TIÊU CHUẨN QUỐC
GIA
TCVN
8400-21:2014
BỆNH
ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 21: HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
Ở LỢN (PRRS)
Animal
disease - Diagnostic procedure - Part 21: Porcine
reproductive and respiratory syndrome (PRRS)
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này
có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu
chuẩn này không thể đưa ra được hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng
chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức
khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu
chuẩn.
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn
đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn.
2. Thuật ngữ, định
nghĩa và chữ viết tắt
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ
và những chữ viết tắt sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn: là bệnh truyền
nhiễm do vi rút PRRS, họ Arteriviridae gây ra. Bệnh cũng được gọi theo tên viết
tắt bằng tiếng Anh là bệnh PRRS hoặc
trong dân gian gọi là
bệnh Tai xanh.
CHÚ THÍCH 1: Biểu hiện đặc trưng của lợn
bệnh là các rối loạn về sinh sản ở lợn nái như sẩy thai, thai chết lưu, lợn sơ
sinh chết yểu. Lợn con
đang nuôi theo mẹ, lợn nái hậu bị có biểu hiện viêm đường hô hấp rất nặng.
CHÚ THÍCH 2: Vi rút PRRS có
hai kiểu gen chính
được công nhận là kiểu gen
Châu Âu (týp l) có tên gọi là Lelystad và kiểu gen Bắc Mỹ (týp II) có tên gọi là
VR2332. Vi rút PRRS gây bệnh ở Việt Nam thuộc kiểu gen Bắc Mỹ nhưng có độc lực
cao và giống với
các chủng vi rút PRRS của Trung Quốc.
2.2. Chữ viết tắt
- PRRS (Porcine reproductive and
respiratory syndrome): Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.
- ELISA (Enzyme linked immunosorbent
assay): Phản ứng ELISA.
- rRT - PCR (real-time Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction): Phản ứng Realtime-RT PCR.
- MARC-145: Tế bào thận khỉ xanh Châu
Phi.
- PAM (Porcine alveolar macrophages):
Tế bào đại thực bào phổi lợn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- CPE (Cytopathic pathogene effect): Bệnh
tích tế bào.
- FCS (Fetal calf serum): Huyết thanh
thai bê.
- BSC II (Bio-safety cabinet): Buồng
an toàn sinh học cấp II.
- MEM (Modified Eagles
medium): Môi trường tế bào.
- TCID50 (50 % tissue
culture infective dose):
Liều gây nhiễm 50 % tế bào.
- BHI (Brain heart infusion): Canh
thang tim não.
- PBS (Phosphate buffered saline):
dung dịch muối đệm phốt phát.
- AEC: 3 - Amino - 9 - ethylcarbazole.
- TE buffer (Tris - EDTA buffer): dung
dịch đệm TE.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- NP40: Igepal CA - 630.
3. Thuốc thử và vật
liệu thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh
khiết phân tích, sử dụng
nước cất hai lần
hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase,
trừ các trường hợp có quy định khác.
3.1. Môi trường phát triển
tế bào MEM có chứa FCS
(huyết thanh thai bê).
3.2. Canh thang
tim não
BHI.
3.3. Các loại
kháng sinh
Penicillin, Kanamycin, streptomycin, Mycostatin, Gentamicin.
3.4. Formalin
40%.
3.5. Sữa gầy (skim milk).
3.6. Dung dịch
NP40.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.8. Dung dịch
AEC.
4. Thiết bị, dụng cụ.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của
phòng thí nghiệm sinh
học và cụ thể như sau:
4.1. Tủ lạnh âm
sâu
có thể duy trì nhiệt độ ở âm
20 °C và âm 70 °C.
4.2. Tủ lạnh thường.
4.3. Tủ ấm 37 °C có 5 % CO2.
4.4. Buồng an
toàn sinh học cấp II.
4.5. Máy ly tâm có thể tạo
gia tốc ly tâm ở 8000g, 10000g, 12000g và 14000g.
4.6. Máy ly tâm có thể tạo
gia tốc ly tâm ở 1500g, 2000g, 3000g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.8. Máy khuấy từ.
4.9. Kính hiển vi
soi ngược.
4.10. Kính hiển vi
thường.
4.11. Máy chạy
nhân gen Realtime PCR.
4.12. Nồi hấp áp lực, duy trì nhiệt độ ở 121
°C.
4.13. Chai thủy
tinh,
dung tích 100 ml, 200 ml, 1000 ml và 2000 ml.
4.14. Ống ly tâm dung tích 50
ml và 15 ml.
4.15. Micropipet, dung tích từ
0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000μl, từ 1000 μl
đến 5000 μl.
4.16. Micropipet
đa kênh,
dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.18. Chai nhựa
nuôi tế bào: 25
cm2, 75 cm2.
4.19. Đĩa nhựa
nuôi tế báo:
24 giếng, 96 giếng.
4.20. Màng lọc, có kích thước
lỗ lọc 0,45 μm.
4.21. Dao, kéo,
panh kẹp.
4.22. Bơm kim tiêm dung tích
5ml.
4.23. Ống giữ mẫu eppendorf dung tích 1,5
ml.
5. Cách tiến hành
5.1. Chẩn đoán
lâm sàng
5.1.1. Đặc điểm dịch
tễ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Ở những lứa tuổi khác nhau, lợn mắc bệnh PRRS
có những triệu chứng, bệnh tích biểu hiện cũng khác nhau.
