Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10475:2014 về Dầu mỡ động vật và thực vật - Phân tích metyl este của các axit béo bằng sắc kí khí

• Số hiệu: TCVN10475:2014
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2014

Đường kính trong của cột mm	Dòng khí mang ml/min
2	từ 15 đến 25
3	từ 20 đến 40
4	từ 40 đến 60

Bảng 2

Nồng độ pha tĩnh

Nhiệt độ cột

% (m/m)

°C

5

175

10

180

...

...

...

185

20

185

5.1.1.2. Cột mao quản

Thuộc tính hiệu suất và độ thẩm thấu của cột mao quản dùng để tách các thành phần và thời gian phân tích phần lớn phụ thuộc vào tốc độ dòng khí mang trong cột. Do đó cần tối ưu hóa các điều kiện thao tác bằng cách tác động vào các tham số này (hoặc đơn giản hơn là tác động lên đầu ra của cột), tùy thuộc vào việc muốn cải thiện quá trình tách hoặc để thực hiện phép phân tích nhanh.

5.1.2. Xác định số lượng đĩa lý thuyết (hiệu suất) và độ phân giải (Xem Hình 1).

Hình 1 - Sắc ký đồ để xác định số lượng đĩa lý thuyết (hiệu suất) và độ phân giải

Tiến hành phép phân tích hỗn hợp metyl stearat và metyl oleat với khoảng tỷ lệ tương đương (ví dụ: metyl este từ bơ cacao).

...

...

...

Tính số lượng đĩa lý thuyết, n (hiệu suất) theo Công thức:

và độ phân giải, R, theo Công thức:

Trong đó

d_r(l) là khoảng lưu từ khi sắc đồ bắt đầu cho pic metyl stearat cực đại, tính bằng milimet, (mm);

ω_(l) và ω_(ll) là chiều rộng của pic metyl stearat và pic metyl oleat tương ứng đo được giữa các giao điểm của các tiếp tuyến tại các điểm uốn của đồ thị với đường đi qua gốc tọa độ, tính bằng milimet, (mm);

∆ là khoảng cách giữa pic metyl stearat cực đại và pic metyl oleat cực đại.

Các điều kiện thao tác được chọn là các điều kiện sẽ cho ít nhất 2 000 đĩa lý thuyết trên mét chiều dài cột đối với metyl stearat và độ phân giải ít nhất là 1,25.

...

...

...

Dùng xyranh (4.2) lấy từ 0,1 μl đến 2 μl dung dịch metyl este đã chuẩn bị theo ISO 5509^1) và bơm vào cột.

Trong trường hợp không có các este trong dung dịch thì chuẩn bị dung dịch có nồng độ khoảng 100 mg/ml trong heptan và bơm từ 0,1 μl đến 1 μl dung dịch này.

Nếu phép phân tích chỉ cho lượng vết nhỏ các thành phần thì cần tăng cỡ phần mẫu thử (tăng đến 10 lần).

5.3. Phân tích

Các điều kiện thao tác được quy định trong 5.1.1.

Tuy nhiên, có thể tiến hành phân tích ở nhiệt độ cột thấp hơn khi xác định các axit béo có ít hơn 12 nguyên tử carbon, hoặc phân tích ở nhiệt độ cao hơn khi xác định các axit béo có nhiều hơn 20 nguyên tử carbon. Đôi khi, có thể sử dụng chương trình nhiệt độ trong cả hai trường hợp này. Ví dụ: nếu mẫu thử chứa metyl este của axit béo có ít hơn 12 nguyên tử carbon thì bơm mẫu ở 100 °C (hoặc ở từ 50 °C đến 60 °C nếu có mặt axit butyric) và tăng ngay nhiệt độ ở tốc độ từ 4 °C/min đến 8 °C/min đến nhiệt độ tối ưu. Trong các trường hợp cụ thể, tiến hành đồng thời hai quy trình.

Sau khi nhiệt độ đã được cài đặt, tiếp tục rửa giải ở nhiệt độ không đổi cho đến khi tất cả các thành phần được rửa giải. Nếu thiết bị không có chương trình cài đặt nhiệt độ thì sử dụng thiết bị ở hai nhiệt độ cố định trong khoảng từ 100 °C đến 195 °C.

Nên tiến hành phân tích trên hai pha tĩnh có độ phân cực khác nhau để chứng minh không có mặt các pic bị che phủ, nếu cần, ví dụ: đối với dầu cá hoặc trong trường hợp có mặt đồng thời liên kết C_18:3 và C_20:0 hoặc C_18:3 và C_18:2.

