Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10562:2015 về Sữa - Phát hiện chất kháng sinh bằng cách phân tích vi khuẩn cảm thụ

2. Nguyên tắc

Phép thử được dựa trên phản ứng gắn kết giữa các nhóm chức của chất vào vị trí cảm thụ trên các tế bào vi khuẩn được thêm vào. Liên kết ¹⁴C hoặc ³H được đo bằng máy đếm phát sáng nhấp nháy (4.5) và được so sánh với sữa chuẩn zero để phát hiện các chất kháng sinh. Hàm lượng chất kháng sinh có trong mẫu càng lớn thì số đếm càng thấp. Phương pháp này không phát hiện các chất chuyển hóa mà chỉ phát hiện kháng sinh hoạt tính.

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

3.1. Chất lỏng phát sáng nhấp nháy, ví dụ: Optifluor (của hãng Packard Instrument Co., 2200 Warrenville Rd, Downers Grove, IL 60515, USA) hoặc loại tương đương.

3.2. Chất gắn kết vi khuẩn

3.2.1. Thuốc thử D, huyền phù vi khuẩn Bacillus stearothermophilus đông khô.

Thuốc thử này bền được 1 năm khi bảo quản ở -20 ^oC. Khi được hoàn nguyên với dung môi D (3.5) thì có thể bền được 1 tuần nếu bảo quản ở -20 ^oC hoặc bền được 24 h nếu bảo quản ở -5 ^oC. Mỗi phép thử cần khoảng 1 × 10⁸ tế bào trong 200 ml để gắn kết nhóm beta-lactam, tetracycline, streptomycin, macrolide và novobiocin.

3.2.2. Thuốc thử R

...

...

...

3.3. Thuốc thử đánh dấu (phát hiện) kháng sinh

3.3.1. Penicillin ¹⁴C, 125 µCi/µmol, 0,0024 µCi cho một phép thử.

3.3.2. Tetracycline ³H, 0,5 µCi/µmol, 0,052 µCi cho một phép thử.

3.3.3. Erythromycin ¹⁴C, 38 µCi/µmol, 0,0031 µCi cho một phép thử.

3.3.4. Streptomycin ³H, 26 µCi/mmol, 0,0185 µCi cho một phép thử.

3.3.5. Novobiocin ³H, 55 µCi/mmol, 0,0148 µCi cho một phép thử.

3.3.6. Sulfamethazine ³H, 59 µCi/mmol, 0,0311 µCi cho một phép thử.

3.3.7. Chloramphenicol ¹⁴C, 35 µCi/mmol, 0,0126 µCi cho một phép thử.

Thuốc thử đánh dấu kháng sinh được bổ sung chất làm ổn định để duy trì hoạt tính sinh học. Các thuốc thử này ở dạng đông khô có thể bền trên 12 tháng nếu được bảo quản ở -20 ^oC và khi đã được hoàn nguyên thì có thể bền được 2 tuần khi bảo quản ở -20 °C.

...

...

...

3.4. Dung môi C, dung dịch propylen glycol 70 % để hoàn nguyên các chất kháng sinh đánh dấu phóng xạ.

3.5. Dung môi D, dung dịch chứa sucrose 5 %, dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 %, natri clorua (NaCl)

1,2 % để hoàn nguyên các vi sinh vật gắn kết đối với thuốc thử D và thuốc thử R.

3.6. Thuốc thử NH, dung dịch amoni sulfat [(NH₄)₂SO₄] 12 % (khối lượng/thể tích).

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Bộ gia nhiệt, có hai tấm nhôm anot hóa, mỗi tấm có sáu lỗ sâu 5,23 cm, đường kính 1,35 cm, kiểm soát được nhiệt độ ở 45 °C ± 1 °C và 85 °C ± 1 °C, để giữ các ống nghiệm kích thước 13 mm × 10 mm.

4.2. Bộ trộn, ví dụ kiểu Maxi II của Thermolyne Corp., 2555 Kerper Blvd, Dubuque, IA 52001, USA hoặc tương đương.

4.3. Máy ly tâm, tạo được gia tốc hướng tâm 1 300g.

...

...

...

