để đếm vi khuẩn, nấm mốc, để nguội đến 45^oC, rót vào các hộp Petri (đã cấy sẵn trong mỗi hộp 1ml của một độ pha loãng của sản phẩm) mỗi hộp 15- 20 ml môi trường; trộn đều sản phẩm đã pha loãng với môi trường bằng cách xoay hộp Petri qua phải và qua trái mỗi chiều 2-3 lần. Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.

Thường dùng môi trường thạch thường để đếm vi khuẩn hiếu khí

Thường dùng môi trường Sabouraud để đếm nấm mốc

2.5.1.4. Ủ ấm:

Sau khi các đĩa thạch đã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, lật ngược đĩa thạch và đem ủ.

- Những đĩa thạch dùng để đếm vi khuẩn được ủ ở 32 - 35^0C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ 48 - 72 h.

- Những đĩa thạch dùng để đếm nấm mốc ủ ở 25  2 ^0C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ từ 3 - 5 ngày.

2.5.1.5. Tính kết quả:

Số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc sống lại được có trong 1 g hoặc 1ml

sản phẩm được tính theo công thức sau: 

M =

Trong đó:

M= Số lượng vi khuẩn, nấm mốc sống lại được có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm

C = Tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa Petri cùng một độ pha loãng

n = Số đĩa trong một độ pha loãng

d = Độ pha loãng

N = Số độ pha loãng ( thí dụ đếm hai độ pha loãng 10^1 và 10^2: N=2; đếm ở những độ pha loãng 2,5 & 10 thì N= 3 v.v...)

2.5.2. Phân lập vi khuẩn

2.5.2.1. Tìm Staphylococcus aureus

Cho chế phẩm vào 100ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ấm 35^oC trong khoảng 24 - 48 h. Quan sát môi trường, nếu thấy vi khuẩn mọc, dùng que cấy lấy một quai cấy, cấy lên một đĩa thạch Mannitol- muối. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, đem ủ ấm ở 35^O C trong 24 h. Sau khi ủ ấm, kiểm tra nếu thấy:

Trên đĩa thạch Manitol - muối có thấy những khuẩn lạc màu vàng cùng với một vùng màu vàng xung quanh, dùng que cấy lấy khuẩn lạc điển hình, đem nhuộm Gram, soi kính thấy tụ cầu khuẩn hình chùm nho, bắt màu gram dương, đường kính khoảng 0,8 - 1m; tiếp tục làm các phản ứng sinh vật hoá học của Staphylococcus aureus. Chuyển một khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng vào ống nghiệm nhỏ, sạch vô trùng, thêm vào ống 0,5 ml huyết tương thỏ. Đem ủ ấm cách thuỷ 37^oC; sau 3 giờ ủ ấm, kiểm tra các ống thử, tiếp tục ủ ấm thêm 24 h. Nếu thấy có hiện tượng đông huyết tương ở bất kỳ mức độ nào- sản phẩm có Staphylococcus aureus.

2.5.2.2. Tìm Pseudomonas aeruginosa

Cho chế phẩm vào 100ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ấm ở 35 ^OC trong khoảng 24- 48 h. Quan sát môi trường, nếu thấy vi khuẩn mọc, dùng que cấy lấy một quai cấy, cấy lên một đĩa thạch Cetrimid. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri và đem ủ ấm ở 35^0C trong 24h. Sau khi ủ ấm, kiểm tra nếu thấy:

Trên môi trường thạch Cetrimid có khuẩn lạc màu lục nhạt, có ánh huỳnh quang màu lục, thì lấy khuẩn lạc, nhuộm gram, và soi kính. Nếu thấy trực khuẩn Gram âm và phản ứng oxydaza dương tính thì tiếp tục cấy truyền trên mặt môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin và môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện pyocyamin trong hộp petri. Đậy và lật ngược hộp môi trường đã cấy truyền, đem ủ ấm ở 35  2^0C trong ít nhất 3 ngày, đem kiểm tra các đĩa thạch dưới ánh đèn tử ngoại, nếu thấy:

Trên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin có khuẩn lạc không màu đến màu vàng nhạt, có huỳnh quang hơi vàng.

Trên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện pyocyamin có khuẩn lạc màu vàng nhạt, có huỳnh quang màu xanh nước biển.