- Ở Việt Nam, bệnh đã trở thành dịch địa phương
nên có thể xảy ra quanh năm nhưng tập trung nhất vào thời gian từ tháng 3 đến
tháng 4 và từ tháng 9 đến tháng 10 hàng năm khi người chăn nuôi tái đàn gia
súc.
5.1.2. Triệu chứng
- Lợn nái: khi nhiễm bệnh thường kém ăn, bỏ
ăn, sốt cao 39 °C - 40 °C, một số con
bị ho.
Triệu chứng đặc trưng thường gặp là
viêm vú và mất sữa. Hiện tượng tai tím, tai xanh có xuất hiện
nhưng không nhiều, nếu xuất hiện thì trong vài giờ là hết.
Ở thể cấp tính lợn có thể bị sảy thai. Một số
lợn đẻ non sau khi mang thai 4 tuần, sau đó duy trì tình trạng động dục giả và
chậm động dục sau cai sữa. Lợn đẻ ra thai chết, thai gỗ hoặc thai vẫn sống
nhưng rất yếu hoặc chết yểu ngay sau đó.
Đôi khi lợn nái có triệu chứng thần
kinh như mất điều hòa vận động.
- Lợn đực: mắc PRRS thường sốt trong
thời gian ngắn, bỏ ăn. Một số lợn có biểu hiện hôn mê và có triệu chứng đường
hô hấp như ho, thở khò khè. Đặc
biệt là viêm tinh hoàn, giảm tính năng giao phối, xuất tinh kém, tỷ lệ thụ thai
thấp.
- Lợn con đang nuôi theo mẹ: thường chết
yểu. Nếu sống hay mắc các bệnh đường hô hấp và thường bị ỉa chảy.
Lợn có biểu hiện viêm kết mạc, sưng mí mắt. Lợn con sốt, ủ rũ, bỏ ăn, gầy còm,
thở nhanh, đôi
khi đi liêu xiêu, nghiêng ngả.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.1.3. Bệnh tích
5.1.3.1. Bệnh tích đại
thể
Bệnh tích đặc trưng nhất là ở
phổi. Phổi có hiện tượng viêm hoại tử, đặc trưng bởi những đám
chắc đặc. Trên các thùy phổi bị bệnh
có màu xám đỏ, có mủ, chắc đặc. Mặt cắt
ngang của các thùy phổi bệnh lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi
hóa mủ.
5.1.3.2. Bệnh tích vi
thể
Quan sát dưới kính hiển vi thường (xem
4.10) có độ phóng đại 400 lần thấy phổi có hiện tượng dịch thẩm xuất và hiện tượng
thâm nhiễm bạch cầu, trong phế nang chứa đầy dịch viêm, đại thực bào. Một số
trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh tích khá đặc trưng ở
phổi là hiện tượng phế nang bị nhăn và có hiện tượng đại thực bào bị phân hủy.
5.2. Chẩn đoán trong
phòng thí nghiệm
5.2.1. Lấy mẫu
5.2.1.1. Lấy mẫu xét nghiệm
kháng nguyên
- Bệnh phẩm nội tạng là phổi, hạch lâm
ba của lợn nghi mắc bệnh
PRRS.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tất cả mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải
được bao gói cẩn thận không
làm lây lan bệnh, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm
nhất có thể (trong vòng 24 h) (kèm theo phiếu bệnh phẩm). Tại phòng thí nghiệm mẫu
phải được bảo quản ở nhiệt
độ âm sâu -70 °C.
CHÚ THÍCH: Đối với xét nghiệm kháng nguyên, không lấy mẫu
phù tạng hoặc máu chất huyết thanh
từ lợn đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc
PRRS chủng JXA1-R hoặc tương tự trong
phạm vi 33 ngày kể từ ngày tiêm để phát hiện vi
rút PRRS.
5.2.1.2. Lấy mẫu xét
nghiệm kháng thể
Mẫu lấy xét nghiệm kháng thể
là huyết thanh
từ 0,5 đến 1 ml của lợn cần kiểm tra: dùng bơm tiêm (xem 4.22) lấy máu lợn cần
kiểm tra (khoảng 3 ml - 4 ml), đặt nghiêng, yên tĩnh cho máu đông và
tránh dung huyết, sau đó chắt lấy huyết thanh giữ trong ống giữ mẫu (xem 4.23)
cho xét nghiệm.
CHÚ THÍCH : Đối với xét nghiệm kháng
thể, không lấy mẫu chất huyết thanh của lợn
được tiêm vắc xin
PRRS và kể cả lợn con sinh ra từ nái mẹ đã được tiêm vắc xin PRRS. Nếu lấy mẫu huyết thanh để xét nghiệm,
cần lấy 3 mẫu/đàn (đối với đàn có
từ 3 con trở lên).
Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được bao gói cẩn
thận không làm lây lan bệnh, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm
nhất có thể (trong vòng 24 h) (kèm theo phiếu bệnh phẩm). Tại phòng thí nghiệm mẫu
phải được bảo quản ở nhiệt độ
âm sâu -70 °C.
