Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về
Các bản dự thảo

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6404:2016 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Số hiệu:	TCVN6404:2016	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2016	Ngày hiệu lực:
ICS:	07.100.30	Tình trạng:	Đã biết

Tím tinh thể:

Etanol (95 %):

Amoni oxalat (C₂H₈N₂O₄):

Nước cất:

2,0 g

20 ml

0,8 g

80 ml

12.3.2.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và amoni oxalat trong nước cất. Trộn hai dung dịch này và để yên hỗn hợp 24 h trước khi sử dụng.

12.3.2.3 Dung dịch iôt

12.3.2.3.1 Thành phần

Iôt:

Kali iodua (Kl):

Nước:

1,0 g

2,0 g

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

12.3.2.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan kali iodua trong 10 ml nước cất; thêm từng phần nhỏ iôt. Sau khi hòa tan, thêm nước cho đến vạch mức 100 ml trong bình định mức.

12.3.2.4 Dung dịch safranin

12.3.2.4.1 Thành phần

Safranin:

Etanol (95 %):

Nước:

0,25 g

10 ml

...

12.3.2.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan safranin trong dung dịch etanol sau đó trộn với nước cất.

12.3.3 Kỹ thuật nhuộm

Sau khi đã cố định trên lam kính màng vi khuẩn được chuẩn bị từ dịch cấy từ 18 h đến 24 h, hoặc khi canh thang đã đục, thì phủ lên màng này dung dịch tím tinh thể. Để cho phản ứng xảy ra trong 1 min.

Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài giây.

Phủ lên lam kính dung dịch iôt. Để cho phản ứng xảy ra trong 1 min.

Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài giây.

Rót một cách nhẹ nhàng và liên tục một lớp mỏng dung dịch etanol (95 %) lên lam kính để nghiêng trong khoảng thời gian không quá 30 s cho đến khi không còn màu tím.

Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước để loại etanol. Phủ lên lam kính bằng dung dịch safranin trong 10 s. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước.

...

12.3.4 Diễn giải kết quả

Kiểm tra lam kính dưới vật kính dầu có độ phóng đại cao của kính hiển vi. Các tế bào vi khuẩn có màu xanh lam hoặc màu tím là Gram dương (Gram +); có màu từ hồng thẫm đến đỏ là Gram âm (Gram-).

Đối với chủng thuần khiết của một vài dạng vi khuẩn nhất định, có thể thu được cả tế bào Gram dương và Gram âm trong cùng một trường hiển vi.

CHÚ THÍCH Các tế bào vón đặc có thể cho hình ảnh không đặc trưng.

12.4 Sử dụng bộ thử sinh hóa để nhận biết

Có thể dùng bộ thử sinh hóa có sẵn để nhận biết các khuẩn lạc tách biệt.

Cần kiểm tra xác nhận rằng các bộ thử là thích hợp, như đã được nghiên cứu đánh giá trong các tài liệu khoa học liên quan đến vi sinh vật trong thực phẩm4). Việc kiểm tra này hết sức quan trọng nếu nhà sản xuất không có các số liệu đánh giá về các bộ thử này.

Các phòng thử nghiệm cần phải thu được các chứng chỉ kiểm chứng cho mỗi mẻ với việc chỉ rõ các chủng thử nghiệm.

Nhà sản xuất cũng phải quy định các chủng kiểm chứng rằng các phòng thử nghiệm có thể sử dụng để kiểm tra việc bảo quản hiệu quả của các bộ thử.

...

12.5 Sử dụng các đầu dò nucleic

Có thể dùng các đầu dò nucleic có sẵn để nhận biết các khuẩn lạc tách biệt.

Tuy nhiên, kiểm tra xác nhận rằng các đầu dò nucleic là thích hợp, như đã được nghiên cứu đánh giá trong các tài liệu khoa học liên quan đến vi sinh vật trong thực phẩm (xem ví dụ [23]). Việc kiểm tra này hết sức quan trọng nếu nhà sản xuất không có các số liệu đánh giá về các đầu dò này.

Các phòng thử nghiệm cần phải thu được các chứng chỉ kiểm chứng cho mỗi mẻ với việc chỉ rõ các chủng thử nghiệm.

Nhà sản xuất cũng phải quy định các chủng kiểm chứng rằng các phòng thử nghiệm có thể sử dụng để kiểm tra việc bảo quản hiệu quả của các đầu dò nucleic.

12.6 Phương pháp huyết thanh

12.6.1 Yêu cầu chung

Khi cần thử khẳng định bằng huyết thanh, thì tiến hành sau khi đã nhận dạng bằng sinh hóa các khuẩn lạc tách biệt.

12.6.2 Các phép thử ngưng kết trên lam kính

...

Trước khi dính kết với các kháng huyết thanh, cần thực hiện phép thử để xác định xem các tế bào vi khuẩn có dính kết hay không trong dung dịch natri clorua [3 % (phần khối lượng)]. Nếu các tế bào vi khuẩn có dính kết, thì đó là chủng tự dính kết và không cần phải dính kết với kháng huyết thanh.

Có sẵn hai dạng kháng huyết thanh: kháng huyết thanh đa giá phản ứng với các vi sinh vật thuộc giống đặc hiệu hoặc với các nhóm huyết thanh và thích hợp cho việc sàng lọc sơ bộ và các kháng thể đơn giá, sử dụng để nhận dạng các serovar đặc biệt.

Cần kiểm tra xác nhận rằng các phép thử ngưng kết trên lam kính là thích hợp, như đã được nghiên cứu đánh giá trong các tài liệu khoa học liên quan đến vi sinh vật trong thực phẩm5).

Khi sử dụng các thuốc thử, cần sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính thích hợp.

12.6.3 Phép thử ngưng kết latex

Phương pháp thử nhanh có sẵn trong thương mại, áp dụng các hạt nhựa được phủ các kháng thể nhóm đặc hiệu (ví dụ như Escherichia coli O157, xem TCVN 7686 (ISO 16654) hoặc Staphylococcus aureus xem TCVN 4830 (ISO 6888). Kháng nguyên trong dịch chiết được phân tích theo dải các thuốc thử latex.

Cần kiểm tra xác nhận rằng các phép thử ngưng kết latex là thích hợp, như đã được nghiên cứu đánh giá trong các tài liệu khoa học liên quan đến vi sinh vật trong thực phẩm⁵⁾.

Phòng thử nghiệm cần phải thu được các chứng chỉ kiểm chứng cho mỗi mẻ với việc chỉ rõ các chủng thử nghiệm.

Khi sử dụng các thuốc thử, cần sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính thích hợp.

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp thử đã sử dụng và nhiệt độ ủ ấm, nếu cần và kết quả thu được. Báo cáo thử nghiệm cũng phải ghi rõ mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Nêu rõ trong báo cáo thử nghiệm các phép thử tiếp theo cần được tiến hành trong phòng thử nghiệm chuẩn hoặc nếu các phép thử đó đã được tiến hành, các kết quả thu được.

Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử. Cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để diễn giải các kết quả.

Xác định độ không đảm bảo đo theo ISO/TS 19036, nếu cần, cần được nêu trong báo cáo thử nghiệm.

14 Xác nhận tính hiệu lực của các phương pháp

14.1 Xác nhận tính hiệu lực của các phương pháp chuẩn

Xác nhận tính hiệu lực của các phương pháp chuẩn đang được ISO/TC34/SC 9 nghiên cứu.

14.2 Xác nhận tính hiệu lực của các phương pháp thay thế

Xem ISO 16140-2 về quy trình kỹ thuật để xác nhận tính hiệu lực của các phương pháp thay thế theo phương pháp chuẩn.

...

Xác nhận tính hiệu lực của các phương pháp trong một phòng thử nghiệm đang được ISO/TC34/SC 9 nghiên cứu.

