Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-15:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 15

• Số hiệu: TCVN8400-15:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

Phương pháp	Mục đích
	Trường hợp sàng lọc	Kiểm soát trong quá trình vận chuyển	Thực hiện chính sách thanh toán bệnh	Xác nhận triệu chứng lâm sàng	Điều tra, giám sát bệnh	Kiểm tra tình trạng miễn dịch của cá thể động vật hoặc sau khi tiêm vacxin trong đàn
Phát hiện tác nhân
Nuôi cấy, phân lập	-	+++	-	+++	-	-
PCR/Realtime PCR	-	++	-	++	-	-
Kiểm tra đáp ứng miễn dịch
MAT	-	+++	-	++	+++	-
ELISA	+++	-	+++	+++	++	+++

Chú thích: +++ : Phương pháp khuyến cáo

++ : Phương pháp phù hợp

+ : có thể sử dụng trong một số trường hợp, nhưng giá cả, độ tin cậy hoặc một số yếu tố khác bị hạn chế trong khi áp dụng

- : Không phù hợp với mục đích này.

PCR = polymerase chain reaction; MAT = microscopic agglutination test; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay.

6.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Trong trường hợp con vật có những dấu hiệu bệnh cấp tính hoặc là thai của động vật mẹ mắc bệnh mạn tính thì bệnh phẩm là gan, phổi, thận, não và các dịch thể như máu, sữa, dịch não tủy, dịch màng ngực.

Trong trường hợp nghi con vật mắc bệnh mạn tính thì bệnh phẩm lấy là thận, nước tiểu, bộ phận sinh dục

Mẫu bệnh phẩm gửi đi xét nghiệm phải được bảo quản trong thùng lạnh từ 2 °C đến 8 °C và gửi đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Bệnh phẩm là phủ tạng, máu và nước tiểu để nuôi cấy phân lập phải bảo quản trong môi trường vận chuyển (3.14).

...

...

...

6.2  Chẩn đoán huyết thanh học

Phản ứng huyết thanh học dùng trong chẩn đoán bệnh Xoắn khuẩn là phản ứng ngưng kết trên phiến kính (MAT) với bộ kháng nguyên sống gồm 16 chủng Leptospira lưu hành ở Việt Nam.

Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm kháng thể Leptospira là huyết thanh: dùng xi lanh (4.14) không có chất chống đông hút máu khoảng 0.5 ml đến 1 ml, đặt nghiêng để ra huyết thanh, ghi ký hiệu mẫu.

6.2.1.  Chuẩn bị: Kháng nguyên chuẩn, kháng huyết thanh chuẩn, huyết thanh kiểm tra và dung dịch PBS phải để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 h trước khi làm phản ứng.

6.2.2.  Cách tiến hành phản ứng: theo phụ lục E.2

6.3  Chẩn đoán vi khuẩn học

6.3.1  Kiểm tra hình thái học

Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm vi khuẩn Leptospira gồm:

- Lấy mẫu máu xét nghiệm vi khuẩn Leptospira: dùng xi lanh (4.14) có chất chống đông hút máu khoảng 0.5 ml đến 1 ml, ghi ký hiệu mẫu.

...

...

...

- Lấy mẫu nước tiểu nuôi cấy phân lập: lấy nước tiểu lấy vào giai đoạn hết sốt và cho 1 ml nước tiểu vào 9 ml môi trường vận chuyển (3.14).

- Mẫu máu: đã có chất chống đông, ly tâm rồi dùng pipet hút lớp dịch ở trên nhỏ lên phiến kính kiểm tra và soi bằng kính hiển vi nền đen.

- Mẫu nước tiểu: ly tâm, lấy cặn soi trên kính hiển vi nền đen phát hiện Leptospira.

- Nghiền phủ tạng với dung dịch PBS theo tỷ lệ 1:9, đem li tâm lấy phần trên soi tươi. Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấy: Leptospira di động.