5.2.2. Phát hiện và
giám định kháng nguyên
5.2.2.1. Xử lý bệnh
phẩm
- Mẫu bệnh phẩm là phổi, hạch (xem 5.2.1.1): dùng
panh, kéo (xem 4.21) lấy 1 g, cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ (xem 4.17)
vô trùng với 10 ml dung dịch PBS pH = 7,2 (xem phụ lục A) thành huyễn dịch 10
%. Chuyển toàn bộ huyễn dịch vào ống ly tâm 50 ml (xem 4.14) rồi ly tâm bằng
máy ly tâm (xem 4.6) ở gia tốc 2000 g trong 15 min. Hút lấy dịch nước trong ở phía
trên xử lý với kháng sinh penicillin (200 Ul/ml) và Streptomycin
(200 μg/ml) (xem 3.3) hoặc có thể lọc vô trùng qua màng lọc (xem 4.20). Kiểm
tra lại độ vô trùng trên canh thang BHI (xem 3.2).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.2.2. Phương pháp
rRT-PCR (real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)
5.2.2.2.1. Nguyên tắc
Phản ứng rRT-PCR dùng để phát hiện ARN
của vi rút PRRS. Phản
ứng này có thể phân biệt vi rút PRRS thuộc chủng Châu Âu, Bắc Mỹ và Trung Quốc
(vi rút PRRS độc lực cao) bằng việc sử dụng các cặp mồi và mẫu dò đặc
hiệu.
Danh mục các
mẫu dò và cặp mồi sử dụng cho
phản ứng rRT-PCR trong quy trình này để
phát hiện vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ
(NA), Châu Âu (EU) và Trung Quốc
Tên
Cặp mồi/ Mẫu dò
Trình tự gen
(5’-3’)
Đầu gắn huỳnh quang
5’
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PRRS-1 (NA)
Mẫu dò
TGT GGT GAA TGG CAC TGA TTG ACA
FAM
BHQ1
Mồi xuôi
ATG ATG RGC TGG CAT TCT
Không
Không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
ACA CGG TCG CCC TAA TTG
Không
Không
PRRS-2 (EU)
Mẫu dò
CCT CTG CTT GCA ATC GAT CCA GAC
FAM
BHQ1
Mồi xuôi
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không
Không
Mồi ngược
CAG TTC CTG CGC CTT GAT
Không
Không
PRRS- China (JVM)
Mẫu dò
CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
BHQ1
Mồi xuôi
CCCAAGCTGATGACACCTTTG
Không
Không
Mồi ngược
AATCCAGAGGCTCATCCTGGT
Không
Không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PRRS-1 (NA) dùng để phát hiện vi rút PRRS chủng
Bắc Mỹ
PRRS-2 (EU) dùng để phát hiện vi rút
PRRS chủng châu Âu
PRRS-China (JVM) dùng để phát hiện
vi rút PRRS độc lực cao (Trung Quốc) gây bệnh ở Việt Nam
5.2.2.2.2. Cách tiến hành:
- Mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý (xem
5.2.2.1), được chiết tách ARN (xem phụ lục B) bằng kít chiết tách để làm khuôn
mẫu cho phản ứng rRT-PCR.
- Phản ứng rRT-PCR (xem phụ lục B) có
thể khác nhau tùy thuộc vào loại
kít nhân gen sử dụng.
5.2.2.2.3. Đánh giá kết
quả
Kết quả chạy rRT - PCR được xác định dựa
vào chu kỳ ngưỡng (Ct) phát hiện tín hiệu huỳnh quang.
- Mẫu được coi là dương tính
khi có Ct ≤ 35.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35, trường
hợp này phải xét nghiệm lại hoặc dùng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng
định.
5.2.2.3. Phương pháp
phân lập vi rút trên tế bào
- Chuẩn bị tế bào
MARC-145 hoặc tế bào PAM
(xem phụ lục C) nuôi cấy lên các chai nhựa nuôi tế bào 25 cm2 (xem
4.18) hoặc đĩa nhựa nuôi tế bào 24 giếng (xem 4.19) với môi trường
phát triển tế bào (xem
3.1) MEM có 5% FCS (xem Phụ lục A). Sau 2 ngày đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm
(khoảng 80 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh
phẩm (xem 5.2.2.1) với liều 50 μl/giếng đến 100 μl/giếng hoặc 500 μl/chai.
- Kiểm tra tế bào hàng ngày bằng kính
hiển vi soi ngược (xem 4.9). Nếu có vi rút PRRS, vi rút sẽ gây nên những biến đổi bệnh
tích tế bào (CPE) với đặc điểm các tế bào co tròn, thảm tế bào bong tróc khỏi bề
mặt dụng cụ nuôi cấy.
CPE
thường xuất hiện sau 4 ngày đến 7 ngày gây nhiễm.
- Sau 7 ngày thu lấy hết huyễn dịch tế bào vào ống
ly tâm 50 ml (xem
4.14), cất ở tủ lạnh âm sâu (xem 4.1), sau đó lấy ra rã đông, ly tâm bằng máy
ly tâm (xem 4.6) ở gia tốc 3000 g trong 10 min. Thu dịch nước trong cho
giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần thứ hai.
5.2.2.4. Phương pháp
giám định vi rút
Giám định vi rút bằng phương pháp rRT-
PCR (5.2.2.2).