Tiếp tục nhuộm gram, soi kính và làm phản ứng oxydaza thấy trực khuẩn gram âm, phản ứng oxydaza dương tính, có thể kết luận có Pseudomonas aeruginosa. Nếu chưa chắc chắn có thể tiếp tục kiểm tra bằng các phép thử sinh hoá khác.

Thử phản ứng oxydaza: Chuyển khuẩn lạc vào mẩu giấy đã tẩm trước N-dimethyl phenylen diamin dihydroclorid, nếu thấy hiện màu đỏ hồng, chuyển sang màu tím: phản ứng oxydaza dương tính.

2.5.2.3. Enterobacteriaceae và các vi khuẩn gram âm khác.

Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lượng thích hợp như đã mô tả ở trên và ủ ấm ở 35-37^0C trong một thời gian thích hợp để phục hồi lại vi khuẩn, nhưng không phải làm tăng vi khuẩn (thường từ 2- 5 h). Lắc bình chứa và chuyển một lượng chế phẩm đã đồng nhất tương đương với khoảng 1g hoặc 1ml chế phẩm vào 100 ml môi trường canh thang làm giầu Enterobacteriaceae -Mossel và ủ ấm ở 35-37^0C trong 18-24h. Cấy lên đĩa thạch muối mật có lactose, glucose, chỉ thị tím tinh thể và đỏ trung tính, ủ ấm ở 35-37^0C trong 18- 48h. Chế phẩm không có Enterobacteriaceae nếu không thấy mọc những khuẩn lạc vi khuẩn gram âm trên thạch đĩa.

Đánh giá số lượng: ủ ấm một lượng thích hợp môi trường canh thang làm giầu Enterobacteriacea -Mossel với những lượng chế phẩm đem kiểm tra đã được làm đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1g và 0,01g hoặc 1,0 ml; 0,1 ml và 0,01ml. Chế phẩm có thể được pha loãng khi cần. ủ ấm ở 35- 37^0C trong 24-48 h. Sự mọc của các khuẩn lạc đã phát triển tốt thường đỏ hoặc đĩa đỏ, vi khuẩn gram âm chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định theo bảng sau số lượng Bacteria

Bảng tính lượng Bacteria trong chế phẩm. 

Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm			Số bacteria có trong 1 gam sản phẩm
1,0 g hoặc  1,0 ml	0,1g hoặc 0,1 ml	0,01g hoặc 0,01 ml
+	+	+	Lớn hơn 10^2
+	+	-	ít hơn 10^2 nhưng lớn hơn 10
+	-	-	ít hơn 10 nhưng lớn hơn 1
-	-	-	ít hơn 1

2.5.2.4. Tìm Candida albicans.

Tiến hành trên môi trường thạch Sabouraud

Vào cuối giai đoạn ủ ấm, kiểm tra bằng kính hiển vi xem có nấm mọc hay không. Kiểm tra sự có khuẩn lạc nghi ngờ Candida albicans. Lấy khuẩn lạc điển hình đem nhuộm gram, soi kính: Candida albicans có hình tròn, bầu dục đường kính 6-9 m, bắt màu gram dương.

* Thử nghiệm mầm giá đậu:

Lấy một giọt huyền dịch nấm đã nuôi cấy sau 24h vào ống nghiệm nhỏ có chứa 1 ml huyết thanh thỏ, ủ ấm ở 37^0C trong 3 h, sau đó lấy ra soi giữa bản và lá kính. Nếu là nấm Candida albicans thì gần như toàn bộ số tế bào sẽ nẩy mầm giống như hình “giá đậu”.

* Tìm tế bào vách dày:

Cho môi trường RAT lên bản kính vô khuẩn, nhỏ vào một giọt huyền dịch nấm, đậy lá kính, đọc kết quả sau 24-48 h ủ ấm ở 30^0C. 
 

PHƯƠNG PHÁP

THỬ KÍCH ỨNG TRÊN DA

(áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm)

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trưởng Bộ Y tế )

1. Nguyên tắc:

Thử kích ứng trên da là một phương pháp sinh học dựa vào mức độ phản ứng của da thỏ với chất thử so với phần da kế bên không đắp chất thử.