- Vi khuẩn Leptospira nhuộm theo phương pháp Morosop (phụ lục D) được soi trên kính hiển vi thường, vi khuẩn Leptospira bắt màu nâu như sợi thuốc lào.

6.3.2  Phân lập vi khuẩn

• Cấy chuyển trong môi trường

Mẫu được bảo quản trong môi trường vận chuyển (3.14) được cấy chuyển vào môi trường lỏng EMJH (phụ lục C.1) hoặc môi trường bán cố thể Fletcher (phụ lục C.2) ở 28 - 30 °C. Theo dõi trong vòng từ 16 tuần cho đến 26 tuần.

• Tiêm truyền động vật thí nghiệm

...

...

...

Một phần mẫu bệnh phẩm đem nghiền với dung dịch PBS theo tỷ lệ 1 : 9, lấy huyễn dịch đó tiêm vào xoang phúc mạc chuột lang (hoặc thỏ) 2 ml/con. Sau 1, 2, 6, 24 h lấy máu cấy vào môi trường EMJH và theo dõi ít nhất 26 tuần.

• Định tuýp huyết thanh

Sau khi đã phân lập được Leptospira tiến hành định tuýp, qui trình định tuýp được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính (MAT) với cả 16 mẫu kháng huyết thanh đơn giá dương tính chuẩn của 16 chủng.

Mẫu kháng huyết thanh nào cho phản ứng ngưng kết mạnh nhất thì chủng Leptospira này thuộc vào nhóm đó. Còn mẫu kháng huyết thanh nào mà cũng cho phản ứng ngưng kết nhưng yếu hơn thì đó chỉ là hiện tượng ngưng kết chéo giữa chủng này với kháng huyết thanh chuẩn của các chủng khác.

6.3.3  Phương pháp Realtime PCR

6.3.3.1  Xử lý mẫu

Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng (thận, gan...): dùng panh, kéo láy từ 1 g đến 2 g, cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ (4.9) vô trùng với dung dịch PBS (3.1) theo tỉ lệ 1: 9 (1g phủ tạng + 900 ml dung dịch PBS).

Dùng pipet hút huyễn dịch vừa nghiền vào 2 ống ly tâm (4.23),1 ống dùng làm lưu mẫu. Ống dùng làm mẫu, ly tâm (4.11) ở gia tốc 900 g trong 10 min, rồi thu lấy dịch nổi để xét nghiệm vi khuẩn Leptospira bằng phương pháp realtime PCR.

6.3.3.2  Cách tiến hành

...

...

...

Sử dụng bộ kit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ: sử dụng quy trình tách chiết ADN (3.7) bằng protein K hoặc kít tách chiết bằng cột lọc của kit (Phụ lục G.1).1)

b. Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.9) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu lipL 32 của Leptospira sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược (3.11). Trình tự cặp mồi được nêu trong Bảng 3 (Phụ lục G.2)

Chuẩn bị mồi như sau:

- Mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.13) ở gia tốc 6000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE (3.10) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (20 µl mồi gốc và 80 µl nước tinh khiết không có nuclease). Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 µM (6 µl mồi gốc và 94 µl nước tinh khiết không có nuclease). Trộn cùng 1 thể tích mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha thành hỗn hợp để tiện khi sử dụng.

c. Tiến hành phản ứng real time PCR

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2). Đối với kít nhân gen Superscrip 3 platinum one - step qRT-PCR (Cat. 11732-020) (3.10) thành phần của một phản ứng được trình bày ở Bảng 2. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml (4.24), có đầy đủ đối chứng âm và đối chứng dương.

Thành phần cho một phản ứng realtime PCR (phụ lục G.3, theo hướng dẫn của kít thương mại được sử dụng).

...

...

...

Đối chứng âm: sử dụng nước tinh khiết không có nuclease.

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (4.10).

LƯU Ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu xét nghiệm, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

- Ví dụ: Đối với kit Platinum qPCR SuperMix-UDG (Cat.11732-020) (3.8), chu kỳ nhiệt được nêu trong Bảng 3 (phụ lục G.4)

CHÚ THÍCH: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.3.3.3  Đọc kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (đã biết trước C_t) phải có giá trị C_t ≤ 35, mẫu đối chứng âm không có C_t.