4.5. Máy đếm phát sáng nhấp nháy, phù hợp với ống thủy tinh 13 mm × 100 mm. Ở mức cài đặt nhỏ hơn 10 %, kênh ³H bắt chéo với kênh ¹⁴C và nhỏ hơn 30^o thì kênh ¹⁴C bắt chéo với kênh ³H. Thời gian đếm là 1 min. Năng suất phải lớn hơn 80 %. Độ lặp lại ở 1 000 r/min là khoảng 10 %.

4.6. Ống phân phối chất lỏng phát sáng nhấp nháy, ví dụ của hãng Oxford (Monoject Scientific, 1831 Olive St, St. Louis, MO 63103, USA) hoặc tương đương.

4.7. Chai rửa.

4.8. Ống nghiệm, kích thước 13 mm × 100 mm, bề dày ống 0,084 cm ± 0,005 cm, có nắp đậy bằng chất dẻo.

4.9. Lọ đựng chất phát sáng bằng chất dẻo, dung tích 7 ml.

4.10. Pipet, có thể phân phối các lượng 200 µl, 300 µl và 5 ml.

4.11. Khăn bông.

4.12. Máy trộn vortex.

5. Lấy mẫu

...

...

...

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

6. Cách tiến hành

6.1. Hoàn nguyên thuốc thử

6.1.1. Thuốc thử đánh dấu

Cho dung môi C (3.4) ở nhiệt độ phòng vào chất đánh dấu (3.3) đông khô. Hòa tan ngay. Lấy lượng thuốc thử cần dùng cho một ngày vào lọ nhựa có nắp vặn (4.9). Đặt lọ này lên tấm làm lạnh (4.4) ở -3 °C đến -5 °C đến 24 h. Bảo quản chất đánh dấu dạng lỏng còn lại ở -20 ^oC đến 2 tuần. Các lọ nhựa nhỏ có thể được làm đầy lại khi bảo quản ở -20 ^oC, khi cần.

6.1.2. Thuốc thử gắn kết vi khuẩn

Hoàn nguyên thuốc thử D (3.2.1) bằng cách bổ sung một lượng dung môi D (3.5) ở 4 ^oC theo hướng dẫn ghi trên nhãn, thường là 12 ml. Sử dụng ống nghiệm thủy tinh (4.8) và máy trộn vortex (4.12) để làm vỡ các mảng tế bào. Trộn kỹ. Làm ấm thuốc thử D đã hoàn nguyên đến nhiệt độ phòng (khoảng 25 ^oC) và giữ ở nhiệt độ này khoảng 5 min. Phân phối vào các lọ nhỏ (4.9) và đặt trên tấm làm lạnh (4.4) ở - 5 ^oC để sử dụng hoặc bảo quản ở -20 ^oC. Thuốc thử D có thể bảo quản được 1 tuần ở -20 ^oC hoặc trong 12 h ở -5 ^oC. Rã đông thuốc thử D bằng cách để dưới vòi nước (khoảng 20 ^oC) trong 5 min và đặt trên tấm làm lạnh nhiều hơn 5 min trước khi sử dụng.

Hoàn nguyên thuốc thử R (3.2.2) bằng cách bổ sung một lượng dung môi D (3.5) theo hướng dẫn trên nhãn. Trộn kỹ. Thuốc thử R được bảo quản trên tấm làm lạnh ở nhiệt độ -5 ^oC trong 6 h.

6.2. Hướng dẫn chung

...

...

...

Lượng chất phóng xạ được sử dụng trong phương pháp này đủ thấp để được miễn trừ theo quy định.

6.2.2. Xử lý chất lỏng phát sáng nhấp nháy

Các chất lỏng phát sáng nhấp nháy dễ hòa tan hoặc phân tán trong nước (3.1) có chứa nồng độ ³H hoặc ¹⁴C nhỏ hơn 0,05 μCi/g dung dịch có thể được phân tán trong một lượng lớn nước qua hệ thống thoát nước thải (trong phép thử này sử dụng 2,8 g Optifluor). Tỷ lệ nước chảy vào chất lỏng phát sáng nhấp nháy nên lớn hơn 10:1. Hệ phân tán có thể bị đục do sự có mặt của hydrocarbon có điểm sôi cao. Cần tuân thủ các quy định hiện hành về phòng chống cháy nổ.