Phép thử không áp dụng cho các chất acid hoặc kiềm mạnh (pH < 2 hoặc pH>11,5) và các chất đã biết là có kích ứng trên da.

2. Dụng cụ , hoá chất thí nghiệm.

- Tông đơ điện hoặc một thiết bị thích hợp để làm sạch lông thỏ.

- Kéo, panh.

3. Động vật và điều kiện thí nghiệm.

Sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (không sử dụng thỏ có chửa hoặc đang cho con bú), khoẻ mạnh, cân nặng không dưới 2kg. Thỏ được nhốt riêng từng con và nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thử.

Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 25  3^0C, độ ẩm tương đối 30-70%, ánh sáng đảm bảo 12 giờ tối, 12 giờ sáng hàng ngày.

4. Chuẩn bị mẫu thử.

Mẫu thử được chuẩn bị tuỳ theo tính chất và cách sử dụng trên người của từng loại sản phẩm.

- Chất lỏng: dùng trực tiếp hoặc pha loãng với dung môi thích hợp.

- Chất rắn: có thể dùng trực tiếp hoặc tán thành bột mịn rồi làm thành dạng bột ẩm với dung môi thích hợp để đảm bảo chất thử được tiếp xúc tốt với da.

-Với các chất rắn khác không thể tán thành bột, cần xử lý hoặc chiết xuất trước khi sử dụng (Phương pháp chiết xuất nguyên liệu để thử sinh học được thực hiện theo hướng dẫn tại phụ lục đính kèm)

- Nếu sản phẩm cuối cùng ở dạng vô trùng, chất thử sẽ được tiệt trùng với cùng điều kiện như trong qui trình sản xuất. Chú ý với những sản phẩm tiệt trùng bằng ethylen dioxid vì ethylen dioxid và sản phẩm phân huỷ của nó có thể gây kích ứng. Cần có đánh giá đầy đủ những phản ứng của loại sản phẩm này trước và sau khi tiệt trùng.

- Dung môi dùng để pha loãng, làm ẩm hoặc chiết xuất là các chất phân cực (nước, nước muối sinh lý) hoặc không phân cực (dầu thực vật, dầu khoáng) không gây kích ứng.

5. Tiến hành

5.1 Chuẩn bị súc vật.

Trước ngày thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng để đặt các mẫu thử và đối chứng (khoảng 10cm x 15cm). Chỉ những thỏ có da khoẻ mạnh, đồng đều và lành lặn mới được dùng vào thí nghiệm.

5.2 Đặt mẫu thử.

Mỗi mẫu được thử trên 03 thỏ. Liều chất thử trên mỗi thỏ là 0,5 g hoặc 0,5 ml. Đặt mẫu thử đã chuẩn bị ở trên lên miếng gạc không gây kích ứng 2,5 cm x 2,5 cm có độ dày thích hợp rồi đắp lên da. Cố định miếng gạc bằng băng dính không gây kích ứng ít nhất trong 4 giờ. Sau đó bỏ gạc và băng dính, chất thử còn lại được làm sạch bằng dung môi thích hợp không gây kích ứng.

Trong trường hợp mẫu thử đã được pha loãng hoặc làm ẩm bằng dung môi, tiến hành song song đặt mẫu đối chứng là dung môi đã dùng ở chỗ da bên cạnh. Sơ đồ đặt mẫu thử có thể bố trí như sau:

Hướng đầu thỏ

6. Quan sát và ghi điểm.

Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt chất thử so với da kề bên không đặt chất thử ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử. Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày.

Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo qui định ở bảng 1. 

Bảng 1. Mức độ phản ứng trên da thỏ.

Phản ứng	Điểm đánh giá
Sự tạo vẩy và ban đỏ
- Không ban đỏ	0
- Ban đỏ rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy)	1
- Ban đỏ nhận thấy rõ	2
- Ban đỏ vừa phải đến nặng.	3
- Ban đỏ nghiêm trọng (đỏ tấy) đến tạo thành vẩy để ngăn ngừa sự tiến triển của ban đỏ.	4
Gây phù nề
- Không phù nề	0
- Phù nề rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy)	1
- Phù nề nhận thấy rõ (viền phù nề phồng lên rõ)	2
- Phù nề vừa phải (da phồng lên khoảng 1mm)	3
- Phù nề nghiêm trọng (da phồng lên trên 1mm và có lan rộng ra vùng xung quanh)	4
Tổng số điểm kích ứng tối đa có thể.	8

Những thay đổi khác trên da cần theo dõi và ghi chép đầy đủ.