Với điều kiện phản ứng trên:

...

...

...

2) Mẫu không có giá trị C_t là âm tính.

3) Mẫu có giá trị C_t ≤ 40 và > 35 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác tương đương để khẳng định và kết luận cuối cùng.

7.  Kết luận

Động vật được kết luận mắc bệnh Xoắn khuẩn do Leptospira gây ra khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích đặc trưng và có kết quả xét nghiệm dương tính với vi khuẩn Leptospira (bằng phương pháp nuôi cấy phân lập hoặc realtime PCR) hoặc dương tính kháng thể Leptospira (bằng phương pháp MAT) trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và dung dịch thử

...

...

...

A.1.1  Thành phần

Penicillin

1 000 000 UI

Mycostatin

250 000 UI

Streptomycin

200 mg

Kanamycin

...

...

...

Nước cất

10 ml

A.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm. Bảo quản ở âm 20°C (4.1.2).

A.2  Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,2 - 7,6

A.2.1  Thành phần

Natri clorua (Nacl)

8 g

Kali clorua (KCl)

...

...

...

Di natri hidrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

Kali dihidrophosphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước cất

1 000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước cất, chỉnh pH đến 7,2 - 7,6 bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 N hoặc dung dịch axit clohydric (HCl) 1 N. Hấp tiệt trùng và bảo quản ở 4 - 8 °C.

...

...

...

(Tham khảo)

Bảng 2 - Chẩn đoán bệnh Xoắn khuẩn do Leptospira với một số bệnh khác

Bệnh Xoắn khuẩn do Leptospira

Bệnh Sảy thai truyền nhiễm do Brucella

Bệnh Giả dại (Bệnh Aujeszky)

Bệnh Dịch tả lợn

Hội chứng ngộ độc Aflatoxin

Dịch tễ học

...

...

...

- Tỷ lệ chết thấp.

- Bệnh lây chủ yếu qua đường tiêu hóa. Ngoài ra bệnh có thể lây qua đường da và niêm mạc lành hoặc xây xát hoặc lây qua đường sinh dục

- Bệnh lây sang người, ở nhiều loài động vật khác và động vật hoang dã.

- Lây trực tiếp qua tiêu hóa, sinh dục, con bú mẹ...

- Mắc bệnh chủ yếu ở lợn sơ sinh.

- Tỷ lệ chết gần 100%.

- Mắc ở mọi lứa tuổi, và mắc nhiều nhất là lợn con.

- Tỷ lệ ốm, chết cao

- Thường xảy ra ở khu vực nông hộ sử dụng nguồn nguyên liệu tại chỗ (ngô hoặc ngũ cốc), sau vụ thu hoạch, thời tiết ẩm hoặc nhiều mưa

...

...

...

- Không có tính lây lan.

Triệu chứng

- Sốt cao.

- Gia súc cái mang thai: sẩy thai, đẻ non, bất dục, nếu sinh con thì con yếu.

- Gia súc đực: viêm khớp, sưng dịch hoàn, tinh dịch loãng, tỷ lệ tinh trùng dị hình cao.

- Con cái: Sảy thai, đẻ non, sát nhau, bất dục.

- Con đực: Viêm tinh hoàn, sưng khớp gối.

Rối loạn hô hấp và thần kinh trong đó ở lợn con triệu chứng thần kinh xuất hiện sau 24 h và chết sau 24 h đến 36 h, tỷ lệ chết gần 100%.

- Giảm ăn hoặc bỏ ăn, ủ rũ, sốt cao, ỉa chảy, ho, khó thở.

...

...

...

- Bệnh thường diễn biến ở thể mạn tính, không sốt,

Lợn ăn kém, chậm lớn, lông xù, da nhợt nhạt

- Trường hợp nặng, da và niêm mạc có thể vàng

- Trường hợp quá cấp lợn có thể nôn mửa, chết đột ngột, vàng da niêm mạc, phân có lẫn máu.