15 Đảm bảo chất lượng các kết quả/kiểm soát chất lượng hiệu quả

15.1 Kiểm soát chất lượng nội bộ

15.1.1 Việc kiểm soát chất lượng nội bộ bao gồm tất cả các quy trình được thực hiện bởi phòng thử nghiệm để đánh giá liên tục công việc của phòng thử nghiệm. Mục tiêu chính là để đảm bảo sự thống nhất của các kết quả theo từng ngày và sự phù hợp với tiêu chí xác định.

15.1.2 Chương trình kiểm tra định kỳ cần chứng minh rằng độ dao động (giữa các người phân tích, giữa các thiết bị và giữa các vật liệu) đều được kiểm soát. Tất cả các phép thử cần nằm trong phạm vi hoạt động của phòng thử nghiệm.

Chương trình có thể bao gồm:

- sử dụng các mẫu đã bổ sung vi sinh vật có các mức nhiễm bẩn khác nhau, kể cả hệ sinh vật nền và hệ mục tiêu;

- sử dụng các mẫu đã bổ sung vi sinh vật/nhiễm bẩn tự nhiên từ dải chất nền;

- sử dụng chất chuẩn (kể cả thử nghiệm thành thạo vật liệu phối hợp);

...

- đánh giá lặp lại các kết quả thử nghiệm.

Khoảng thời gian giữa các lần kiểm tra này bị ảnh hưởng bởi bản chất của phép thử được thực hiện trong phòng thử nghiệm và tần số của các phép thử nghiệm.

Khuyến cáo các phép thử nghiệm nên kết hợp với các phép kiểm chứng để kiểm tra hiệu quả, nếu có thể.

15.1.3 Trong các trường hợp đặc biệt, chỉ hiếm khi phòng thử nghiệm có thể thực hiện phép thử đặc trưng. Người ta cho thấy rằng trong các trường hợp đó, có thể kết hợp chương trình kiểm soát chất lượng nội bộ đang thực hiện và sơ đồ chứng minh hiệu quả thích hợp được tiến hành song song với phép thử có thể thích hợp hơn.

15.2 Các chủng chuẩn

Xem TCVN 8128 (ISO 11133) về việc duy trì các chủng chuẩn.

15.3 Đánh giá chất lượng bên ngoài (thử nghiệm thành thạo)

Các phòng thử nghiệm cần định kỳ tham gia vào các quy trình thử nghiệm thành thạo có liên quan đến phạm vi hoạt động. Cần ưu tiên các sơ đồ kiểm tra hiệu quả sử dụng các chất nền thích hợp.

Các phòng thử nghiệm cần được đánh giá chất lượng từ bên ngoài không chỉ để đánh giá độ lệch của phòng thử nghiệm và còn để kiểm tra tính hiệu lực của hệ thống chất lượng toàn diện của các phòng thử nghiệm.

...

(Tham khảo)

TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ CHẤT TẨY RỬA

Bảng A.1 - Tính chất của một số chất tẩy rửa

Chất tẩy rửa

Tác động chống lại

Khử hoạt tính

Độc tính

Nấm

Vi khuẩn

...

Bào tử

Virut lipid

Vi rút không lipid

Protein

Chất tự nhiên

Chất tổng hợp

Nước cứng

Chất tẩy rửa

...

Phổi

Gram dương

Gram âm

Hypoclorit

+++

...

+++

...

+++

...

Formaldehyt

+++

...

+++^a

...

Glutaraldehyt

+++

+++^b

...

+++

lodopho

+++

...

+++

...

+++ tốt;

++ hợp lý;

+ không đáng kể;

- không có;

V tùy thuộc vào virut;

C cation;

...

NA không thích hợp;

^a trên 40 °C;

^b trên 20 °C;

Nguồn gốc: Tham khảo [17].

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Khoảng tin cậy cho kỹ thuật đếm khuẩn lạc

B.1 Khoảng tin cậy cho kỹ thuật đếm khuẩn lạc

...

Khi giá trị của độ không đảm bảo đo là không có sẵn, thì khoảng tin cậy d đặc trưng cho sự phân tán của vi sinh vật, có thể được tính sử dụng Công thức (B.1) (với xác suất 95 %).

(B.1)

Trong đó:

B = V(n₁+ 0,1 n₂)

Trong đó:

V là thể tích dịch cấy có trong mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);

n₁ là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại;

n₂ là số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại;

∑C là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng liên tiếp;

...

VÍ DỤ 1:

Việc định lượng cho các kết quả (hệ thống một đĩa cho mỗi độ pha loãng) sau đây:

- ở độ pha loãng thứ nhất giữ lại (10^-2): 215 khuẩn lạc;

- ở độ pha loãng thứ hai giữ lại (10^-³): 14 khuẩn lạc.

Làm tròn kết quả theo quy định ở trên, số vi sinh vật đếm được là 21 000 hoặc 2,1 x 10⁴ trên mililit hoặc trên gam sản phẩm.

Với N = 2,1 x 10⁴ trên gam, thì đối với 229 khuẩn lạc đếm được, giới hạn tin cậy b là:

d = (208,18 ± 26,96) × 10²

...

VÍ DỤ 2:

Việc định lượng cho các kết quả (hệ thống hai đĩa cho mỗi độ pha loãng) sau đây:

- ở độ pha loãng thứ nhất glữ lại (10^-2): 168 khuẩn lạc và 215 khuẩn lạc;

- ở độ pha loãng thứ hai giữ lại (10^-3): 14 khuẩn lạc và 25 khuẩn lạc.

Làm tròn kết quả theo quy định ở trên, số vi sinh vật đếm được là 19 000 hoặc 1,9 x 10⁴ trên mililit hoặc trên gam sản phẩm.

Với N = 1,9 × 10⁴ trên gam, thì đối với 422 khuẩn lạc đếm được, giới hạn tin cậy d là:

d = (191,82 ± 18,30) × 10²

...

Bảng B.1 cho các trung bình khối lượng và khoảng tin cậy d đối với số lượng khuẩn lạc có liên quan.

Bảng B.1 - Giá trị trung bình khối lượng và khoảng tin cậy d đối với số lượng khuẩn lạc có liên quan

Giá trị trung bình khối lượng của số khuẩn lạc đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp

Hệ thống “1 đĩa cho một độ pha loãng”

Khoảng tin cậy d

Hệ thống “2 đĩa cho một độ pha loãng”

Khoảng tin cậy d

300

268 đến 332

...

150

127 đến 173

134 đến 166

100

81 đến 119

87 đến 113

20 đến 40

23 đến 37

...

7 đến 22

10 đến 20

4 đến 16

6 đến 14

Khônq áp dụng

3 đến 10

B.2 Các trường hợp đặc biệt với số đếm thấp

...

Bảng B.2 - Khoảng tin cậy đối với việc định lượng với hệ thống “một đĩa cho mỗi độ pha loãng”, trường hợp số đếm thấp trên một đĩa đơn

Số đếm khuẩn lạc^a

Giới hạn tin cậy ở mức tin cậy xấp xỉ 95%^b

Phần trăm giới hạn tin cậy

Giới hạn dưới

Giới hạn trên

...

± 139

± 113

...

± 98

± 88

...

± 74

± 69

...

± 65

± 62

...

± 57

± 54

...

± 52

± 51

^a Số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa ở một độ pha loãng.

^b được so sánh với số lượng vi sinh vật tính được và giả sử rằng số đếm được thực hiện trên một đĩa ở một độ pha loãng.

Bảng B.3 - Khoảng tin cậy đối với việc định lượng với hệ thống “một đĩa cho một độ pha loãng”, trường hợp số đếm thấp trên hai đĩa đơn ở hai độ pha loãng

...

Số đếm vi sinh vật^b

Giới hạn tin cậy ở mức tin cậy xấp xỉ 95% ^c

Phần trăm giới hạn tin cậy

Giới hạn dưới

Giới hạn trên

NA^d

...