7. Đánh giá kết quả

Trên mỗi thỏ, điểm phản ứng được tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử.

Trong trường hợp có dùng mẫu đối chứng, điểm phản ứng của mẫu thử được trừ đi số điểm của mẫu đối chứng.

Chỉ sử dụng các điểm ở những thời gian quan sát ở 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ để tính kết quả

Đối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui định trên bảng 2 để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.

Bảng 2 Phân loại các phản ứng trên da thỏ.

Loại phản ứng	Điểm trung bình
Kích ứng không đáng kể	0 - 0,5
Kích ứng nhẹ	> 0,5 - 2,0
Kích ứng vừa phải	> 2,0 - 5,0
Kích ứng nghiêm trọng	> 5,0 - 8,0

8. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả cần ghi đầy đủ các thông tin về mẫu thử, súc vật thử (loài, số lượng). Ghi chi tiết cách chuẩn bị mẫu thử và cách đặt mẫu trên da, điểm của các lần quan sát, những nhận xét thêm nếu có và đánh giá kết quả.

Ghi chú:

- Đánh giá mức độ kích ứng trên da không nên chỉ dựa vào số điểm kích ứng mà còn căn cứ vào những mô tả sự thay đổi tình trạng da đã quan sát được.

- Việc kết luận mẫu thử đạt chất lượng về chỉ tiêu kích ứng da hay không phải phụ thuộc vào yêu cầu riêng của từng sản phẩm./ 
 

PHỤ LỤC 

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT NGUYÊN LIỆU ĐỂ THỬ SINH HỌC.

1. Giới thiệu :

Để tiến hành đánh giá sinh học các nguyên vật liệu, cần phải dùng dạng dịch chiết với các môi trường thích hợp. Phụ lục này trình bày một số phương pháp thông thường để thu được dịch chiết để thử. Các phần bổ sung, không thay thế sẽ được ghi trong các chuyên luận riêng.

2. Dụng cụ:

- Nồi hấp có khả năng duy trì nhiệt độ 121^0C  2^0C .

- Tủ sấy hoặc tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ 70^0C  2^0C; 50^0C  2^0C và 37^0C  2^0C .

- Dụng cụ để cắt (kéo, dao, cưa). Làm sạch dụng cụ cắt bằng kim loại với một dung môi hữu cơ bay hơi như alcohol hoặc aceton. Không dùng các acid để làm sạch dụng cụ kim loại.

- Pipét có kích thước phù hợp.

- Cân chính xác đến 0,1g.

- Dụng cụ đo : thước đo mm, compa.

- Bình chiết.

- Môi trường chiết: sử dụng ít nhất một trong hai loại môi trường sau:

+ Dung môi phân cực: nước muối sinh lý.

+ Dung môi không phân cực: dầu thực vật (ví dụ dầu hạt bông, dầu vừng, đạt tiêu chuẩn EP hoặc USP) hoặc dầu khoáng trung tính.

Các môi trường chiết thích hợp khác với các môi trường trên như: ethanol/nước; ethanol/nước muối sinh lý; polyethylen glycol 400; dimethyl sulfocid; aceton, methanol, chloroform, chất diện hoạt pha loãng, dầu khoáng.

3. Chuẩn bị mẫu

3.1 Xác định diện tích bề mặt.

+ Đối với các mẫu được coi là đồng đều về mặt hình thể, dùng cách tính diện tích bề mặt theo công thức hình học.

Nếu độ dày của nguyên liệu là dưới 0,5mm, dùng một mẫu với tổng diện tích bề mặt tương đương 120 cm^2, chiết trong 20 ml môi trường chiết, đảm bảo tất cả bề mặt của mẫu thử được tiếp xúc với môi trường chiết.

Nếu độ dày của nguyên liệu lớn hơn 0,5mm, lấy mẫu thử với tổng diện tích bề mặt tương đương 60 cm^2, chiết trong 20 ml môi trường chiết, đảm bảo tất cả bề mặt của mẫu thử được tiếp xúc với môi trường chiết.