Bệnh tích

- Cơ quan phủ tạng hoại tử, có dịch vàng.

- Bào thai bị sẩy có các điểm hoại tử như đầu đinh ghim trên gan, có dịch vàng trong cơ thể.

- Trên bào thai: Xuất huyết, hoại tử lan tràn.

- Con đực: dịch thượng hoàn sưng to gấp 2 lần đến 3 lần bình thường, lượng tinh giảm, có khi bị viêm khớp u mềm có mủ.

...

...

...

- Xuất huyết điểm lấm tấm ở cầu thận và vỏ não.

- Hoại tử ở hạch amidan, hầu họng, khí quản và thực quản; có các điểm hoại tử ở gan, lách, hạch, thận.

- Phổi viêm tụ máu có nhiều vùng bị gan hóa, hoại tử cứng lại.

- Van hồi manh tràng có những nốt loét.

- Hạch lâm ba sưng tụ máu có màu đỏ sẫm.

- Không có mùi khét đặc trưng như lợn nhiễm Leptospira

- Bệnh tích chủ yếu ở gan: gan sưng nhạt màu hoặc vàng sẫm nhiễm mỡ, có điểm xuất huyết hoặc hoại tử. Trường hợp mãn tính: gan nhợt nhạt, cứng do hoại tử, xơ hóa

- Thận sưng, màu nhợt nhạt, có thể xuất huyết

- Bàng quang sưng to, mật loãng, xuất huyết đường tiêu hóa.

...

...

...

Phụ lục C

(Quy định)

C.1  MÔI TRƯỜNG LỎNG (EMJH)

C.1.1  Chế môi trường cơ bản:

Cho 2,3 g bột EMJH cơ bản vào bình thuỷ tinh + 900 ml nước cất và đem hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 min. Cũng có thể chế môi trường cơ bản theo công thức sau: 1 gr Na₂HPO₄ + 0,3 gr KH₂PO₄ + 1 gr NaCl + 0,25 gr NH₄Cl + 0,005 gr Vitamin B1 + 900 ml nước cất và đem hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút.

C.1.2  Chế Enrichment:

Dung dịch 1: 0,5 g FeSO₄.7H₂O + nước cất vừa đủ 100 ml (luôn chuẩn bị dung dịch mới).

Dung dịch 2: 2 g MgCl₂.6H₂O + 2 g CaCl₂.2H₂O + nước cất vừa đủ 100 ml.

Dung dịch 3: 0,02 g Vitamin B12 + nước cất vừa đủ tới 100 ml (giữ trong đông lạnh)

...

...

...

Dung dịch 5: 0,4 gr ZnSO₄.7H₂O + nước cất vừa đủ 100 ml

Dung dịch 6: 1 g Vitamin B1 (Thiamin) + nước cất vừa đủ 100 ml

Dung dịch 7: 10 g bột Bovine Albumin Serum + 66 ml nước cất, cho vào máy khuấy từ khuấy đều ở 4°C cho tan hết.

Lần lượt cho các dung dịch trên với liều lượng như sau: 10 ml dung dịch 1 + 1 ml dung dịch 2 + 1 ml dung dịch 3 + 6,25 ml dung dịch 4 + 1 ml dung dịch 5 + 0,5 ml dung dịch 6 + dung dịch 7, cho thêm nước cất vừa đủ 100 ml.

Lắc đều và đem lọc qua lọc milipore

C.1.3  Phối trộn:

Cho 100 ml dung dịch Enrichment vào 900 ml môi trường cơ bản ta được 1 lít môi trường EMJH, chỉnh pH = 7,5 bằng các dung dịch HCl 1N và NaOH 1N.

C.1.4  San môi trường:

Chia vào các ống nghiệm, mỗi ống 3 ml. Tất các thao tác pha chế và chia môi trường phải được tiến hành trong buồng cấy vô trùng.