6.3. Kiểm tra hiệu năng

Kiểm tra các thuốc thử và dụng cụ thử nghiệm bằng cách phân tích sữa chuẩn zero. So sánh với các kết quả sữa zero trước đó hoặc số đếm điển hình do nhà sản xuất cung cấp kèm theo thuốc thử. Nếu kết quả tương thích thì tiến hành phép xác định.

Gộp các thuốc thử đánh dấu (3.3) như sau: penicillin với tetracycline (P và T), erythromycin với streptomycin (E và St), novobiocin (N), sulfonamide với các chất tương tự PABA (axit para- aminobenzoic) khác (Sm), chloramphenicol (C).

Đánh dấu 5 ống nghiệm: (P và T), (E và St), (N), (Sm), (C).

Dùng pipet lấy trực tiếp 200 µl thuốc thử đánh dấu, cho xuống đáy ống nghiệm tương ứng. Làm sạch pipet trước mỗi lần thêm.

Riêng đối với chloramphenicol, thêm 300 µl thuốc thử NH (3.6). Thêm 5 ml phần mẫu thử vào mỗi ống nghiệm.

...

...

...

Trộn bằng cách xoay và để yên ống nghiệm khoảng 10 lần để cho thuốc thử được phân bố đều, thời gian này kéo dài khoảng 10 s.

Ủ các ống nghiệm chứa (P và T), (E và St) trong 3 min ở 85 °C; ủ các ống chứa (N), (Sm) và (C) trong 3 min ở 45 °C trong bộ gia nhiệt (4.1).

Ly tâm các ống nghiệm 3 min và sau đó gạn bỏ hoàn toàn sữa.

Giữ các ống nghiệm nghiêng 45^o và tráng rửa ống bằng cách dùng chai rửa (4.7) cho đầy nước mà không làm xáo trộn phần kết tủa dưới đáy ống nghiệm. Nghiêng ống và đổ nước rửa đi. Dùng ít nhất hai khăn bông (4.11) để lau sạch chất béo trên ống.

Thêm 300 µl nước và dùng máy trộn (4.12) hòa tan phần còn lại.

Cho vào mỗi ống nghiệm 3 ml chất lỏng phát sáng nhấp nháy, đậy nắp và lắc nhẹ ống.

Đo hoạt độ trên kênh ³H và ¹⁴C của máy phân tích. Đọc giá trị đối với (T), (St), (N) và (Sm) trên kênh ³H và đối với (P), (E) và (C) trên kênh ¹⁴C.

Ghi lại số liệu cao hơn điểm kiểm soát đối với mẫu thử âm tính hoặc thấp hơn đối với mẫu thử dương tính. Điểm kiểm soát là con số ở khoảng 3 lần độ lệch chuẩn từ trung bình của sáu mẫu zero. Lặp lại phép phân tích đối với các mẫu dương tính.

6.4. Dương tính kép

...

...

...

6.5. Xác định điểm kiểm soát

Cài đặt điểm kiểm soát bằng hoặc lớn hơn 3 lần độ lệch chuẩn từ giá trị trung bình mẫu zero. Để thuận tiện, dùng phần trăm để ước tính 3 lần độ lệch chuẩn.

Đối với penicillin, sử dụng khoảng 2,5 lần độ lệch chuẩn vì phải xác định được nồng độ nhỏ hơn 0,008 IU/ml để phù hợp với đĩa chuẩn phân tích B. stearothermophilus.

Để xác định các điểm kiểm soát, lấy trung bình của sáu phép xác định mẫu zero trừ đi các tỷ lệ phần trăm sau đây.

Bảng 1 - Số trừ sử dụng để xác định điểm kiểm soát tương ứng với các chất kháng sinh

Tên kháng sinh

Tỷ lệ phần trăm được trừ từ trung bình mẫu zero

Beta-lactam

15

...

...

...

20

Macrolide

20

Streptomycin

25

Novobiocin

20

Sulfonamide

20

...

...

...

20

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

...

...

...

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.