+ Đối với nguyên liệu có hình dạng không đồng đều, diện tích bề mặt không thể xác định được dễ dàng, dùng từ 2-4g mẫu, chiết trong 20ml môi trường chiết. Cân nguyên liệu ở độ chính xác 0,1g.

+ Các loại nguyên liệu khác.

Đối với các nguyên liệu mà môi trường chiết không đủ để ngập hết diện tích bề mặt mẫu thử hoặc khối mẫu đã được chia nhỏ đồng nhất (như bọt biển), dùng lượng mẫu lớn nhất mà thể tích môi trường chiết qui định có thể bao phủ hết. Xác định tỷ lệ diện tích bề mặt sử dụng và cân khối lượng mẫu chính xác đến 0,1g.

+ Các nguyên liệu không thể chia nhỏ được.

Với các nguyên liệu không thể chia nhỏ mà không làm mất đi đặc tính của mẫu, độ đồng nhất hoặc độ toàn vẹn của mẫu và thể tích môi trường chiết đã qui định không thể bao phủ toàn bộ mẫu (ví dụ các dụng cụ phức tạp, đồ vật kim loại, bên trong các túi), dùng một lượng tối thiểu môi trường để có thể bao phủ hết bề mặt mẫu thử. Tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu, định rõ hoặc là khối lượng (chính xác đến 0,1g) hoặc là diện tích bề mặt (chính xác đến 1cm^2) được chiết với thể tích dịch chiết qui định chính xác đến 1ml.

3.2. Chuẩn bị

3.2.1 Kiểm tra mẫu thử xem có bị nhiễm bẩn bề mặt, súc rửa và làm khô mẫu thử, chiết bằng nước tinh khiết hoặc nước để pha tiêm với tỷ lệ 70ml/60cm^2 bề mặt. Súc rửa trong ít nhất 30 giây rồi gạn bỏ. Súc lại nếu cần rồi làm khô trước khi đem chiết.

Chú ý: phần lớn các mẫu thử được cung cấp trong điều kiện vô trùng hoặc trong bao gói sạch. Việc thao tác bằng tay và tiếp xúc với nhiệt khô thường không đảm bảo trên thực tế, có thể ảnh hưởng không tốt đến kết quả của một số nghiên cứu. Có thể bỏ qua giai đoạn súc rửa với các nguyên liệu sạch để nó có thể cho phép đánh giá một cách thực tế hơn nguyên liệu và quá trình sản xuất.

3.2.2 Chia nhỏ nguyên liệu thành các mảnh nhỏ nếu có thể được.

3.2.3 Khi độ dày của nguyên liệu lớn hơn 1mm và không thể chia nhỏ được nữa, tính bề mặt tiếp xúc của tất cả các mảnh để xác định lượng đem dùng.

4. Qui trình chiết.

4.1 Cho nguyên liệu thử vào bình chiết có kích thước thích hợp. Đong thể tích môi trường chiết cần thiết (chính xác đến 1ml) rồi đổ lên nguyên liệu thử trong bình. Trộn đều để đảm bảo các nguyên liệu tách rời, không dính vón lại với nhau.

4.2 Nếu không có chỉ dẫn gì riêng, chiết mẫu thử ở 37^0 C trong 72 giờ. Khi tăng nhiệt độ chiết thì có thể giảm thời gian chiết theo các tỷ lệ điều chỉnh như sau:

121^0C trong 1 - 0,2 giờ.

70^0C trong 24 - 2 giờ

50^0C trong 72 - 2 giờ

4.3 Mẫu đối chứng: tiến hành như trên trong cùng điều kiện nhưng với dung môi và không có mẫu thử.

4.4 Sau khi chiết, khấy và gạn dịch chiết sang bình sạch. Bảo quản dịch chiết ở nhiệt độ phòng, và dùng trong vòng 24 giờ kể từ khi gạn. Nếu dịch chiết đã để quá 24 giờ, độ tin cậy của dịch chiết ở điều kiện bảo quản nên được kiểm tra.

4.5 Có thể dùng một qui trình chiết thay thế, sử dụng dung môi bay hơi, sau đó bốc hơi dung môi và bôi cắn lên súc vật.