5.2.3. Phát hiện
kháng thể
Phản ứng huyết thanh học có ý nghĩa chẩn
đoán khi lợn mắc bệnh có triệu chứng, bệnh tích nghi PRRS và chưa tiêm phòng vắc
xin PRRS, hoặc sử dụng để đánh
giá kết quả tiêm phòng vắc xin PRRS.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bệnh phẩm là huyết thanh (xem
5.2.1.2): lắc bằng máy lắc trộn
(xem 4.7), rồi ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (xem 4.5) ở gia tốc 8000 g
trong 1 min. Sau đó xử lý ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min để diệt bổ thể rồi đem tiến
hành các phương pháp để phát hiện kháng thể.
5.2.3.2. Phương pháp ELISA
(Enzyme linked immonosorbent assay)
Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện
kháng thể PRRS có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp
ELISA cần theo đúng hướng dẫn của
nhà sản xuất (xem phụ lục D).
5.2.3.3. Phương pháp IPMA
(Immunoperoxidase monolayer assay)
5.2.3.3.1. Nguyên tắc
Đây là phương pháp sử dụng một thảm tế
bào đã gây nhiễm vi rút chuẩn để phát hiện kháng thể. Nếu huyết thanh có kháng
thể thì có sự kết hợp của kháng nguyên, kháng thể và kháng kháng thể, khi cho cơ chất vào sẽ
xuất hiện màu đỏ đậm, đó là phản ứng
dương tính. Phản ứng âm tính nếu thảm tế bào có màu hồng nhạt.
5.2.3.3.2. Chuẩn bị
- Môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS (huyết
thanh thai bê) (xem phụ lục A).
- Dung dịch A: dung dịch cố định tế
bào, gồm: PBS có 10 % formalin (xem
3.4) và 1 % NP40 (xem 3.6).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Dung dịch C: dung dịch pha loãng mẫu,
gồm PBS (xem phụ lục A) với 1 % Tween 80 và 5 % sữa gây (xem 3.5).
- Dung dịch E: dung dịch AEC (3 -
Amino - 9 - ethylcarbazole), gồm 1 ml dung dịch AEC (xem 3.8) nguyên chất + 14
ml dung dịch đệm axetat 0,1 M (pH 5,2) + 15 μl H2O2 30 % (xem
3.7).
- Tế bào
MARC-145 hoặc tế bào PAM (xem phụ lục C).
- Giống vi rút chuẩn PRRS.
5.2.3.3.3. Cách tiến hành
a) Bước 1: Chuẩn bị tế bào MARC -145
(hoặc tế bào PAM) trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng
- Tế bào MARC-145 (hoặc tế bào PAM)
(xem phụ lục C) đựng trong ống cryo được đưa ra khỏi bình nitơ lỏng, nhanh chóng giải đông
rồi cho hỗn hợp tế bào vào ống ly tâm 15 ml (xem 4.14) có chứa sẵn 10 ml môi
trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS. Trộn đều bằng pipet 5000 ml (xem
4.15), cho vào ly tâm ở gia tốc 1500 g trong 5 min. Hút bỏ nước trong ở
trên, giữ phần cặn ở dưới rồi cho tiếp vào 5ml môi trường phát triển
tế bào MEM có 5 % FCS, trộn
đều bằng pipet. Hút chuyển dung dịch này vào chai nuôi tế bào 25 cm2.
Đem giữ trong tủ ấm
(xem 4.3), sau 24 h đưa ra quan sát dưới kính hiển vi (xem 4.9),
xem sự phát triển của tế bào. Thay môi trường phát triển tế bào 1 lần/ngày. Sau
từ 2 ngày đến 4 ngày sẽ thu được một thảm tế bào. Thu tế bào khi đã phát triển trên 90 %
diện tích chai nuôi cấy.
- Thu hoạch tế bào MARC-145 (hoặc tế
bào PAM) rồi tiến hành pha loãng tế bào với môi trường phát triển
tế bào MEM có 5 % FCS với
số lượng cần thiết (5 x 104 tế bào/ml),
chia đều vào đĩa nuôi tế
bào 96 giếng với lượng 100 μl/giếng bằng pipet đa kênh (xem 4.16).
- Ủ đĩa tế bào trong tủ ấm
(xem 4.3) và nuôi từ 1 ngày đến 2 ngày cho đến khi tế bào trong các giếng phát triển thành một
lớp ở đáy giếng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Lấy giống vi rút chuẩn từ nơi bảo quản, làm tan đá
nhanh rồi pha loãng với môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS để được liều 500 TCID50
vi rút/ml (giống vi rút
đã được hiệu chỉnh nồng độ trước). Xem phụ lục E về cách tính liều TCID50.
- Cho 100 μl dung dịch vi rút đã pha
loãng ở trên vào mỗi giếng.
- Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C (xem 4.3)
trong 2 ngày.
c) Bước 3: Cố định tế bào
đã nhiễm vi rút
- Đổ bỏ dung dịch có trong tất cả các giếng
của đĩa.
- Cho 100 μl dung dịch A vào mỗi giếng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30
min.
- Đổ bỏ dung dịch A, rồi rửa đĩa 2 lần
bằng dung dịch rửa B với lượng 300 μl/giếng.
d) Bước 4: Cho huyết thanh cần kiểm
tra
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Đối với phản ứng định lượng kháng thể
pha loãng huyết thanh gấp 4 lần bắt đầu từ 1/10 đến 1/2560.