...

...

...

Cho 2 g thạch vào 900 ml môi trường cơ bản, đem hấp 121°C trong 20 phút cho thạch tan hoàn toàn, để nguội còn 50°C, cho 100 ml Enrichment vào và lắc đều, chỉnh pH = 7,5 và chia các ống nghiệm, mỗi ống khoảng 5 ml. Tất các thao tác pha chế và chia môi trường phải được tiến hành trong buồng cấy vô trùng.

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Monosop

1.  Thuốc nhuộm

Dung dịch 1: dùng để cố định tiêu bản

...

...

...

1 ml

Formol (Formaldehyde 10% - CH₂O)

2 ml

Nước cất (H₂O)

100 ml

Dung dịch 2: dùng để gắn màu

Acide Tanic (Tanin - C₇₆H₅₂O₄₆)

5 g

...

...

...

1 ml

Nước cất (H₂O)

100 ml

Dung dịch 3: dùng để nhuộm màu bạc

Dung dịch 10X:

Nitrate bạc (AgNO₃)

5 g

Nước cất

...

...

...

Thêm từng giọt Amonium hydroxyde (NH₄OH) cho tới khi dung dịch trong trở lại.

Dung dịch nhuộm: Pha loãng dung dịch 10X theo tỷ lệ 1:10 (1 phần dung dịch 10X + 9 phần nước cất)

2. Phương pháp nhuộm

Nhỏ dung dịch 1 lên tiêu bản đã để khô, để 1 - 2 min sau đó rửa bằng nước cất.

Nhỏ dung dịch 2, đun 1 - 2 min và rửa sạch bằng nước cất.

Nhỏ dung dịch 3, đun 1 - 2 min và rửa sạch bằng nước cất, để khô và đem soi trên kính hiển vi quang học. Leptospira sẽ bắt màu nâu đậm trên nền vàng nhạt (giống như sợi thuốc lào).

Phụ lục E

(Quy định)

...

...

...

STT

Nhóm

Loại

Chủng

1

AUTRALIS

Autralis

Ballico

2

...

...

...

Autumnalis

akiyamiA

3

BATAVIAE

Bataviae

Van Tienen

4

AUTRALIS

Bratilava

...

...

...

5

CANICOLA

Canicola

Hond Utrecht IV

6

GYROGENES

Pyrogenes

Salinem

7

...

...

...

Icterohaemorrhagiae

Verdun

8

GRYPPOTYPHOSA

Gryppotyphosa

Moskva V

9

SEJROE

Hardjo

...

...

...

10

HEBDOMADIS

Hebdomadis

Hebdomadis

11

JAVAN ICA

Javanica

Veldrat Bataviae 46

12

...

...

...

Panama

Cz 214k

13

SEMARANGA

Patoc

Patoc 1

14

POMONA

Pomona

...

...

...

15

TARASSOVI

Tarassovi

Mitis Johnson

16

SEJROE

saxkoebing

Mus 24

E2. Quy trình phản ứng MAT

...

...

...

Bước 2: Huyết thanh được pha loãng ở nồng độ 1/50 (VD: 20 µl huyết thanh + 980 µl dung dịch PBS)

Bước 3: Sử dụng 16 chủng Leptospira làm kháng nguyên để xác định với huyết thanh kiểm tra bằng cách nhỏ từng kháng nguyên với lượng tương đương với lượng huyết thanh vào mỗi giếng đĩa 96 (Ví dụ: 30 µl kháng nguyên + 30 µl huyết thanh), để lượng huyết thanh pha loãng cuối cùng là 1/100.

Bước 4: Lắc đều và ủ đĩa ở tủ ấm 29 ± 1 °C trong khoảng thời gian từ 1,5 - 4 h

Bước 5: Đọc kết quả dưới kính hiển vi nền đen. Nếu không có kính hiển vi nền đen đọc trên đĩa 96, có thể hút ra lam kính để kiểm tra.

