TIÊU
CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
8685-14:2017
QUY
TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 14: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI THỂ
KÍNH Ở LỢN
Vaccine
testing procedure - Part 14: Haemophillus parasuis
vaccine, inactivated
Lời nói đầu
TCVN 8685-14:2017 do Trung tâm Kiểm nghiệm
thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề
nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công
nghệ công bố.
Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm
vắc xin gồm các phần:
- TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó
thương hàn lợn nhược độc;
- TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm
gan siêu vi trùng vịt;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- TCVN 8685-4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt
phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;
- TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung
khí thán;
- TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin
Gumboro nhược độc;
- TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt
thán nha bào vô độc chủng 34 F2;
- TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả
lợn nhược độc;
- TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt
phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;
-TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt
phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);
- TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt
phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);
-TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược
độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh
sản ở lợn (PRRS);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt
phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;
- TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt
phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;
- TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt
phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;
- TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt
phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;
- TCVN 8685-18
: 2017, Phần 18: vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;
- TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc
xin vô hoạt phòng bệnh gumboro.
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC
XIN - PHẦN 14: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI THỂ KÍNH Ở LỢN
Vaccine
testing procedure - Part 14: Haemophillus parasuis
vaccine, inactivated
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiêu chuẩn này quy định quy trình kiểm
nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn (hay còn gọi
là bệnh Glasser) được sản xuất từ chủng vi khuẩn Haemophillus parasuis.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết
cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn năm công bố thì
áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng
phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8684 : 2011, “Vắc xin và chế
phẩm sinh học dùng trong thú y - Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết”
3 Ký hiệu và chữ viết
tắt
BAB : Blood Agar Base
HP: Heamophillus parasuis
BHI: Brain heart infusion
EDTA: Ethylene diamine tetra-acetic
acid
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PBS: Phosphate bufered saline
4 Nguyên tắc
Vắc xin được kiểm tra
các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong phòng
thí nghiệm, các chỉ tiêu tính an toàn và tính hiệu lực được đánh giá trên các động
vật thí nghiệm.
5 Động vật thí nghiệm
và giống gốc công cường độc
5.1 Lợn từ 3 tuần tuổi
đến 4 tuần tuổi, khỏe mạnh, không có kháng thể Haemophillus parasuis
5.2 Chuột lang trọng lượng
từ 350 g đến 400g, khỏe mạnh
5.3 Thỏ trọng lượng
từ 1,8 kg đến 2 kg, khỏe mạnh, không có kháng thể kháng Haemophillus parasuis
5.4 Vi khuẩn Haemophillus
parasuis
cường độc
6 Thiết bị, dụng cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.2 Tủ lạnh có thể duy
trì nhiệt độ từ 2°C đến 8°C
6.3 Tủ lạnh sâu có thể duy trì
nhiệt độ âm 80°C
6.4 Máy lắc trộn (vortex
mixer) có tốc độ lắc từ
50 rpm đến 2400 rpm
6.5 Máy ly tâm, ly tâm với
gia tốc 12 000 g
6.6 Nồi cách thủy có thể duy
trì ở các nhiệt độ 100°C, 110°C, 121°C trong thời
gian 10 min, 15 min, 20 min
6.7 Micropipet, dung tích từ
0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl
6.8 Micropipet đa
kênh,
dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl
6.9 Đĩa lồng, ống
nghiệm thủy tinh vô trùng
6.10 Đĩa nhựa 96
giếng
đáy chữ U
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.12 Dao, kéo,
panh kẹp
vô trùng
6.13 Bơm kim tiêm một
lần
5 ml, 10 ml
6.14 Cân phân tích có dải đo từ
0 g đến 30 g
7 Lấy mẫu sản phẩm
và chuẩn bị động vật thí nghiệm
7.1 Lấy mẫu sản
phẩm:
Số lượng mẫu cần lấy: 12 mẫu (chai/lọ)
7.2 Chuẩn bị động
vật thí nghiệm
- Ít nhất 10 lợn (5.1)
- Ít nhất 17 chuột lang (5.2)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8 Cách tiến hành
8.1 Kiểm tra cảm
quan
Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt
chỉ tiêu cảm quan khi lọ vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.