± 62

...

± 57

...

± 52

...

^a là số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa Petri ở hai độ pha loãng liên tiếp.

^b là số đếm trung bình từ hai đĩa Petri;

^c được so sánh với số lượng vi sinh vật tính được và giả sử rằng số đếm được thực hiện trên một đĩa với hai độ pha loãng;

^d Không có kết quả: không tính được số đếm trung bình.

Bảng B.4 - Khoảng tin cậy đối với việc định lượng với hệ thống “hai đĩa cho một độ pha loãng”, trường hợp trên hai đĩa ở một độ pha loãng cho số đếm thấp

Số đếm khuẩn lạc^a

Số đếm vi sinh vật^b

Giới hạn tin cậy ở mức xấp xỉ 95%^c

Phần trăm giới hạn tin cậy

...

Giới hạn trên

± 196

...

± 139

± 113

...

± 98

± 88

...

± 80

± 74

...

± 69

± 65

...

± 62

± 59

...

± 57

± 54

...

± 52

± 51

...

± 49

± 48

...

± 46

± 45

...

± 44

± 43

...

± 42

± 41

...

± 40

± 39

...

± 38

...

± 37

± 36

...

± 36

^a là số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa Petri ở một độ pha loãng.

^b là số đếm trung bình từ hai đĩa Petri;

^c được so sánh với số lượng vi sinh vật tính được và giả sử rằng số đếm được thực hiện trên hai đĩa ở một độ pha loãng.

Bảng B.5 - Khoảng tin cậy đối với việc định lượng với hệ thống “hai đĩa cho một độ pha loãng”, trường hợp trên hai đĩa ở hai độ pha loãng cho số đếm thấp

Số đếm khuẩn lạc^a

Số đếm vi sinh vật^b

Giới hạn tin cậy ở mức tin cậy xấp xỉ 95 %^c

Phần trăm giới hạn tin cậy

...

Giới hạn trên

NA^d

...

± 57

± 54

...

± 52

± 51

...

± 49

± 48

...

± 46

± 45

...

± 44

± 43

...

± 42

± 41

...

± 40

± 39

...

± 38

...

± 37

± 36

...

± 36

^a là số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa Petri ở hai độ pha loãng liên tiếp.

^b là số đếm trung bình từ hai đĩa Petri;

^c được so sánh với số lượng vi sinh vật tính được và giả sử rằng số đếm được thực hiện trên hai đĩa với hai độ pha loãng;

a không có kết quả: không tính được số đếm trung bình.

NA: không áp dụng.

PHỤ LỤC C

(Quy định)

...

Bảng C.1 - Các giá trị MPN trên phần mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 % đối với dãy 10 ống, được tính theo Tài liệu tham khảo [29]

Số ống dương tính

Dây 10 ống

MPN
/ml hoặc/g

Độ không đảm bảo tiêu chuẩn của
log₁₀M

Giới hạn dưới của mức tin cậy 95%

Dưới

Trên

...

0,435

0,02

0,75

0,22

0,308

0,06

0,89

...

0,252

0,11

1,11

0,51

0,220

0,19

1,38

...

0,198

0,28

1,69

0,92

0,184

0,40

2,10

...

0,174

0,55

2,64

1,61

0,171

0,75

3,48

...

0,179

1,03

5,16

Bảng C.2 - Các giá trị MPN trên phần mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 % đối với dãy 15 ống, được tính theo tài liệu tham khảo [29]

Số ống dương tính

Dây 15 ống

MPN
/ml hoặc/g

Độ không đảm bảo tiêu chuẩn của
log₁₀M

Giới hạn dưới của mức tin cậy 95%

...

Trên

0,07

0,434

0,01

0,49

0,14

0,307

...

0,57

0,22

0,251

0,07

0,69

0,31

0,218

...

0,83

0,41

0,196

0,17

0,98

0,51

0,179

...

1,15

0,63

0,167

0,30

1,33

0,76

0,157

...

1,55

0,92

0,150

0,47

1,80

1,10

0,144

...

2,11

1,32

0,141

0,70

2,49

1,61

0,139

...

3,02

2,01

0,142

1,06

3,82

2,71

0,155

...

5,45

Bảng C.3 - Các giá trị MPN trên phần mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 % đối với dãy 20 ống, được tính theo tài liệu tham khảo [29]

Số ống dương tính

Dây 20 ống

MPN
/ml hoặc/g

Độ không đảm bảo têu chuẩn của
log₁₀M

Giới hạn dưới của mức tin cậy 95%

Dưới

Trên

...

0,05

0,434

0,01

0,36

0,11

0,307

0,03

0,42

...

0,16

0,251

0,05

0,50

0,22

0,218

0,08

0,60

...

0,29

0,195

0,12

0,69

0,36

0,178

0,16

0,80

...

0,43

0,165

0,20

0,91

0,51

0,155

0,25

1,03

...

0,59

0,147

0,31

1,16

0,69

0,140

0,37

1,30

...

0,80

0,134

0,44

1,46

0,92

0,130

0,51

1,65

...

1,05

0,126

0,59

1,85

1,20

0,123

0,69

2,10

...

1,39

0,121

0,80

2,40

1,61

0,121

0,93

2,77

...

1,90

0,122

1,09

3,29

2,30

0,127

1,30

4,08

...

3,00

0,141

1,58

5,67

Bảng C.4 - Các giá trị MPN trên phần mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 % đối với dãy 25 ống, được tính theo tài liệu tham khảo [29]

Số ống dương tính

Dãy 25 ống

MPN
/ml hoặc/g

Độ không đảm bảo têu chuẩn của
log₁₀M

...

Dưới

Trên

0,04

0,434

0,01

0,29

0,08

...

0,02

0,33

0,13

0,251

0,04

0,40

0,17

...

0,07

0,47

0,22

0,195

0,09

0,54

0,27

...

0,12

0,61

0,33

0,165

0,16

0,69

0,39

...

0,19

0,77

0,45

0,146

0,23

0,86

0,51

...

0,27

0,96

0,58

0,133

0,32

1,06

0,65

...

0,37

1,16

0,73

0,123

0,42

1,28

0,82

...

0,48

1,41

0,92

0,116

0,54

1,55

1,02

...

0,61

1,70

1,14

0,111

0,69

1,88

1,27

...

0,78

2,09

1,43

0,108

0,88

2,33

1,61

...

0,99

2,62

1,83

0,109

1,12

2,99

2,12

...

1,29

3,50

2,53

0,117

1,49

4,28

3,22

...

1,77

5,85

Bảng C.5 - Các giá trị MPN trên gam mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 %

(sử dụng ba phần mẫu thử 1 g, ba phần mẫu thử 0,1 g và ba phần mẫu thử 0,01 g) Tài liệu tham khảo [56]

Các kết quả dương tính với thể tích chất cấy, ml hoặc g

MPN

/ml hoặc /g

log₁₀M

Độ lệch chuẩn của log₁₀M

...

Chỉ số hiếm

Loại hiếm

Dưới

Trên

1,00

0,10

0,01

...

NA^a

1,1

1,00

...

0,31

-0,51

0,43

0,04

2,3

0,09

...

0,36

-0,44

0,44

0,05

2,7

1,00

...

0,72

-0,14

0,31

0,17

3,0

0,02

...

0,74

-0,13

0,31

0,18

3,1

0,21

...

1,1

0,04

0,26

0,35

3,7

0,02

...

0,92

-0,04

0,32

0,21

4,0

1,00

...

1,4

0,15

0,27

0,42

4,9

0,04

...

1,5

0,18

0,27

0,43

5,0

0,43

...

2,0

0,30

0,24

0,70

6,0

0,02

...

2,1

0,32

0,24

0,71

6,2

0,07

...

2,3

0,36

0,31

0,55

9,7

1,00

...

3,9

0,59

0,31

0,93

0,08

...

4,3

0,63

0,33

0,95

1,00

...

7,5

0,88

0,30

1,9

0,21

...

1,1

0,26

3,6

0,02

...

9,3

0,97

0,32

2,2

1,00

...

1,2

0,27

4,4

0,42

...

1,3

0,24

7,2

0,07

...

1,4

0,32

5,6

100

1,00

...

1,7

0,34

9,6

220

1,00

...

110

2,0

0,12

490

1,00

...

∞

NA^a

∞

1,00

^a không áp dụng.

Bảng C.6 - Các giá trị MPN trên gam mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 %

...

Các kết quả dương tính với thể tích chất cấy, ml hoặc g

MPN

/ml hoặc /g

log₁₀M

Độ lệch chuẩn của log₁₀M

Các giới hạn tin cậy 95%

Chỉ số hiếm

Loại

...

0,01

Dưới

Trên

...

0,66

0,18

-0,74

0,43

...

1,34

0,09

0,20

-0,70

0,44

...

1,47

1,00

0,40

-0,40

0,31

...

1,65

0,02

0,40

-0,39

0,31

...

1,66

0,21

0,61

-0,21

0,25

...

1,96

0,02

0,45

-0,35

0,31

...

1,86

1,00

0,68

-0,17

0,25

...

2,18

0,03

0,68

-0,16

0,25

...

2,2

0,35

0,92

-0,04

0,22

...

2,55

0,02

0,93

-0,03

0,22

...

2,58

0,06

0,78

-0,11

0,26

...

2,54

1,00

1,1

0,03

0,23

...

2,97

0,05

1,1

0,03

0,23

...

3,02

0,57

1,4

0,14

0,20

...

3,48

0,03

1,4

0,14

0,20

...

3,53

0,15

1,7

0,23

0,19

...

4,02

0,13

1,7

0,24

0,19

...

4,09

0,03

1,3

0,11

0,23

...

3,72

1,00

1,7

0,22

0,21

...

4,4

0,08

1,7

0,23

0,21

...

4,5

0,92

2,1

0,33

0,20

...

5,28

0,07

2,2

0,33

0,20

...

5,41

0,31

2,6

0,42

0,19

...

6,31

0,03

2,7

0,43

0,19

...

6,5

0,07

3,4

0,53

0,18

...

7,8

0,01

2,3

0,36

0,24

...

7,0

0,77

3,1

0,50

0,24

...

9,4

0,09

3,3

0,52

0,24

...

1,00

4,6

0,66

0,25

...

0,20

6,3

0,80

0,24

...

0,02

4,9

0,69

0,26

...

1,00

7,0

0,85

0,25

...

0,36

9,4

0,97

0,22

...

0,06

7,9

0,90

0,25

...

1,00

1,0

0,23

...

0,57

1,1

0,20

...

0,15

1,2

0,19

...

0,03

1,1

0,23

...

1,00

1,2

0,21

...

0,94

1,3

0,20

...

0,30

1,4

0,19

...

0,07

1,5

0,18

...

0,01

1,4

0,24

...

0,74

1,5

0,25

...

111

1,00

1,7

0,27

...

187

1,00

2,0

0,26

...

301

1,00

160

2,2

0,24

...

489

1,00

∞

...

∞

1,00

Bảng C,7 - Các giá trị MPN trên gam mẫu thử và các giới hạn tin cậy 95 %

(sử dụng 10 phần mẫu thử 1 g, 10 phần mẫu thử 0,1 g và 10 phần mẫu thử 0,01 g, Tài liệu tham khảo [56])

Các kết quả dương tính với thể tích chất cấy, ml hoặc g

MPN

/ml hoặc /g

log₁₀M

...

Các giới hạn tin cậy 95%

Chỉ số hiếm

Loại

0,1

0,01

Dưới

Trên

...

0,33

1,00

...

0,09

-1

0,43

0,012

0,67

0,09

...

0,09

-1

0,43

0,013

0,7

0,99

...

0,19

-0,72

0,31

0,046

0,78

0,02

...

0,19

-0,72

0,31

0,046

0,78

0,19

...

0,29

-0,54

0,25

0,09

0,91

0,03

...

0,2

-0,7

0,31

0,048

0,82

0,99

...

0,3

-0,52

0,25

0,094

0,95

0,03

...

0,3

-0,52

0,25

0,094

0,95

0,30

...

0,4

-0,4

0,22

0,15

1,1

0,01

...

0,4

-0,4

0,22

0,15

1,1

0,06

...

0,32

-0,5

0,25

0,099

0,99

...

0,42

-0,38

0,22

0,15

1,2

0,04

...

0,42

-0,37

0,22

0,15

1,2

0,43

...

0,53

-0,27

0,2

0,22

1,3

0,02

...

0,53

-0,27

0,2

0,22

1,3

0,11

...

0,65

-0,19

0,18

0,28

1,5

0,02

...

0,45

-0,35

0,22

0,16

1,2

0,99

...

0,56

-0,25

0,2

0,23

1,4

0,06

...

0,56

-0,25

0,2

0,23

1,4

0,58

...

0,68

-0,17

0,18

0,3

1,6

0,04

...

0,68

-0,16

0,18

0,3

1,6

0,19

...

0,8

-0,096

0,17

0,37

1,7

0,02

...

0,81

-0,094

0,17

0,37

1,7

0,05

...

0,6

-0,22

0,2

0,24

1,5

0,98

...

0,72

-0,14

0,18

0,31

1,7

0,07

...

0,73

-0,14

0,18

0,32

1,7

0,75

...

0,85

-0,068

0,17

0,39

1,8

0,07

...

0,86

-0,066

0,17

0,4

1,9

0,32

...

0,99

-0,004 7

0,16

0,48

0,03

...

-0,002 1

0,16

0,48

2,1

0,09

...

1,1

0,055

0,15

0,57

2,3

0,02

...

0,78

-0,11

0,18

0,34

1,8

0,98

...

0,92

-0,038

0,17

0,42

0,09

...

0,92

-0,035

0,17

0,42

0,97

...

1,1

0,027

0,16

0,51

2,2

0,10

...

1,1

0,03

0,16

0,51

2,2

0,46

...

1,2

0,085

0,15

0,61

2,4

0,05

...

1,2

0,088

0,15

0,61

2,5

0,15

...

1,4

0,14

0,71

2,7

0,02

...

1,4

0,14

0,71

2,7

0,04

...

-0,001 8

0,17

0,45

2,2

0,93

...

1,1

0,062

0,16

0,55

2,4

0,09

...

1,2

0,065

0,16

0,55

2,4

1,00

...

1,3

0,12

0,15

0,65

2,7

0,13

...

1,3

0,13

0,15

0,66

2,7

0,61

...

1,5

0,18

0,15

0,77

0,08

...

1,5

0,18

0,15

0,77

0,24

...

1,7

0,23

0,14

0,89

3,2

0,04

...

1,7

0,23

0,14

0,89

3,3

0,08

...

1,9

0,28

0,14

3,5

0,01

...

1,9

0,28

0,14

3,6

0,02

...

1,3

0,11

0,16

0,6

2,7

0,71

...

1,5

0,17

0,16

0,71

0,09

...

1,5

0,17

0,16

0,72

1,00

...

1,7

0,22

0,15

0,84

3,3

0,17

...

1,9

0,27

0,14

0,97

3,7

0,01

...

1,7

0,23

0,15

0,84

3,4

0,83

...

1,9

0,28

0,15

0,97

3,7

0,14

...

2,1

0,33

0,14

1,1

0,01

...

1,9

0,28

0,15

0,98

3,7

0,42

...

2,1

0,33

0,14

1,1

4,1

0,08

...

2,2

0,33

0,14

1,1

4,1

0,16

...

2,4

0,38

0,14

1,3

4,5

0,04

...

2,4

0,38

0,14

1,3

4,6

0,05

...

2,7

0,43

0,13

1,4

0,01

...

2,7

0,43

0,13

1,5

0,01

...

1,7

0,22

0,16

0,79

3,5

0,53

...

1,9

0,28

0,16

0,93

3,9

0,09

...

1,9

0,29

0,16

0,94

1,00

...

2,2

0,34

0,15

1,1

4,4

0,20

...

2,5

0,39

0,15

1,2

4,9

0,02

...

2,2

0,35

0,15

1,1

4,5

1,00

...

2,5

0,4

0,15

1,3

0,22

...

2,8

0,45

0,15

1,4

5,5

0,02

...

2,5

0,41

0,15

1,3

5,1

0,66

...

2,9

0,46

0,15

1,5

5,6

0,16

...

3,2

0,51

0,14

1,7

6,3

0,02

...

2,9

0,46

0,15

1,5

5,8

0,31

...

3,3

0,51

0,15

1,7

6,4

0,09

...

3,7

0,56

0,14

1,9

7,1

0,01

...

3,3

0,52

0,15

1,7

6,5

0,12

...

3,7

0,57

0,14

1,9

7,2

0,04

...

3,8

0,58

0,15

7,4

0,04

...

4,3

0,63

0,14

2,2

8,2

0,02

...

4,3

0,64

0,14

2,2

8,4

0,01

...

2,3

0,36

0,17

1,1

5,1

0,3

...

2,7

0,43

0,17

1,2

5,9

0,06

...

2,8

0,44

0,17

1,3

0,70

...

3,2

0,51

0,17

1,5

0,19

...

3,8

0,58

0,17

1,7

8,3

0,03

...

3,3

0,52

0,17

1,5

7,3

0,96

...

3,9

0,59

0,17

1,7

8,6

0,31

...

4,6

0,66

0,17

0,06

...

0,60

0,18

1,8

1,00

...

4,7

0,68

0,18

2,1

0,46

...

5,6

0,75

0,18

2,5

0,11

...

6,6

0,82

0,17

0,02

...

4,9

0,69

0,18

2,1

1,00

...

5,9

0,77

0,18

2,6

0,61

...

0,84

0,17

3,2

0,19

...

8,2

0,91

0,16

3,8

0,05

...

6,2

0,79

0,18

2,7

1,00

...

7,4

0,87

0,18

3,3

0,77

...

8,7

0,94

0,17

4,1

0,32

...

0,16

4,9

0,09

...

1,1

0,15

5,8

0,02

...

7,9

0,9

0,18

3,5

1,00

...

9,4

0,97

0,17

4,3

0,98

...

0,16

5,2

0,46

...

1,1

0,15

6,2

0,15

...

1,1

0,14

7,2

0,04

...

0,17

4,6

0,94

...

1,1

0,16

5,6

1,00

...

1,1

0,15

6,7

0,6

...

1,2

0,15

7,9

0,24

...

1,2

0,14

9,1

0,08

...

1,3

0,14

0,02

...

1,1

0,16

6,1

0,72

...

1,2

0,16

7,3

1,00

...

1,2

0,15

8,6

0,83

...

1,3

0,15

0,42

...

1,3

0,14

0,16

...

1,4

0,14

0,05

...

1,2

0,16

0,54

...

1,3

0,16

9,6

1,00

...

1,4

0,15

1,00

...

1,4

0,15

0,62

...

1,5

0,15

0,3

...

1,5

0,15

0,12

...

1,6

0,15

0,04

...

1,7

0,15

0,01

...

1,4

0,17

0,30

...

1,5

0,17

0,67

...

1,5

0,18

0,90

...

1,6

0,18

100

1,00

...

1,7

0,19

130

1,00

...

1,8

0,19

170

1,00

...

0,18

210

1,00

...

120

2,1

0,17

270

1,00

...

160

2,2

0,17

350

1,00

...

230

2,4

0,18

100

520

1,00

...

∞

120

∞

1,00

...

(Quy định)

Đếm khuẩn lạc với hai đĩa trên một độ pha loãng

D.1 Giới thiệu

Phụ lục này quy định các trường hợp tính và biểu thị kết quả đếm cụ thể với hai đĩa trên một độ pha loãng.

Áp dụng tất cả các yêu cầu và khuyến cáo nêu trong 10.3.

Trong phụ lục này chỉ đưa ra các yêu cầu khác và các diễn giải cần thiết.

D.2 Đếm khuẩn lạc

Áp dụng các yêu cầu và khuyến cáo nêu trong 10.3.1 và 10.3.2.1.1.

Sau thời gian nuôi cấy như nêu trong tiêu chuẩn cụ thể. Đếm khuẩn lạc (tổng số khuẩn lạc. Khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ) cho từng đĩa chứa đến và bao gồm 300 khuẩn lạc (hoặc số đếm bất kỳ khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể).

...

- nuôi cấy một đĩa Petri đường kính 90 mm cho một độ pha loãng; và thực hiện ít nhất cho hai độ pha loãng liên tiếp;

- số đếm tối đa đối với các khuẩn lạc có mặt: 300 trên mỗi dĩa;

- tổng số đếm khuẩn lạc tối đa (điển hình và không điển hình) có mặt trên một đĩa khi đếm các khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc giả định: tốt nhất là 300 trên một đĩa;

- số đếm tối đa khuẩn điển hình hoặc giả định: 150 trên một đĩa;

- số khuẩn lạc giả định được nuôi cấy để nhận biết hoặc khẳng định (xem D.4), trong từng đĩa được giữ lại: thường là 5.

Những con số này sẽ được xác định trong các tiêu chuẩn cụ thể.

Các phương pháp tính được xác định sau đây là các trường hợp thường gặp nhất khi thử nghiệm được thực hiện phù hợp với thực hành phòng thử nghiệm tốt. Các trường hợp đặc biệt đòi khi có thể xảy ra (ví dụ: số khuẩn lạc trên hai đĩa ở cùng độ pha loãng có thể có khác nhau đáng kể hoặc tỷ lệ các hệ số pha loãng sử dụng cho hai độ pha loãng liên tiếp cố thể rất khác nhau), do đó việc kiểm tra và giải thích các kết quả thu được cần do người phân tích vi sinh đã được đào tạo thực hiện, nếu cần, có thể loại bỏ.

D.3 Phương pháp tính: trường hợp chung (đếm tổng số khuẩn lạc hoặc khuẩn lạc điển hình)

Để kết quả có giá trị, thường cần đếm số khuẩn lạc trên ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc [tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc đáp ứng được các tiêu chí nhận biết hoặc tiêu chí khẳng định (D.4)].

...

Khuyến cáo rằng các giới hạn được quy định bởi các phòng thử nghiệm về việc đếm khuẩn lạc trên đĩa thứ hai.

Các giới hạn này có thể được nêu trong TCVN 9330-2 (ISO 14461-2)^[42].

Khi các giới hạn này không được như dự kiến, thì phải giải thích kết quả một cách thận trọng.

VÍ DỤ 1: Nếu số đếm khuẩn lạc trên đĩa thứ nhất có số đếm cao hơn, ví dụ 250, thì số đếm khuẩn lạc trên đĩa thứ hai với số đếm thấp hơn nhưng không nên thấp hơn 196 [xem TCVN 9330-2 (ISO 14461-2)]^[42^].

Có thể áp dụng khuyến nghị về tỷ lệ giữa số đếm khuẩn lạc tại các độ pha loãng d₁ và d₂ (10.3.2.2).

