Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4830-2:2005 Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ

5.3.2.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan fibrinogen bovin trong nước ở điều kiện vô trùng ngay trước khi sử dụng.

5.3.2.3 Dung dịch ức chế tripsin và huyết tương thỏ

5.3.2.3.1 Thành phần

Huyết tương thỏ có EDTA dùng cho coagulase (huyết tương coagulase EDTA)

30 ml

Chất ức chế trypsin

30 mg

5.3.2.3.2 Chuẩn bị

...

...

...

5.3.3 Môi trường hoàn chỉnh

5.3.3.1 Thành phần

Môi trường cơ bản (5.3.1)

90 ml

Dung dịch kali telurit (5.3.2.1)

0,25 ml

Dung dịch fibrinogen bovin (5.3.2.2)

7,5 ml

Dung dịch ức chế tripsin và huyết tương thỏ (5.3.2.3)

...

...

...

5.3.3.2 Chuẩn bị

Làm tan chảy môi truờng cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thuỷ (6.3) đến khoảng 48 ^oC ± 1 ^oC.

Dưới các điều kiện vô trùng, thêm ba dung dịch còn lại đã được làm ấm trước đến 48 ^oC ± 1 ^oC trong nồi cách thuỷ. Trộn kỹ sau mỗi lần thêm bằng cách xoay tròn để hạn chế tối đa việc tạo bọt.

Sử dụng môi trường hoàn chỉnh ngay sau khi chuẩn bị, để tránh việc tạo kết tủa của huyết tương.

CẢNH BÁO - Nếu sử dụng dung dịch bovin fibrinogen/ huyết tương thỏ bán sẵn, thì tuân thủ nghiêm ngặt các chỉ dẫn của nhà sản xuất khi chuẩn bị dung dịch này và môi trường hoàn chỉnh (đặc biệt là nhiệt độ của môi trường cơ bản). Ngược lại, có thể làm mất hoàn toàn hoạt tính môi trường.

5.4 Chuẩn bị các đĩa thạch

Xem 5.3.4 của TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1 : 1999).

6 Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các thiết bị dùng một lần thay cho dụng cụ thuỷ tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.

...

...

...

6.1 Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

6.2 Tủ ấm, để duy trì nhiệt độ của môi trường đã cấy, các đĩa và ống trong dải nhiệt độ 35 ^oC ± 1 ^oC hoặc 37 ^oC ± 1 ^oC.

6.3 Nồi cách thuỷ, hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì được ở nhiệt độ 48 ^oC ± 1 ^oC.

6.4 Đĩa Petri, vô trùng, bằng thuỷ tinh hoặc chất dẻo.

6.5 Pipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml, 0,1 ml và 0,5 ml tương ứng.

7 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, thì các bên có liên quan tự thoả thuận về vấn đề này.

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình bảo quản hoặc vận chuyển.

...

...

...

Việc chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng, thì các bên có liên quan tự thoả thuận về vấn đề này.

9 Cách tiến hành

9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm liên quan.

9.2 Cấy và ủ

9.2.1 Lấy 2 đĩa Petri vô trùng (6.4). Dùng pipet vô trùng (6.5) chuyển vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử sản phẩm dạng lỏng, hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác. Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác và chuyển vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất.

Lặp lại trình tự này với các độ pha loãng liên tiếp, sử dụng pipet mới vô trùng đối với mỗi dung dịch pha loãng thập phân.

9.2.2 Rót ngay vào từng đĩa Petri (9.2.1) môi trường hoàn chỉnh vừa chuẩn bị (5.3.3) dày khoảng 3 mm (không giữ môi trường này ở dạng lỏng).

Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để cho đông đặc lại bằng cách đặt đĩa Petri lên trên mặt phẳng nằm ngang.

...

...

...

9.3 Đếm khuẩn lạc

Sau khi kết thúc giai đoạn ủ (xem 9.2.3), staphylococci hình thành khuẩn lạc nhỏ màu đen hoặc màu xám hoặc thậm chí màu trắng được bao quanh bởi vòng sáng kết tủa dấu hiệu cho hoạt tính coagulase. Khi bắt đầu ủ, các khuẩn lạc Proteus có thể cho thấy vẻ bên ngoài giống với các khuẩn lạc staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase. Tuy nhiên, sau khi ủ 24 h hoặc 48 h, chúng có thể phát triển thành khuẩn lạc mọc rộng có màu nâu đậm hoặc nâu nhạt do đó có thể phân biệt được với vi khuẩn staphyloccocci.