8.2 Kiểm tra vô
trùng
8.2.1 Kiểm tra tạp
nhiễm vi khuẩn Theo TCVN 8684: 2011
8.2.2 Kiểm tra tạp
nhiễm nấm mốc
Theo TCVN 8684: 2011
8.3 Kiểm tra tính an
toàn
Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:
8.3.1 Phương pháp
trọng tài
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về
an toàn nếu tất cả lợn sống khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến
đổi về cục bộ, bất thường hay có triệu chứng toàn thân.
8.3.2 Phương pháp
thay thế
- Tiêm ít nhất cho 02 chuột lang
(5.2), mỗi con 2 ml vắc xin theo đường dưới da, theo dõi từ 10 ngày đến 14 ngày.
- Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về
an toàn nếu tất cả chuột sống khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến
đổi về cục bộ, bất thường hay có triệu chứng toàn thân.
8.4 Kiểm tra hiệu
lực
Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:
8.4.1 Phương pháp
công cường độc trên lợn
Lợn được chia làm 02 nhóm:
- Nhóm 1: Tiêm cho ít nhất 05 lợn
(5.1), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường tiêm bắp
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- 14 ngày sau
mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ lợn nhóm 1 được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và
đường tiêm như mũi thứ nhất.
- 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, toàn bộ
lợn nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Heamophillus parasuis cường độc
(5.4), tiêm mỗi con 1 ml (tương đương với liều 5 x 109
CFU/1ml) theo đường dưới da.
- Theo dõi lợn nhóm 1 và nhóm 2 trong thời
gian từ 7 ngày đến 10 ngày.
- Vắc xin được coi là đạt nếu:
+ Ít nhất 2/3 lợn nhóm 2 chết hoặc có triệu chứng
bệnh tích điển hình của bệnh viêm phổi thể kính.
+ Ít nhất 4/5 lợn nhóm 1 sống khỏe mạnh và không
có bất kỳ triệu trứng bệnh tích nào của bệnh viêm phổi thể kính.
8.4.2 Phương pháp
công cường độc trên chuột lang
Chuột lang được chia làm 02 nhóm:
- Nhóm 1: Tiêm vào bắp thịt hoặc dưới
da cho ít nhất 10 chuột lang (5.2), mỗi con 1/4 liều vắc xin ghi trên nhãn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- 14 ngày sau
mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ chuột nhóm 1 được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và
đường tiêm như mũi thứ nhất.
- 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, tất cả
chuột lang nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Heamophillus
parasuis cường độc (5.4) mỗi con 0,2 ml (tương đương với 5 x 109 CFU /0,2 ml)
theo đường dưới da.
- Theo dõi chuột trong 7 ngày, vắc xin
được coi là đạt nếu:
+ Ít nhất 3/5 chuột lang nhóm 2 chết hoặc có triệu
chứng, bệnh tích điển hình
+ Ít nhất 7/10 chuột lang nhóm 1 sống
khỏe mạnh.
8.4.3 Phương pháp
huyết thanh học
Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:
8.4.3.1 Đánh giá hiệu
giá kháng thể bằng phản ứng ELISA
- Tiêm vắc xin vào bắp thịt cho ít nhất
05 lợn (5.1), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ
lợn được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. 21
ngày sau mũi tiêm thứ hai, lợn được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng
ELISA
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Tiêm vắc xin vào bắp thịt cho ít nhất
10 chuột lang (5.2), mỗi con 1/4 liều vắc xin ghi trên nhãn. 14 ngày sau mũi
tiêm thứ nhất, toàn bộ chuột được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm
như mũi thứ nhất. 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, chuột được lấy máu, chắt huyết
thanh làm phản ứng ELISA
- Đánh giá kết quả: vắc xin đạt tiêu
chuẩn khi ít nhất 75 % mẫu huyết thanh đạt giá trị dương tính.