- Cho 50 μl huyết thanh cần kiểm tra
đã pha loãng vào các giếng tương ứng.
- Ủ đĩa ở 37 °C trong 30 min.
- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa
đĩa 3 lần bằng dung dịch B với lượng 300 μl/giếng.
e) Bước 5: Cho kháng kháng thể PRRS có
gắn enzyme (conjugate + peroxidase)
(kháng thể này được chế trên thỏ)
- Pha loãng kháng kháng thể với dung dịch
pha loãng (dung dịch nước rửa B) theo tỷ lệ 1/600.
- Cho 50 μl kháng kháng
thể đã pha loãng này vào mỗi giếng.
- Ủ đĩa ở 37 °C trong 30 min.
- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa,
rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch rửa B với lượng 300 μl/giếng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Cho vào mỗi giếng 50 μl dung dịch
AEC - dung dịch E.
- Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng 30 min.
g) Bước 7: Đọc kết quả
Để đọc kết quả, sử dụng kính hiển vi soi ngược
(xem 4.9) để quan sát:
- Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong
giếng có những đám tế bào bắt màu đỏ đậm thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó dương tính
kháng thể PRRS,
- Nếu quan sát thảm tế bào trong giếng
thấy toàn bộ thảm tế bào có màu hồng nhạt - màu của môi trường phát triển tế bào thì mẫu
huyết thanh cho vào giếng đó âm tính kháng thể PRRS.
6. Báo cáo kết quả
Lợn được kết luận mắc bệnh PRRS khi có các đặc điểm
về triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với vi rút
PRRS hoặc dương tính kháng thể PRRS bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(Quy định)
Thành phần và chuẩn bị môi trường và dung dịch
thuốc thử
A.1. Dung dịch
kháng khuẩn
A.1.1. Thành phần
Penicillin
1 000 000
UI
Mycostatin
250 000 UI
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Streptomycin
200 mg
Kanamycin
1 000 000
UI
Nước cất vô trùng
100 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa tan kháng sinh với nước cất trong
chai thủy tinh vô trùng 100 ml (xem 4.13) rồi lọc bằng màng lọc (xem 4.20). Bảo
quản ở ngăn đá tủ lạnh thường
(xem 4.2).
A.2. Dung dịch
PBS 0,01 M, pH 7,2
A.2.1. Thành phần
Natri clorua (NaCl)
8g
Kali clorua (KCl)
0,2 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,15 g
Kali dihidrophosphat (KH2PO4)
0,2 g
Nước cất vô trùng
1 000 ml
A.2.2. Chuẩn bị
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3. Dung dịch
NaHCO3 7 %
A.3.1. Thành phần
Natri bicarbonat (NaHCO3)
7 g
Nước cất vô trùng
100 ml
A.3.2. Chuẩn bị
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.4. Dung dịch
L-glutamin 3 %
A.4.1. Thành phần
L-glutamin
3 g
Nước cất vô trùng
100 ml
A.4.2. Chuẩn bị
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.5. Dung dịch
trypsin 0,5 %
A.5.1. Thành phần
Trypsin
0,5 g
Nước cất vô trùng
100 ml
A.5.2. Chuẩn bị
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.6. Môi trường phát
triển tế bào
A.6.1. Chuẩn bị
MEM
18,78 g
Nước cất khử ion
2000 ml
Hòa tan MEM với nước cất khử ion
trong chai thủy tinh vô trùng (xem 4.13), hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 15 min
và bảo quản ở 4 °C. Sau đó bổ
sung các chất để được môi trường sử dụng cho nuôi cấy tế bào.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
MEM
2000 ml
L-glutamin 3 %
20 ml
NaHCO3 7 %
40 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
80 mg
Sau khi bổ sung các chất để được môi
trường tế bào sử dụng, chia ra các chai thủy tinh nhỏ vô trùng (xem 4.13) với
lượng 200 ml/chai, bảo quản ở 4 °C. Khi nào dùng phát triển hay cất giữ tế bào
thì bổ sung thêm
FCS.
A.6.3. Chuẩn bị môi
trường phát triển tế bào MEM
có 5 % FCS
MEM (để sử dụng)
200 ml
FCS
10 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.6.4. Chuẩn bị môi trường
phát triển tế bào MEM có 10 % FCS
MEM (để sử dụng)
100 ml
FCS
10 ml
A.6.5. Chuẩn bị môi
trường cất giữ tế bào
MEM (để sử dụng)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
FCS
7 ml
DMSO
1 ml
A.7. Chuẩn bị mồi
- Mồi đông khô phải được ly tâm ngắn để
chắc chắn rằng mồi được lắng
xuống đáy ống trước khi mở và hoàn
nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200
pmol/μl làm gốc.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi gốc
10 μl
Nước tinh khiết không có nuclease
90 μl
Tổng lượng
100 μl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PHỤ LỤC
B
(Tham khảo)
Phương pháp rRT-PCR phát hiện ARN của vi rút
PRRS
B.1. Chiết tách
ARN
Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết
tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Nếu sử dụng kít chiết tách
Qiagen RNearsy minikit thì các bước chiết
tách được thực hiện như sau:
a) Chuẩn bị
Chuẩn bị dung dịch RLT (600 μl/mẫu)
vào ống ly tâm 50 ml vô trùng (xem 4.14). Thêm 1/100 β- mercaptoetanol (β-ME)
vào dung dịch RLT (sau khi bổ sung β-ME, dung dịch RLT này có thể giữ được 1
tháng ở nhiệt độ phòng).
b) Tiến hành chiết tách
Lắc mẫu trong 5 s bằng máy lắc rồi ly
tâm nhanh. Cho 600 μl dung môi RLT đã bổ sung β-ME vào ống giữ mẫu 1,5 ml (xem
4.23).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thêm 400 μl ethanol 100 % (cồn tuyệt đối)
và lắc trong 15 s. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.