Đếm các khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa.

CHÚ THÍCH: Vì thạch fibrinogen huyết tương thỏ được dựa vào phản ứng coagulase, nên không cần thử khẳng định hoạt tính này.

10 Biểu thị kết quả

10.1 Trường hợp chung

Chọn các đĩa chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 100 khuẩn lạc điển hình ở hai độ pha loãng liên tiếp. Mỗi đĩa chứa ít nhất 15 khuẩn lạc điển hình.

Tính số lượng N staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase có trong một mililit hoặc trong một gam sản phẩm là số trung bình của hai độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức sau:

N =

...

...

...

å_C là tổng số các khuẩn lạc staphylococcal điển hình trên tất cả các đĩa đã chọn;

V là thể tích chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n₁ là số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng),

Làm tròn các kết quả tính được đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Lấy kết quả là số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm ở dạng khác), được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10^x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10.

VÍ DỤ

Số đếm của sản phẩm sau khi cấy 0,1 ml sản phẩm cho các kết quả sau:

...

...

...

- Đối với độ pha loãng thứ hai đã chọn (10^-3): 4 khuẩn lạc điển hình và 7 khuẩn lạc điển hình.

N = 5 955

Kết quả sau khi được làm tròn là 6,0 x 10³.

10.2 Ước tính các số lượng nhỏ

10.2.1 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (nếu các sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (nếu các sản phẩm ở dạng khác), mỗi đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc thì báo cáo các kết quả như sau:

a) Đối với các sản phẩm dạng lỏng, số staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được ước tính trong một mililit:

N =

trong đó: C là tổng số các khuẩn lạc staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đếm được (9.3) trên hai đĩa đã chọn:

b) Đối với các sản phẩm ở dạng khác, staphylococci có phản ứng dương tinh với coagulase được ước tính trong một gam:

...

...

...

trong đó

C là tổng số các khuẩn lạc staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đếm được (9.3) trên hai đĩa đã chọn

d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.

10.2.2 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không chứa bất kỳ một khuẩn lạc staphylococcal nào có phản ứng dương tính với coagulase thì báo cáo kết quả như sau:

- Ít hơn 1 staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 mililit (sản phẩm dạng lỏng);

- Ít hơn 1/d staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.

11 Độ chụm

11.1 Yêu cầu chung

Độ chụm của các phương pháp định lượng có thể được biểu thị theo các thuật ngữ về độ lặp lại và độ tái lập, và được định nghĩa trong TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Tuy nhiên phương pháp tính được sử dụng trong TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) dựa vào trung bình không phải bao giờ cũng thích hợp cho các phép phân tích vi sinh vật, mà không phải lúc nào cũng cho sự phân bố chuẩn (Gaussian). Do đó ISO 16140 đã được xây dựng riêng cho các phương pháp phân tích vi sinh vật và trong tiêu chuẩn này sử dụng các bộ ước tính để tính độ lặp lại và độ tái lập. Các phép thống kê này có ưu điểm là ít nhạy đối với các giá trị cực điểm, nên loại trừ được các giá trị ngoại lai bằng các phép thống kê. Do đó các bộ ước tính này được sử dụng trong tiêu chuẩn.

...

...

...

11.2 Độ lặp lại

11.2.1 Giới hạn về độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả (được chuyển về log₁₀) của hai phép thử độc lập đơn lẻ (số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam hoặc trong một mililit) hoặc tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn của hai kết quả thử nghiệm trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùng phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị tiến hành trong khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại (r).

11.2.2 Các giá trị tổng thể

Để biểu thị chung của giới hạn lặp lại (r), các giá trị sau có thể được sử dụng khi kiểm tra các mẫu thực phẩm nói chung. Các giá trị r này là các giá trị trung bình của tất cả các mẫu được xem xét:

r = 0,22 (được biểu thị theo chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển về log₁₀), hoặc

r = 1,7 (được biểu thị theo tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn trên thang danh định).

Đối với các vật liệu chuẩn (các viên nang chứa khoảng 5 000 CFU, xem phụ lục A), các giá trị sau đây có thể được sử dụng:

r = 0,17 (được biểu thị theo chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log₁₀), hoặc

...

...

...