- Phản ứng được đánh giá là dương tính nếu như tại độ pha loãng 1/100 quan sát thấy 50 % vi khuẩn ngưng kết, 50 % vi khuẩn tự do. Nếu vi khuẩn ngưng kết trên 50 % thì tiếp tục pha loãng với các hiệu giá 1/200; 1/400...Ở nồng độ huyết thanh pha loãng nào vẫn gây ngưng kết 50 % vi khuẩn thì kết luận mẫu huyết thanh kiểm tra dương tính ở hiệu giá đó.

- Phản ứng âm tính là phản ứng mà tại đó Leptospira vẫn hoạt động bình thường, có cụm ngưng kết nhỏ hơn 50 % Leptospira ngưng kết.

* Chú ý: một mẫu đối chứng âm dùng dung dịch muối đệm phốt phát, một mẫu đối chứng dương dùng kháng huyết thanh chuẩn.

Phụ lục G

...

...

...

G1. Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Tách chiết ADN theo quy trình của kit Invitrogen (Cat No. 69506): thực hiện như sau:

- Nhỏ 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm vào ống 1,5 ml cùng với 200 µl Lysis buffer có 25 µl proteinase K, lắc đều trên máy lắc trộn Vortex (4.12) trong 15 s rồi ly tâm bằng máy ly tâm (4.11) ở 8 000 g trong 1 min;

- Ủ hỗn hợp này ở 56 °C trong 15 min;

- Ly tâm (4.11) ở 8 000 g trong 1 min, thêm 250 µl etanol 100 % thể tích vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn Vortex trong 15s rồi ủ 5 min;

- Ly tâm (4.11) ở 10 000g trong 1 min;

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp (675 µl) sang cột lọc có ống thu;

- Ly tâm (4.11) ở 8 000 g trong 1 min. Thay cột thu mới;

...

...

...

- Cho 500 µl nước rửa (washing buffer) vào cột lọc. Ly tâm bằng (4.11) 13 000 g trong 1 min;

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ tối đa, bỏ ống thu;

- Đặt cột lọc vào ống thu ADN, nhỏ 50 µl nước không chứa men DNase vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ADN bằng cách ly tâm (4.11) ở 13 000 g trong 1 min, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu ADN;

Bảo quản mẫu ADN thu được ở 4 °C (4.4) trong thời gian ngắn trước khi tiến hành chạy realtime PCR.

Nếu thực hiện sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ dưới âm 20 °C (4.5).

G2. Trình tự mồi và đầu dò

Bảng 3 - Cặp mồi và đầu dò^[3^]^,^[4^]

Mồi (primers)

Trình tự (5’-3’)

...

...

...

CCC GCG TCC GAT TAG

Mồi ngược (reverse primer)

TCC ATT GTG GCC GR^A/G A CAC

Mẫu dò (probe)

(FAM) CTC ACC AAG GCG ACG ATC GGT AGC(TAMRA)

G3. Thành phần phản ứng Realtime PCR

Bảng 4 - Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần

Thể tích (µl)

...

...

...

6,0

Platinum SuperMix UDG

12,5

Mồi xuôi

0,5

Mồi ngược

0,5

Probe

0,5

...

...

...

5

Tổng thể tích

25

E4. Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Bảng 5 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR^[4]

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

95 °C

...

...

...

1 vòng

95 °C

05 s

40 vòng

58 °C

30 s

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Leptospirosis - chapter 2.1.12 - Vesion adroptedby the World Assembly of delegates of the OIE in May 2014.

...

...

...

[3] Duangjai SUWANCHAROEN và cs “Evaluation of loop-mediated isothermal amplifcation method (LAMP) for pathogenic Leptospira spp. detection with leptospires isolation and real-time PCR"

[4] *Pascale Bourhy, Syvie Bremont, Farida Zinini và cs “Comparison of Real-Time PCR Assays for Detection of Pathogenic Leptospira spp. in Blood and Identification of Variations In Target Sequences”

[5] Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh Xoắn khuẩn do Leptospira

1) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.