Chuyển 600 μl hỗn hợp dung dịch ở trên
vào ống cột lọc (spin column) có trong bộ kit. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.
Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống
thu mới. Chuyển nốt 600 μl hỗn hợp dung dịch còn lại vào trong cột lọc. Ly tâm ở
gia tốc 8000g trong 1 min.
Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới,
chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới.
Rửa lần 1: Cho 700 μl dung dịch RW1
vào cột lọc. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.
Vứt bỏ phần ống thu dung dịch
ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới.
Rửa lần 2: Cho 500 μl dung dịch RPE
vào cột lọc, ly tâm ở
gia tốc 8000g trong 1 min. Đổ bỏ phần dung dịch ở dưới, giữ lại ống thu,
cho tiếp 500μl dung dịch RPE vào cột lọc, ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1
min.
Đặt cột lọc vào ống thu mới. Ly tâm cột
lọc ở gia tốc 14 000g trong 2 min.
Thu ARN: Chuyển cột lọc sang ống giữ mẫu
1,5 ml mới. Cho 50 μl nước không chứa nuclease vào cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ
phòng. Ly tâm 1 min ở gia tốc lớn hơn 10 000g.
Chuyển mẫu ARN đã thu sang ống giữ mẫu
1,5 ml mới.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.2. Tiến hành phản ứng rRT-PCR
a) Tiến hành pha master mix
Áp dụng với Kít Qiagen one-step RT-PCR và Kít
Invitrogen SS3 qRT-PCR.
Master mix được chuẩn bị theo hướng dẫn
của nhà sản xuất kít như sau:
Qiagen
one-step RT-PCR kít
Invitrogen
SS3 qRT-PCR kít
Nguyên liệu
Thể tích (μl)
Nguyên liệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
H2O
10,5
H2O
4,5
Dung dịch đệm 5x
5,0
Dung dịch đệm 2x
12,5
MgCI2 25 mM
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
MgCI2 50 mM
1,0
dNTP
0,8
PPP (mồi ngược, mồi xuôi và mẫu dò)
1,5
PPP (mồi ngược, mồi xuôi
và mẫu dò)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Enzym
1,0
Enzym
0,5
Sau khi chuẩn bị xong master mix:
- Cho 20 μl master mix vào ống PCR.
- Cho 5 μl mẫu ARN vào ống PCR.
- Đặt ống PCR vào máy nhân gen
real-time PCR machine (xem 4.11).
- Chạy chương trình.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
b) Chạy phản ứng
Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng được cài đặt
trên máy nhân gen (xem 4.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít sử dụng trong
phản ứng. Đối với kít Qiagen one-step RT-PCR và Invitrogen superscript3 qRT-
PCR, chu kỳ nhiệt cài đặt như sau:
Qiagen
one-step RT-PCR Kít
Invitrogen
superscript 3 qRT-PCR Kít
RT
PCR
RT
PCR
50 °C, 30 min;
95 °C, 15 min
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
50 °C, 15 min;
95 °C, 2 min
Chu trình
40 vòng (95 °C, 10 s + 60
°C, 50 s)
B.3. Đánh giá kết
quả
Kết quà chạy rRT - PCR được công nhận
khi:
- Đối chứng dương tính cho giá trị Ct
đã biết (± 2).
- Đối chứng âm tính không có Ct.
- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct
≤ 35.
- Mẫu được coi là âm tính nếu không có
Ct.
- Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct
>35, trường hợp này phải xét nghiệm lại hoặc dùng phương pháp khác (phân lập
vi rút) để khẳng định.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PHỤ LỤC
C
(Quy định)
Phương pháp tạo và nuôi cấy tế bào sơ cấp
đại thực bào phổi lợn PAM (Porcine alveolar
macrophages)
C.1. Chuẩn bị
- Lợn con khỏe mạnh dưới 8 tuần tuổi,
thuộc đàn miễn nhiễm với bệnh PRRS hoặc là lợn SPF.
- Dung dịch PBS pH 7,2 (xem phụ lục A)
chứa 1 % dung dịch
kháng khuẩn (xem phụ lục A).
- Dung dịch trypsin 0,25 % (pha loãng
2 lần Trypsin 0,5 % với PBS pH 7,2).
- Môi trường tế bào MEM và FCS.
- Dao, panh, kéo, chai thủy tinh vô
trùng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Mổ lợn, tiến hành lấy phổi lợn một
cách vô trùng (chú ý không được làm rách phổi). Sau đó tiến hành
các bước để thu hoạch tế bào PAM trong buồng cấy an toàn sinh học cấp 2 (xem
4.4).