VÍ DỤ: Kết quả thử nghiệm thứ nhất là 10 000 hoặc 1,0 x 10⁴ staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase có trong một gam thực thẩm. Dưới các điều kiện lặp lại, tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn không được lớn hơn 1,7. Do đó, kết quả thứ hai phải từ 5 882 (= 10 000/1,7) đến 17 000 (310 000 x 1,7) staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam.

11.3 Độ tái lập

11.3.1 Giới hạn tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả (được chuyển về log₁₀) của hai phép thử độc lập (số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 gam hoặc trong 1 mililit) hoặc tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn của hai kết quả thử nghiệm trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên cùng vât liệu thử nghiệm tiến hành trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập (R).

11.3.2 Các giá trị tổng thể

Để biểu thị chung của giới hạn tái lập (R). các giá trị sau đây có thể được sử dụng khi kiểm tra các mẫu thực phẩm nói chung. Các giá trị R này là các trung trình của tất cả các mẫu.

R = 0,33 (được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log₁₀), hoặc

R = 2,2 (được biểu thị theo tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn trên thang danh định).

Đối với các vật liệu chuẩn (viên nang chứa khoảng 5 000 CFU, xem phụ lục A) các giá trị sau đây có thể được sử dụng:

...

...

...

R = 2,0 (được biểu thị theo tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn của hai kết quả thử trên thang danh định).

VÍ DỤ 1: Kết quả thu được trong thử nghiệm thứ nhất là 1,0 X 10⁴ staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam sản phẩm thực phẩm. Dưới các điều kiện tái lập, thì tỷ số giữa kết quả thu được trong phòng thử nghiệm thứ nhất và phòng thử nghiệm thứ hai không được lớn hơn 2,2. Do đó, kết quả của phòng thử nghiệm thứ hai phải nằm trong khoảng từ 4,5 x 10³ (=1,0 x 10⁴/2,2) đến 2,2 x 10⁴ (=1,0 x 10⁴ x 2,2) staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam.

VÍ DỤ 2: Một phòng thử nghiệm muốn biết mức tối đa để có thể thấy rằng vẫn còn phù hợp với giới hạn đã định (ví dụ giới hạn 10⁵ hoặc log₁₀5). Về điều này, giá trị R (trên thang danh định) cần phải nhân với hệ số 0,59. Giá trị 0,19 (0,33 x 0,59) là chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm chuyển sang log₁₀ hoặc 10^0,19. Do đó, các kết quả đến log₁₀ 5,19 (log₁₀ 5 + log₁₀ 0,19) hoặc 1,55 x 10⁵ không cho thấy sự không phù hợp với giới hạn. Hệ số 0,59 phản ánh thực tế rằng phép thử có khoảng lệch 95 % được dùng để thử nghiệm cho dù giới hạn đã bị vượt quá. Hệ số 0,59 thu được bằng công thức sau:

0,59 =

12 Báo cáo kết quả

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

- Tất cả thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

- Mọi chi tiết không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc xem như tuỳ ý lựa chọn, cũng như bất kỳ chi tiết bất thường mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử:

- Các kết quả thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Các kết quả của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm quốc tế được tổ chức bởi Phòng thử nghiệm về Nghiên cứu Chất lượng và Vệ sinh thực phẩm (LERHQA) của cơ quan An toàn thực phẩm Pháp (AFSSA) vào năm 1999 trong khuôn khổ của dự án Châu Âu SMT CT 96 2098 (xem tài liệu tham khảo [7]). Nghiên cứu này gồm có 24 phòng thử nghiệm của 16 nước Châu Âu tham gia và đã tiến hành trên phomát, thịt, bột trứng và các vật liệu chuẩn. Các mẫu thực phẩm mỗi loại được thử nghiệm ở ba mức nhiễm bẩn staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase khác nhau và có kiểm tra âm tính.

Dữ liệu về độ chụm nhận được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm này đề cập đến từng loại mẫu trong bảng từ A.1 đến A.4. Chúng được tính sử dụng kỹ thuật thống kê như mô tả trong ISO 16140. Dữ liệu thu được bởi một số các phòng thử nghiệm đã không đưa vào tính toán khi cho thấy sai lệch khỏi thủ tục nghiên cứu qui định.

Bảng A.1 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu phomát

...

...

...

Pho mát mức thấp

Pho mát mức trung bình

Pho mát mức cao

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

19

19

19

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

2

...