8.4.3.2 Đánh giá hiệu
giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết
- Động vật được gây miễn dịch theo mục
8.4.3.1
- Sau đó tất cả động vật được lấy máu,
chắt huyết thanh và tiến hành làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục A)
- Vắc xin được coi là đạt:
Nếu hiệu giá kháng thể của ít nhất 75 % mẫu huyết thanh miễn dịch phải cho kết
quả ≥ 1:16
Phụ
lục A
(Quy
định)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1 Chuẩn bị môi
trường hóa chất
- Đĩa thạch chocolate bổ sung
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 5 %
- Đĩa thạch máu đường kính 8 cm đến 10
cm
- Canh thang Brain heart infusion
(BHI) đóng ống 4 ml
- Acid Ethylene diamine tetra-acetic
acid (EDTA) 1N
- Formaldehyde solution min 37 %
(HCHO)
- Dung dịch PBS: 1000ml được pha theo
công thức sau:
Natri clorua (NaCl) 8 g
Kali clorua (KCl) 2 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mono kali photphat (KH2PO4) 0,2 g
Nước 1000ml
Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH
1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt
trùng ở nhiệt độ 121°C trong 1 h. Bảo
quản ở nhiệt độ 4°C.
A.2 Chuẩn bị
kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen - KN xử lý acid
EDTA)
A.2.1 Cấy 0,01 ml
vi khuẩn Heamophillus parasuis cường độc (5.4) vào môi trường thạch
chocolate bổ sung NAD 5 % (A.1), ủ ở tủ ấm 37°C (6.1) trong 24 h.
A.2.2 Chọn khuẩn lạc
điển hình trên môi trường thạch chocolate (A.2.1) cấy vào môi trường canh thang
BHI (A.1)
(ống
4 ml) bổ sung NAD 5 %, rồi ủ ở tủ ấm 37°C (6.1) trong 24 h.
A.2.3 Láng 4 ml canh trùng
(A.2.2) lên 2 đĩa thạch chocolate (A.1) rồi ủ ở tủ ấm 37°C (6.1) trong
24 h.
A.2.4 Thu hoạch vi
khuẩn sau khi láng trên mặt thạch chocolate (A.2.3) bằng cách dùng 5 ml PBS rửa
bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm.
A.2.5 Nhỏ 0,02 ml
Formaldehyde solution 37 % (A.1) vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ
ở tủ ấm 37°C (6.1) trong
24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.7 Sau đó tiếp tục
ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.6) bằng máy ly tâm (6.5) với tốc độ 12000 rpm
trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được
sẽ rửa bằng 5 ml PBS có bổ sung 0,3 % Formaldehyde solution min 37 %, lặp lại 2
lần.
A.2.8 Tiếp tục ly
tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.7) bằng máy ly tâm (6.5) với tốc độ 12000 rpm
trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS để thu
hoạch kháng nguyên
A.2.9 Kiểm tra
kháng nguyên (A.2.8) xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không
có hiện tượng ngưng kết.
A.3 Chuẩn bị huyết
thanh kiểm tra
Lấy máu động vật (8.4.3.2), chắt lấy
huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy (6.6) ở
nhiệt độ 56°C trong 30
min.
A.4 Cách tiến
hành
Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm
với kháng nguyên O (kháng
nguyên Somatic) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U
Sơ đồ phản ứng
ngưng kết chậm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Đối với các giếng thí nghiệm:
+ Cho dung dịch PBS vào các dãy giếng
thí nghiệm trên đĩa 96 đáy chữ U (50 μl/giếng)
+ Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết
thanh và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2
+ Nhỏ vào các giếng 50 μl kháng nguyên
- Đối với các giếng đối chứng:
+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS +
50 μl kháng nguyên
+ Đối chứng dương: 50 μl dung dịch
PBS + 50 μl huyết thanh tối miễn dịch và pha loãng theo cơ số 2 + 50 μl kháng nguyên
- Lắc nhẹ cho đều rồi dính băng dính để
ở tủ ấm 37°C
(6.1)
qua đêm
- Đọc kết quả:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng
ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng
+ Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá
ngưng kết được đánh giá ở
độ
pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.
Thư mục tài
liệu tham khảo
[1] Veterinarni Medicina, 51, 2006
(5): 168-179