- Rửa phổi lợn bằng cách đổ
dung dịch PBS pH 7,2 có chứa 1 % dung dịch kháng khuẩn với lượng 200 ml/lần vào
ống khí quản,
dùng tay bóp nhẹ phổi để rửa. Sau đó dốc ngược phổi vào chai thủy tinh vô trùng
để thu lại toàn bộ phần nước rửa phổi này.
- Tiến hành rửa phổi lợn 3 lần.
- Các lần rửa phổi phải được tiến hành
cẩn thận và vô
trùng.
- Sau 3 lần rửa phổi vô trùng sẽ thu
hoạch được nước rửa phổi có chứa tế bào đại thực bào PAM trong chai thủy tinh
vô trùng.
- Chuyển toàn bộ phần dung dịch rửa phổi
có chứa tế bào thu được sang ống ly tâm 50 ml vô trùng, ly tâm ở gia tốc 1500g
trong 10 min.
-Đổ bỏ phần nước trên, giữ lại phần tế bào sơ cấp
PAM lắng ở đáy ống ly tâm, rửa và ly tâm 1 lần nữa với dung dịch PBS.
- Pha loãng tế bào với môi trường phát
triển MEM có 10 % FCS (xem phụ lục A) và đếm tế bào để được lượng tế bào cần thiết
tối thiểu là 4 x 107
tế bào/1 ml.
- Chuẩn bị môi trường phát triển MEM
có 10 % FCS (xem phụ lục A), chia vào các chai nuôi tế bào với lượng cần thiết
(20 ml trên chai 75 cm2, 10 ml trên chai 25 cm2). Sau đó
dùng pipet chuyển dung dịch môi trường có chứa tế bào ở trên vào các chai với
lượng 5ml trên chai 75 cm2, 3 ml trên chai 25 cm2.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Sau đó nuối ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO2. Sau 1 ngày
đến 2 ngày đổ bỏ môi trường cũ, rửa sạch thảm tế bào bằng dung dịch PBS, cho tiếp
môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS mới vào nuôi tiếp. Khi tế bào mọc đạt từ 80 % đến
90 % thì có thể sử dụng.
C.3. Chuyển đời tế bào
- Hút bỏ môi trường phát triển cũ
trong chai 75 cm2, cho 20 ml dung dịch PBS vào để rửa sạch lớp tế
bào sau đó hút bỏ dung dịch rửa này đi.
- Cho 5 ml dung dịch Trypsin 0,1 % vào
và ủ ở 37 °C trong 2 min
đến 5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ vào thành
chai nuôi cấy để tế bào bong ra hết.
- Cho thêm 10 ml môi trường phát triển
tế bào MEM có 5 % FCS (xem phụ lục A) (huyết thanh trong môi trường phát triển tế bào
sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm 50 ml.
- Ly tâm ở gia tốc 1500 g trong
5 min.
- Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế
bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS
vào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút lên và hút xuống.
- Chia đều dung dịch chứa tế bào này
sang các chai nuôi cấy có chứa môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS mới
với lượng 5 x 104 tế bào/ml. Ủ đĩa ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO2, từ 5 ngày đến
7 ngày. Theo dõi tế bào phát triển hàng ngày và loại bỏ ngay những chai tế bào
bị nhiễm khuẩn.
- Chuyển đời tế bào theo tỷ lệ 1:5. Lượng
tế bào từ 1 chai 75 cm2 đạt 100 % diện tích nuôi cấy có thể chuyển đời
sang 5 chai 75 cm2 khác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.4. Đông lạnh tế
bào
- Hút bỏ môi trường cũ, thêm 20 ml
dung dịch PBS để rửa lớp tế bào, sau đó hút bỏ dung dịch rửa này.
- Cho 5 ml dung dịch Trypsin 0,1 % vào
và ủ ở 37 °C trong 2 min
đến 5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ
nhẹ vào thành chai nuôi cấy để tế bào bong ra.
- Cho thêm 10 ml môi trường phát triển
tế bào MEM 5 % FCS (xem phụ lục A) (huyết thanh trong môi trường phát
triển tế bào sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm
50 ml.
- Ly tâm ở gia tốc 1500g trong
5 min.
- Đổ bỏ phần dung dịch nổi, hòa phần tế bào lắng cặn
trong 4 ml môi trường cất giữ tế bào (xem phụ lục A) và dùng pipet trộn đều nhẹ
bằng cách hút nhả nhiều lần (tránh bọt).
- Chuyển 4 ml dung dịch tế bào trên
vào ống đông lạnh cryo
(4,5 ml). Bọc ống đông lạnh trong bông vô trùng hoặc giấy vô trùng để làm chậm
quá trình đông lạnh.
Đặt ống đông lạnh vào tủ âm có
nhiệt độ 50 °C đến -90 °C qua đêm, sau đó
chuyển vào giữ ở nitơ lỏng.
C.5. Khôi phục tế
bào
- Lấy ống tế bào được bảo quản đông lạnh
trong nitơ lỏng ra và rã đông nhanh chóng bằng cách đặt vào nước ấm 35 °C đến 39 °C trong 1 min.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Khi tế bào đã rã đông, nhanh chóng
dùng pipet hút dung dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml và cho tiếp vào 10 ml môi
trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS, trộn đều bằng pipet hút lên, hút xuống
nhẹ nhàng để
tránh bọt.
- Ly tâm ở gia tốc 1500 g trong
5 min.
- Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế
bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 2 ml môi trường phát triển tế bào MEM 10 % FCS
vào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút lên và hút xuống.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này
vào chai nuôi tế bào 25 cm2 chứa 10 ml môi trường phát triển tế bào
MEM có 10 % FCS. Ủ ở tủ ấm 37
°C chứa 5 % CO2.
- Qua một ngày, đổ bỏ môi trường cũ để
loại nốt DMSO (Dimethylsulfoxide), rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường
phát triển tế bào mới MEM có 5 % FCS vào. Ủ ở tủ ấm 37
°C có 5 % CO2 để tế báo
phát triển.
PHỤ LỤC
D
(Tham khảo)
Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PRRS
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nếu sử dụng bộ kit chẩn đoán PRRS-HERDCHECK
X3 của IDEXX thì các bước tiến
hành được thực hiện như sau:
- Bước 1: Chuẩn bị bộ kit: số mẫu
huyết thanh cần kiểm tra (xem 5.2.3.1) + 02 đối chứng dương + 02 đối
chứng âm.
- Bước 2: Pha loãng mẫu huyết thanh cần
kiểm tra với tỷ lệ 1/40: 10 μl mẫu kiểm tra + 390 μl dung dịch pha loãng mẫu
trong ống pha loãng. Sau đó chuyển 100 μl dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng
sang đĩa ELISA với sơ đồ bố trí mẫu tương ứng.
* Nhỏ 100 μl đối chứng âm và đối chứng
dương (không pha loãng) vào đĩa ELISA theo vị trí bố trí.
- Bước 3: Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp. Ủ ở nhiệt
độ phòng trong 30 min.
- Bước 4: Pha nước rửa đĩa 1X từ dung
dịch rửa đĩa 10X có sẵn
trong bộ kit với nước cất.
- Bước 5: Sau 30 min ủ đĩa, đổ bỏ
dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với
lượng 300 μl/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X.
- Bước 6: Nhỏ 100 μl chất gắn kết (conjugate) vào tất
cả các giếng. Ủ tiếp đĩa ở nhiệt độ
phòng trong 30 min.
- Bước 7: Sau đó đổ bỏ dung dịch trong
đĩa, rửa đĩa 3
lần với lượng 300 μl/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Bước 9: Dừng phản ứng bằng cách cho
100 μl dung dịch stop vào các giếng.
- Bước 10: Đọc đĩa ở bước sóng 650 nm
và tính kết quả.
Phản ứng được công nhận khi:
+ OD của đối chứng âm ≤ 0,15
+ OD của đối chứng dương
- OD của đối chứng âm ≥ 0,15
S/P = (OD của mẫu
-
OD
của đối chứng
âm)/(OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm)
Đánh giá kết quả:
+ mẫu dương tính: S/P không nhỏ
hơn 0,4.
+ mẫu âm tính: S/P nhỏ hơn 0,4.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
2
3
4
5
6
7
8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10
11
12
A
ĐC(-)
S4
S11
S18
S25
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S39
S46
S53
S60
S67
S74
B
ĐC(-)
S5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S19
S26
S33
S40
S47
S54
S61
S68
S75
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
ĐC(+)
S6
S13
S20
S27
S34
S41
S48
S55
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S69
S76
D
ĐC(+)
S7
S14
S21
S28
S35
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S49
S56
S63
S70
S77
E
S1
S8
S15
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S29
S36
S43
S50
S57
S64
S71
S78
F
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S9
S16
S23
S30
S37
S44
S51
S58
S65
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S79
G
S3
S10
S17
S24
S31
S38
S45
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
S59
S66
S73
S80
CHÚ THÍCH: - ĐC (-): mẫu đối chứng âm.
- ĐC (+): mẫu đối chứng dương.
- S1, S2, S3,…,S80: mẫu huyết thanh cần kiểm tra số 1, số 2, số 3.... đến mẫu số 80.
PHỤ LỤC
E
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí
nghiệm (TCID50) của Reed Muench
Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế
bào thí nghiệm (TCID50) của Reed Muench:
TCID50 = 10x
Với X được tính như sau: 
Trong đó:
A là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát trên
50 %, tính bằng phần trăm (%).
B là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát dưới
50 %, tính bằng phần
trăm (%).
a là nồng độ pha loãng vi rút tại A (lấy giá trị số
mũ),
b là nồng độ pha loãng vi
rút tại B (lấy giá trị số mũ).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong 100 μl dung dịch pha loãng vi rút
nhiễm vào mỗi giếng có:
Vậy TCID50 là: 107,68/ 100l μl
dung dịch pha loãng vi rút.
CHÚ THÍCH: Cách tính liều
gây chết 50 % trứng thí nghiệm (EID50) hay liều
gây chết 50 % động vật thí nghiệm (LD50) cũng tương
tự như trên.
THƯ MỤC TÀI
LIỆU THAM KHẢO
[1] O.I.E., 2010, Manual of
Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Porcine Reproductive
and Respiratory syndrome, chapter 2.8.7.
[2] Bộ Nông nghiệp và PTNT - Viện Thú
y Quốc gia - Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản JICA (2002). Hội chứng
rối loạn sinh sản hô hấp.
Trong Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn
về các bệnh gia súc ở Việt Nam (trang 102-103).
Đã cập nhật Luật Đất đai 2024 mới nhất