5.4. Chuẩn bị sắc ký đồ chuẩn và đồ thị chuẩn

...

...

...

Phải tránh các điều kiện đo làm xuất hiện “các pic bị che phủ”, nghĩa là độ phân giải không đủ để tách riêng hai thành phần.

6. Biểu thị kết quả

6.1. Phân tích định tính

Nhận biết các pic metyl este của mẫu thử từ đồ thị được chuẩn bị trong 5.4 bằng phép nội suy, nếu cần.

6.2. Phân tích định lượng

6.2.1. Xác định thành phần

Trừ các trường hợp đặc biệt, sử dụng phương pháp nội chuẩn, nghĩa là toàn bộ các thành phần của mẫu được thể hiện trên sắc ký đồ, sao cho tổng diện tích bên dưới các pic thể hiện 100 % các thành phần (tổng rửa giải)

Nếu các thiết bị bao gồm cả bộ tích phân, thì sử dụng các số liệu thu được từ bộ tích phân. Nếu không, xác định diện tích bên dưới mỗi pic bằng cách nhân chiều cao pic với chiều rộng pic tại giữa chiều cao và đưa vào công thức tính các độ pha loãng khác được sử dụng trong suốt quá trình ghi, khi cần.

6.2.2. Phương pháp tính

...

...

...

Tính hàm lượng thành phần đã cho thứ i, biểu thị theo phần trăm khối lượng của metyl este bằng cách xác định phần trăm diện tích pic tương ứng so với tổng diện tích tất cả các pic, bằng công thức sau:

Trong đó

A_i là diện tích dưới pic tương ứng với thành phần thứ i;

ΣA là tổng diện tích dưới tất cả các pic.

Lấy kết quả đến một chữ số thập phân.

CHÚ THÍCH 7: Trong trường hợp này, kết quả tính toán tùy thuộc vào diện tích tương ứng tính theo phần trăm khối lượng. Nếu không xem 6.2.2.2.

6.2.2.2. Sử dụng hệ số hiệu chính

Trong trường hợp cụ thể, ví dụ trong trường hợp có mặt các axit béo có ít hơn 8 nguyên tử carbon hoặc axit có các nhóm chức phụ thì sử dụng các detector dẫn nhiệt hoặc khi cần độ chính xác cao nhất nên sử dụng các hệ số hiệu chính để chuyển phần trăm diện tích pic sang phần trăm khối lượng các thành phần.

...

...

...

Đối với hỗn hợp chất chuẩn so sánh này, phần trăm khối lượng của thành phần thứ i được tính theo công thức:

Trong đó:

m_i là khối lượng thành phần thứ i trong hỗn hợp chất chuẩn so sánh;

Σm là khối lượng tổng số các thành phần khác nhau trong hỗn hợp chất chuẩn so sánh.

Từ sắc ký đồ của hỗn hợp chất chuẩn so sánh (5.4), tính phần trăm (diện tích) đối với thành phần thứ i như sau:

Trong đó:

A_i là diện tích dưới pic tương ứng với thành phần thứ i;

...

...

...

Hệ số hiệu chính được tính như sau:

Thông thường, hệ số hiệu chính được biểu thị tương quan theo K_C16 vì thế hệ số tương quan tính như sau:

Đối với mẫu thử thì hàm lượng mỗi thành phần thứ i được tính theo phần trăm khối lượng metyl este:

Lấy kết quả đến một chữ số thập phân.

6.2.2.3. Sử dụng chất chuẩn nội

Trong các phép phân tích cụ thể (ví dụ khi không định lượng được tất cả các axit béo chẳng hạn khi có mặt đồng thời các axit có 4 carbon và 6 carbon, các axit mạch dài có 16 carbon và 18 carbon hoặc khi cần xác định lượng axit béo nguyên chất trong mẫu thử) thì cần sử dụng chất chuẩn nội. Thường sử dụng các axit béo có 5 carbon, 15 carbon hoặc 17 carbon. Cần xác định hệ số hiệu chính (nếu có) đối với chất chuẩn nội.

...

...

...

Trong đó:

A_i là diện tích dưới pic tương ứng với thành phần thứ i;

A_s là diện tích dưới pic tương ứng với chất chuẩn nội;

K’_i là hệ số hiệu chính đối với thành phần thứ i (liên quan đến K_C16);

K’_s là hệ số hiệu chính đối với chất chuