Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010 về thủy sản và sản phẩm thủy sản - Phát hiện Salmonella

3.2.1.2 ChuÈn bÞ

Hoà tan các thành phần trong nước, đun tan, phân phối vào trong các bình chứa phù hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 ⁰C trong 15 min, pH sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C.

3.2.2 Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x

3.2.2.1 Thµnh phÇn

Taq polymeraza

0,025 U/ml (1,25 U/50 ml)

Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25 ⁰C)

75 mM

Amoni sulfat [(NH4)₂SO₄]

...

...

...

Tween 20

0,01 % (thể tích)

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

200 mM (mỗi loại)

Magiê clorua (MgCl₂)

1,5 mM

3.2.2.2 ChuÈn bÞ

Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ 4 ⁰C trong 1 tháng. Có thể bảo quản ở nhiệt độ – 20 ⁰C trong 1 năm. Không nên rã đông và tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần.

3.3 Thang ADN

...

...

...

3.4 Agaroza

Agaroza sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ hơn 1 000 bp.

3.5 Đệm điện di TAE 1x

3.5.1 Thµnh phÇn

Tris

4,84 g

Na₂EDTA 0,5M, pH = 8,0

2 ml

Axit axetic băng

...

...

...

Nước vừa đủ

1 000 ml

3.5.2 ChuÈn bÞ

Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng với nước thành dung dịch 1x.

3.6 Đệm tải mẫu 6x

3.6.1 Thµnh phÇn

Glyxerol

30 %

Xanh bromphenon

...

...

...

Tris

200 mM

Na₂EDTA

20 mM

3.6.2 ChuÈn bÞ

Các thành phần trên được pha trong nước, bảo quản ở nhiệt độ 4 ⁰C.

3.7 Thuốc nhuộm AND, dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml.

CẢNH BÁO – Thuốc nhuộm etyl bromua là một chất độc có thể gây ung thư cho người và động vật. Do đó, khi sử dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ. Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.

4. Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

4.1 Tủ ấm, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 ⁰C.

4.2 Máy luân nhiệt.

4.3 Máy ly tâm, loại dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.

4.4 Máy lắc ống nghiệm.

4.5 Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di, có điện thế hoạt động từ 80 V đến 150 V.

4.6 Hộp đèn soi UV, có kính lọc 302 mm.

CẢNH BÁO – Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ.

4.7 Bộ chụp ảnh trên đèn UV.

4.8 Ống Eppendorf, 0,2; 0,5 và 1,5 ml, loại chuyên dùng cho PCR.

...

...

...

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thoả thuận về vấn đề này.

6. Cách tiến hành

6.1 Phần mẫu thử

Cân chính xác 25 g mẫu thử (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình nón hoặc bao PE vô trùng.

6.2 Tăng sinh

Giai đoạn tăng sinh được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.

Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0 ⁰C ± 1,0 ⁰C trong khoảng 18 h ± 2 h.

6.3 Xử lý mẫu giải phóng ADN

...

...

...

a) Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 r/min trong 5 min rồi loại bỏ phần nước. Rửa sinh khối với nước rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.

b) Pha loãng huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước. Đun sôi cách thuỷ trong 10 min. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 r/min trong 5 min để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại.

6.4 Khuếch đại

Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

CẢNH BÁO

– Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu.

– Phòng thử nghiệm phải được bố trí tách khỏi khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.

6.4.1 Chuẩn bị ống khuếch đại

Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR dung tích 0,2 ml hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng dung tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.

...

...

...

Đối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước.

6.4.2 Chương trình khuếch đại

Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau:

Duy trì nhiệt độ 95 ⁰C trong 5 min để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95 ⁰C/60 s; 54 ⁰C/45 s và 72 ⁰C/60 s. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72 ⁰C trong 10 min, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20 ⁰C cho đến khi điện di.

6.5 Điện di sản phẩm khuếch đại

6.5.1 Chuẩn bị gel điện di agaroza 1 %

Gel agaroza 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 mm đến 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.

6.5.2 Chuẩn bị dịch điện di

Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều.

...

...

...

Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agaroza. Tiến hành điện di trong 60 min ở hiệu điện thế 100 V.

6.6 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại

6.6.1 Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu

Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 l nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.

6.6.2 Nhuộm gel

Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 min. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 min đến 5 min để loại bỏ phần etyl bromua dư.

6.6.3 Quan sát, chụp hình

Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả.

7. Đọc và diễn giải kết quả

...

...

...

Mẫu được kết luận là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

...

...

...

[1] CHENG HSUN CHIU and JONATHAN T.OU., Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay, Journal of Clinical microbiology, p.2619-2622. Oct. 1996.

[2] JS. WAY, KL. JOSEPHSON, SD. PILLAI, M. ABBASZADAGAN, CP. GERBA and IL. PEPPER., Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction, Appl. Environ. Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993.

[3] CAROLA BURTSCHER, PAPA A. FALL, PETER A. WILDERER, and STEFAN WUERTZ., Detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in Suspended Organic Waste by Nucleic Acid Extraction and PCR, Appl. Environ. Microbiol., 65 (5): 2235 - 2237, 1999.

[4] Nordic commitees on food analysis (NMKL) No 71, 5th ed., 1999, Salmonella. Detection in foods.