Tính số N vi sinh vật có mặt trong mẫu thử là số đếm trung bình từ hai độ pha loãng liên tiếp sử dụng Công thức (D.1):

(D.1)

Trong đó:

∑C là tổng của các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại thu được từ hai độ pha loãng liên tiếp và có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

...

n₁ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng đầu tiên giữ lại [d = 1 khi sản phẩm ở dạng lỏng không pha loãng (mẫu thử) được sử dụng].

Làm tròn kết quả tính được đến hai chữ số sau dấu phẩy. Để làm tròn, nếu con số thứ ba nhỏ hơn 5 thì không sửa đổi con số trước đó; Nếu con số thứ ba bằng hoặc lớn hơn 5, thì tăng số đứng trước lên một đơn vị.

Lấy kết quả là một con số giữa 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa điện thích hợp của 10 hoặc số nguyên với hai con số có nghĩa.

Biểu thị kết quả như sau:

- số N vi sinh vật trên mililít (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác).

VÍ DỤ 2: Việc đếm cho các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-2) giữ lại: 163 và 215 khuẩn lạc;

...

Bằng cách làm tròn kết quả như trên, số lượng vi sinh vật là 19 000 hoặc 1,9 × 10⁴ trên mililít hoặc trên gam sản phẩm.

D.4 Phương pháp tính: Trường hợp sau khi nhận biết hoặc khẳng định

Khi phương pháp được sử dụng để nhận biết hoặc khẳng định, số lượng được cho trước A (thường là 5) khuẩn lạc giả định được nuôi cấy từ mỗi đĩa được giữ lại để đếm khuẩn lạc. Sau khi nhận biết hoặc khẳng định phép tính đối với mỗi đĩa, số a khuẩn lạc đáp ứng các tiêu chí nhận biết hoặc tiêu chí xác định được tính bằng Công thức (D.2):

(D.2)

Trong đó:

b là số khuẩn lạc đáp ứng được các tiêu chí nhận biết hoặc tiêu chí khẳng định trong số các khuẩn lạc A được nuôi cấy;

C là tổng số các khuẩn lạc giả định nghi ngờ cho được giữ lại trên đĩa.

Làm tròn kết quả tính đến số nguyên gần nhất. Để làm tròn, nếu con số đầu tiên sau dấu phẩy nhỏ hơn 5, thì không sửa đổi con số đứng trước; Nếu con số đầu tiên sau dấu phẩy bằng hoặc lớn hơn 5, thì tăng con số đứng trước lên một đơn vị.

...

Làm tròn kết quả theo khuyến cáo trong D.3.

Biểu thị kết quả như trong D.3, D.5.1 và D.7.3, tương ứng.

VÍ DỤ: Việc đếm cho các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-3) giữ lại: 66 và 80 khuẩn lạc;

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-4) giữ lại: 4 và 7 khuẩn lạc.

Tiến hành kiểm tra các khuẩn lạc đã được chọn:

- Đối với 68 khuẩn lạc, 8 khuẩn lạc, 6 trong số các khuẩn lạc đó đáp ứng các tiêu chí, do đó a = 50;

- đối với 80 khuẩn lạc, 9 khuẩn lạc, 6 trong số khuẩn lạc đó đáp ứng được các tiêu chí; do đó a = 53;

- đối với 7 khuẩn lạc, 5 khuẩn lạc, 4 trong số khuẩn lạc đó đáp ứng được các tiêu chí; do đó a = 6;

...

Bằng cách làm tròn kết quả theo khuyến cáo trong D.3, số lượng vi sinh vật là 51 000 hoặc 5,1 x 10⁴ trong một mililit hoặc trên sản phẩm.

D.5 Phương pháp tính: các số đếm ước tính

D.5.1 Trường hợp hai đĩa (mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc dung dịch pha loãng thứ nhất) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc

Có thể áp dụng các yêu cầu và khuyến cáo nêu trong 10.3.2.4.1 liên quan đến giới hạn dưới của phép xác định.

Nếu cả hai đĩa mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc chứa huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác), hoặc từ dung dịch pha loãng thứ nhất đã được nuôi cấy hoặc được giữ lại, chứa ít hơn 10 khuẩn lạc (tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc đáp ứng được các tiêu chí nhận biết hoặc tiêu chí khẳng định) và bộ hai đĩa chứa ít nhất 4 khuẩn lạc, tính số lượng ước tính NE của các vi sinh vật có mặt trong mẫu thử là trung bình cộng của các khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa sử dụng Công thức (D.3):

(D.3)

Trong đó:

∑C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa;

...

n là số lượng đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của dung dịch pha lỏng đầu tiên được nuôi cấy hoặc được giữ lại [d = 1 khi sản phẩm dạng lỏng không pha loãng (mẫu thử) được sử dụng].

Làm tròn kết quả theo khuyến cáo trong D.3.

Biểu thị kết quả như sau:

- số ước tính N_E vi sinh vật trên mililít (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác).

VÍ DỤ: Việc đếm cho các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-2) giữ lại: 8 và 9 khuẩn lạc đếm được

Bằng cách làm tròn kết quả theo khuyến cáo trong D.3, số ước tính N_E vi sinh vật là 850 hoặc 8.5 x 10² trên mililit hoặc trên gam sản phẩm.

...

Nếu hai đĩa chứa mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) hoặc từ dung dịch pha loãng đầu tiên được nuôi cấy hoặc được giữ lại không chứa khuẩn lạc nào thì báo cáo kết quả như sau:

ít hơn 1/Vd vi sinh vật trên mililít (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác);

Trong đó:

V là thể tích chất cấy được sử dụng trong mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);

d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của dung dịch pha loãng thứ nhất được nuôi cấy hoặc được giữ lại [d = 1 khi sản phẩm dạng lỏng không pha loãng (mẫu thử) được sử dụng, d = 0,1 khi sử dụng dung dịch pha loãng 10^-1, v.v...].

D.6 Trường hợp đặc biệt (đếm các khuẩn lạc nghi ngờ hoặc khuẩn lạc điển hình)

D.6.1 Nếu tất cả các khuẩn lạc điển hình và không điển hình đối với hai đĩa có chứa dung dịch pha loãng thứ nhất d₁ lớn hơn 300 (hoặc số bất kỳ khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể), với các khuẩn lạc điển hình có thể nhìn thấy hoặc khuẩn lạc đã được khẳng định và nếu đối với hai đĩa chứa dung dịch pha loãng tiếp theo d₂ chứa đến và bao gồm 300 khuẩn lạc (hoặc số bất kỳ số khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể) không có khuẩn lạc điển hình hoặc khẳng định có thể được tính thì báo cáo kết quả như sau:

ít hơn 1/V₂d₂ và nhiều hơn 1/V₁d₁ vi sinh vật trong một mililít (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác);

Trong đó:

...

d₁, d₂ lá các hệ số pha loãng.

VÍ DỤ: Việc đếm đã sản xuất các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-2) giữ lại: cả hai đĩa mỗi đĩa chứa nhiều hơn 300 khuẩn lạc, khi có mặt các khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc được khẳng định.

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-³) giữ lại: 33 và 35 khuẩn lạc, không có mặt các khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc được khẳng định.

Biểu thị kết quả là có ít hơn 1 000 và nhiều hơn 100 vi sinh vật trong một mililit hoặc trên gam sản phẩm.

D.6.2 Nếu tất cả các khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên hai đĩa chứa dung dịch pha loãng thứ nhất d₁ lớn hơn 300 (hoặc số bất kỳ khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể), mà không nhìn thấy có khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc được khẳng định và nếu hai đĩa chứa dung dịch pha loãng tiếp theo d₂ có chứa đến và bao gồm 300 khuẩn lạc (hoặc số bất kỳ khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể) không có khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc được khẳng định, thì báo cáo kết quả như sau:

ít hơn 1/V₂d₂ vi sinh vật trên mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác);

Trong đó:

V₂ là thể tích chất cấy đưa vào mỗi đĩa đối với độ pha loãng tiếp theo d₂, tính bằng mililit (ml);

...

VÍ DỤ: Việc đếm cho các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-2) giữ lại: cả hai đĩa mỗi đĩa chứa nhiều hơn 300 khuẩn lạc, khi không có mặt các khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc được khẳng định.

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-2) giữ lại: 33 và 35 khuẩn lạc, không có mặt các khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc được khẳng định.

Kết quả được biểu thị là có ít hơn 1000 vi sinh vật trên milllít hoặc trên gam sản phẩm.

D.7 Phương pháp tính: Trường hợp đặc biệt

Có thể áp dụng các yêu cầu và các khuyến cáo trong 10.3.2.5.

D.7.1 Nếu số khuẩn lạc đếm được (tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ) lớn hơn số đếm tối đa có thể đếm được (300 hoặc số bất kỳ khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể) đối với hai đĩa chứa dung dịch pha loãng thứ nhất d₁; với số khuẩn lạc (tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc đáp ứng các tiêu chí nhận biết hoặc được khẳng định) nhỏ hơn 10 (giới hạn số đếm thấp) của hai đĩa chứa dung dịch pha loãng tiếp theo d₂, thì biểu thị kết quả như sau:

CHÚ THÍCH: Trong phần này chỉ đưa ra các ví dụ.

c) Nếu số khuẩn lạc của hai đĩa chứa dung dịch pha loãng d₁, nằm trong dải [số đếm tối đa cộng thêm 1, giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với số đếm tối đa] (ví dụ 301 đến 324) (Phụ lục B) và số đếm khuẩn lạc của hai đĩa chứa dung dịch pha loãng d₂ không nhỏ hơn giới hạn dưới quy định trong 10.3.2.2, sử dụng phương pháp tính cho các trường hợp chung (xem D.3).

...

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-²) giữ lại: 310 và 322 khuẩn lạc (thấp hơn 324, giới hạn trên của khoảng tin cậy là 300);

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-3) giữ lại: 8 và 12 khuẩn lạc, các giới hạn dưới của số đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng (10^-3) là 18 và 19 khuẩn lạc được quy định từ 310 và 322 khuẩn lạc của độ pha loãng (10^-²).

Kết quả đếm khuẩn lạc này là không thể chấp nhận được.

Ví dụ 2: Việc đếm (khi số lượng tối đa 150 được thiết lập cho việc đếm khuẩn lạc) cho các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-2) giữ lại: 151 và 160 khuẩn lạc (nhỏ hơn 167, giới hạn trên của khoảng tin cậy là 150);

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-3) giữ lại: 6 và 9 khuẩn lạc, các giới hạn dưới của số đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng (10^-3) là 6 và 7 khuẩn lạc được xác định từ 151 và 160 khuẩn lạc của độ pha loãng 10^-².

Sử dụng phương pháp tính cho các trường hợp chung (D.3) bằng cách sử dụng các đĩa đối với hai độ pha loãng được giữ lại.

d) Nếu số khuẩn lạc trên các đĩa chứa dung dịch pha loãng d₁ lớn hơn giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với số đếm tối đa có thể đếm được (ví dụ: 324) và số đếm khuẩn lạc của dung dịch pha loãng d₂ đối với hai đĩa không nhỏ hơn giới hạn dưới quy định trong 10.3.2.2 và tính được từ giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với số đếm tối đa, thì chỉ lấy số đếm của kết quả đếm của dung dịch d₂ và tính số đếm ước tính (D.5.1).

VÍ DỤ 3: Việc đếm (Khi số đếm tối đa 300 được thiết lập để đếm khuẩn lạc) cho các kết quả sau đây:

...

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-3) giữ lại: 7 và 9 khuẩn lạc, các giới hạn dưới của số đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng (10^-3) là 19 khuẩn lạc, được xác định từ 324 khuẩn lạc của độ pha loãng 10^-².

Kết quả đếm khuẩn lạc này là không thể chấp nhận.

VÍ DỤ 4: Việc đếm (khi số tối đa 150 được thiết lập để đếm khuẩn lạc) cho các kết quả sau đây:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-2) giữ lại: trên hai đĩa mỗi đĩa nhiều hơn 167 khuẩn lạc;

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-3) giữ lại: 8 và 9 khuẩn lạc, giới hạn dưới của số đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng (10^-3) là 8 khuẩn lạc được xác định từ 167 khuẩn lạc của độ pha loang 10^-2.

Báo cáo số ước tính được theo số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa từ độ pha loãng 10^-3 (D.5.1).

VÍ DỤ 5: Việc đếm (khi số tối đa 150 được thiết lập để đếm khuẩn lạc) cho các kết quả sau đây:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-²) giữ lại: trên hai đĩa mỗi đĩa nhiều hơn 187 khuẩn lạc;

- ở độ pha loãng thứ hai (10^-3) giữ lại: 5 và 7 khuẩn lạc, giới hạn dưới của số đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng (10^-³) là 8 khuẩn lạc được xác định từ 167 khuẩn lạc của độ pha loãng 10^-2.

...

D.7.2 Khi số đếm khuẩn lạc (tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc giả định) đối với từng đĩa của tất cả các độ pha loãng đã nuôi cấy cho số đếm lớn hơn 300 (hoặc số bất kỳ khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể), thì báo cáo kết quả như sau:

“nhiều hơn 300/Vd” (trong trường hợp tổng số khuẩn lạc hoặc khuẩn điển hình) hoặc là

“nhiều hơn (300/Vd) x (b/A)” (trong trường hợp khuẩn lạc được khẳng định), tính theo số vi sinh vật trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc vi sinh vật trên gram (sản phẩm dạng khác).

Trong đó:

d là độ pha loãng của dung dịch nuôi cấy cuối cùng;

V là thể tích chất cấy được sử dụng trong mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);

b là số khuẩn lạc đáp ứng được các tiêu chí nhận biết trong số các khuẩn lạc được nuôi cấy A;

D.7.3 Trường hợp chỉ có hai đĩa chứa dung dịch nuôi cấy cuối cùng là có thể đếm được và chứa đến và bao gồm 300 (hoặc số bất kỳ khác nêu trong tiêu chuẩn cụ thể) khuẩn lạc (tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc giả định), thì tính số N’ vi sinh vật có mặt là trung bình cộng của các khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa, sử dụng Công thức (D.4):

(D.4)

...

∑C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa và có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

V là thể tích chất cấy áp dụng cho mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);

n là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này, n = 2);

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng được giữ lại.

Làm tròn kết quả theo khuyến cáo trong D.3.

Biểu thị kết quả như sau:

- số lượng N’ vi sinh vật trên mililít (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác).

VÍ DỤ: Việc đếm cho các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng cuối cùng (10^-4) đã nuôi cấy: 120 và 130 khuẩn lạc:

...

Bằng cách làm tròn kết quả theo khuyến cáo trong D.3, số N’ của vi sinh vật là 1 300 000 hoặc 1.3 x 10⁶ trên mililit hoặc trên gam sản phẩm.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] BELL, C. NEAVES, P. and WILLIAMS, A.P. Food microbiology and laboratory practice, Blackwell Science Ltd, Oxford, UK (2005)

[2] ISO 9001, Quality management systems - Requirements

[3] EA-Guidelines for the use of computers and computer systems in accredited laboratories, European cooperation for Accreditation (1998)

[4] EA-4/10, Accreditation for microbiological laboratoties, European cooperation for Accreditation (2002)

[5] Food microbiology program requirements, based upon the FLAWG document United States accreditation criteria for laboratories performing food microbiological testing, American Association for Laboratory Accreditation (A2LA) (1998)

[6] AS 1766, Australian standard methods for the microbiological examination of food - Part 1: General techniques and procedures update

...