...

...

2

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

18

18

18

Số lượng mẫu được chấp nhận

36

36

36

...

...

...

3,25

5,03

6,00

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r (log₁₀ CFU/g)

0,09

0,04

0,06

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)

2,74

...

...

...

0,98

Giới hạn lặp lại (r), theo chênh lệch trên thang log₁₀ (log₁₀ CFU/g)

0,25

0,13

0,17

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R (log₁₀ CFU/g)

0,09

0,12

0,11

...

...

...

2,94

2,33

1,91

Giới hạn tái lập (R) theo chênh lệch trên thang log₁₀ (log₁₀ CFU/g)

0,27

0,33

0,32

Bảng A.2 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu thịt

Mẫu/mức nhiễm bẩn

...

...

...

Thịt mức trung bình

Thịt mức cao

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

20

20

20

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

2

2

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

17

17

17

Số lượng mẫu được chấp nhận

34

34

34

Giá trị trung bình (log₁₀ CFU/g)

...

...

...

4,13

6,08

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r (log₁₀ CFU/g)

0,09

0,07

0,07

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)

2,85

1,79

...

...

...

Giới hạn lặp lại (r), theo chênh lệch trên thang log₁₀ (log₁₀ CFU/g)

0,25

0,21

0,21

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R (log₁₀ CFU/g)

0,11

0,10

0,12

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)

...

...

...

2,38

1,96

Giới hạn tái lập (R), theo chênh lệch trên thang log₁₀ (log₁₀ CFU/g)

0,32

0,28

0,33

Bảng A.3 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu bột trứng

Mẫu/mức nhiễm bẩn

Bột trứng mức thấp

...

...

...

Bột trứng mức cao

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

20

20

20

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

2

2

2

...

...

...

19

19

19

Số lượng mẫu được chấp nhận

38

38

38

Giá trị trung bình (log₁₀ CFU/g)

3,25

...

...

...

5,32

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r (log₁₀ CFU/g)

0,12

0,06

0,09

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)

3,66

1,41

1,68

...

...

...

0,33

0,17

0,25

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R (log₁₀ CFU/g)

0,14

0,11

0,14

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)

4,20

...

...

...

2,64

Giới hạn tái lập (R). theo chênh lệch trên thang log₁₀ (log₁₀ CFU/g)

0,38

0,32

0,39

Bảng A.4 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các vật liệu chuẩn

Mẫu/mức nhiễm bẩn

Vật liệu chuẩn

(các viên nang chứa khoảng 5 000

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

20

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

2

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

19

Số lượng mẫu được chấp nhận

38

Giá trị trung bình (log₁₀ CFU/g)

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r (log₁₀ CFU/g)

0,06

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%)

1,52

Giới hạn lặp lại (r), theo chênh lệch trên thang log₁₀ (log₁₀ CFU/g)

0,17

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R (log₁₀ CFU/g)

0,11

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%)

...

...

...

Giới hạn tái lập (R), theo chênh lệch trên thang log₁₀ (log₁₀ CFU/g)

0,31

a Vật liệu chuẩn được sản xuất bởi RIVM, Netherlands.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] KLOOS W.E. Systematic and the natural history of staphylococci. In: Staphylococci, J. Appl. Bacteriol. Symp. Suppl., 69, 1990, pp. 25 s - 37 s; and Bergey's manual of determination bacteriology, 9^th edn. , 1994.

[2] IDF 145 A : 1997, Milk and milk products - Enumeration of coagulase - positive staphylococci staphylococci - Colony-count technique.

[3] BECKERS H.L. et. , Evaluation of a pour-plate system with rabit plasma-bovine fibrinogen agar for the enumeration of Staphylococcus aureus in food. Can. J. Microbiol. , 30, 1984. pp. 470-474.

[4] SAWHNEY D, The toxicity of potassium tellurite to Staphylococcus aureus in rabit plasma fibrinogen agar, J. Applied Bacteriology, 61,1986, pp.149 - 155.

...

...

...

[6] ISO 16140, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of altemative methods.

[7] DE BUYSER, M.L., LOMBARD, B., SHULTEN, S.M., IN’T VELD, P.H., SCOTTER, S.L., ROLLIER, R., LAHELLEC, C. Tính hiệu lực của TCVN 4830-1 và TCVN 4830-2. Int. J. Food Microbiol., 83 (2), 2003, pp. 185- 194.