[8] APHA Technical Committee on Microbiological Methods for Foods. Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 2nd edition, Speck, M.L., editor. Intersociety/Agency Committee on Microbiological Methods for Foods, American Public Health Association, Washington, DC, 1984

[9] CRUICKSHANK et al., Medical microbiology, Vol 2,12th edn., Churchill-Livingstone, Edinburgh (1975)

[10] D’AOUST, J.Y., Psychrotrophy and foodborne Salmonella. Int. J. Food. Microbiol. 1991,13, pp. 207-16

[11] D’AOUST, J.Y., SEWELL, A.M. and MCDONALD, C. Recovery of Salmonella spp. From refrigerated pre-enrichment cultures of dry food composites, J. AOAC Int. 1995, 78, pp. 1322-7

[12] D’AOUST, J.Y., SEWELL, A.M. and GRECO, P. Detection of Salmonella in dry foods using refrigerated pre-enrichment and enrichment broth cultures: summary of collaborative study. J. AOAC. Int. 1994, 77, pp. 1490-1

[13] D’AOUST, J.Y., SEWELL, A.M. and GRECO, P. Detection of Salmonella in dry foods using refrigerated pre-enrichment and enrichment broth cultures - Interlaboratory study, J. AOAC. Int. 1993, 76, pp. 814-21.

[14] DALSGAARD, A., GUARDABASSI, L, LUND, C, BAGGE, L. and GRAVESEN, J. Opbevaring af badevands-og drikkevandsprover ved 0-5 °C i et dogn medforer en signifikant reduktion i antal Escherichia coli og kimtal, Dansk. Vet. 2002 17, pp. 1-9

[15] HARREWIJIN, G.A., and HARTOG, B.J. Guidelines to perform microbiological analyses of food and food products (“Good laboratory practice”), De Ware(n)-Chemicus 1979, 9, pp. 1-11

[16] MUIR, G.D., ed. Hazards in the chemical laboratory, Royal Institute of Chemistry, London (1971)

...

[18] LIGHTFOOT, N.F., MAIER, E.A. (eds). Microbiological analysis of food and water - Guidelines for quality assurance. Elsevier, Amsterdam, Netherlands (1998)

[19] HARRIGAN, W.F. and MCCANCE, M.E. Laboratory methods in food and dairy microbiology, Academic Press (1976)

[20] Laboratory safety at the Centers for Disease Control (CDC), NHEW Publication No. CDC 79-8118, Atlanta, 1979

[21] Laboratory safety at the Centers of Disease Control, US Dept of Health, Education and Welfare (Public Health Service), Atlanta, 1979

[22] GERHARDT, P., MURRAY, R.G.E., COSTILLOW, R.N., NESTER E.W., KRIEG, N.R. and PHILLIPS, G. B. eds. Manual of methods for general bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, DC 20006 (1981)

[23] GNANOU BESSE, N., AUDINET, N., BEAUFORT, A., COLIN, P., CORNU, M. and LOMBARD, B. A contribution to the improvement of Listeria monocytogenes enumeration in cold-smoked salmon. Int. J. Food Microbiol. 2004, 91, pp. 119-27

[24] Microbiological testing laboratory accommodation guidelines, National Association of Testing Authorities, Australia

[25] Microorganisms in foods - 1; Their significance and methods of enumeration, ICMSF, University of Toronto Press (1968 update)

[26] SHAPTON, DA, BOARD, R.G. and HAUSTER, W.J. eds. Safety in microbiology, Society for Applied Bacteriology Technical Series No. 1 and No. 6, Academic Press (1972)

...

[28] COCHRAN, W.G. Estimation of bacterial densities by means of the “Most Probable Number”. Biometrics 1950, 6, pp. 105-16

[29] HURLEY, M.A. and ROSCOE, M.E. Automated statistical analysis of microbial enumeration by dilution series, J. Appl. Bacteriol. 1983, 55, pp. 159-64

[30] NIEMELA, S. Statistical evaluation of results from quantitative microbiological examinations, Nordic Committee on Food Analysis (NMKL) Report No. 1, 2nd edition (1983)

[31] TAYLOR, J. The estimation of numbers of bacteria by tenfold dilution series, J. Appl. Bacteriol. 1962, 25, pp. 54-61

[32] HOLT, J.G., KRIEG, N.R., SNEATH, P.H.A., STALEY, J.T. and WILLIAMS, ST. Bergey’s manual of determinative bacteriology, 9th edn., Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA (1994)

[33] KRIEG, N.R. and HOLT, J.G. Bergey’s manual of systematic bacteriology - Volume 1, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA (1984)

[34] SNEATH, P.H.A., MAIR, N.S., SHARPE, M.E. and HOLT, J.G. Bergey’s manual of systematic bacteriology - Volume 2, 2nd edition, Springer, New York, NY, 2001

[35] KREGER-VAN RIJ, N.J.W. The yeasts - A taxonomic study, 3rd edn., North-Holland Publishing Co., Amsterdam, Netherlands

[36] THOMAS, H.A. Bacterial densities from fermentation tube tests, J. Am. Water Works Assoc. 1942, 34, pp. 572-6

...

[38] ISO 6888 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)

[39] ISO 9998, Water quality - Practices for evaluating and controlling microbiological colony count media used in water quality tests

[40] ISO/TR 13843, Water quality - Guidance on validation of microbiological methods

[41] ISO 14461-1, Milk and milk products - Quality control in microbiological laboratories - Part 1: Analyst performance assessment for colony counts

[42] ISO 14461-2, Milk and milk products - Quality control in microbiological laboratories - Part 2: Determination of the reliability of colony counts of parallel plates and subsequent dilution steps

[43] ISO 16654, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Escherichia coli 0157

[44] ISO/IEC 17025:2005. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

[45] EN 12469, Biotechnology - Performance criteria for microbiological safety cabinets

[46] ISO 17604, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Carcass sampling for microbiological analysis

...

[48] ISO Guide 99:1996, International vocabulary of basic and general terms in metrology

[49] ISO/TC 34/SC 9 N852, Supporting document on the change from two to one plate per dilution for colony-count techniques (revision of ISO 7218), June 2007, Marie Cornu

[50] TCVN 4851 (ISO 3696) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

[51] TCVN 7152 (ISO 7712) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet Pasteur sử dụng một lần

[52] BLODGETT R,J, Serial dilution with a confirmation step, Food Microbiol, 2005, 22, pp, 547-552

[53] BLODGETT R,J, Appendix 2: Most PROBABLE number from serial dilutions, In: Bacterial analytical manual online, Silver Spring, MD: US Food and Drug Administration, 2010, Available (viewed 2013-02-04) at http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaDoratorvMethods/BacteriologicalAnalvticalManualBAM/ucm_109656.htm

[54] GARTHRIGHT W,E., BLODGETT R,J, FDA's preferred MPN methods for Standard, large or unusual tests, with a spreadsheet, Food Microbiol, 2003, 20, pp, 439-445

[55] HALDANE J,B,S, Sampling errors in the determination of bactenal or virus density by the dilution method, J Hygiene 1939, 39, pp, 289-293.

[56] JARVIS B., WILRICH. C„ WILRICH P,T, Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values, J Appl, Microbiol, 2010, 109, pp 1660-1667.

...

1) Khi khử nhiễm sử dụng cồn quá 70 % (thể tích) thì cần có thời gian tiếp xúc thích hợp theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, để đạt được hiệu quả khử nhiễm.

4) Yêu cầu về thông tin được bổ sung từ các tài liệu viện dẫn của quốc gia, vùng hoặc quốc tế đối với việc nhận biết từng vi sinh vật.

5) Yêu cầu về thông tin được bổ sung từ các tài liệu viện dẫn của quốc gia, vùng hoặc quốc tế đối với việc nhận biết từng vi sinh vật.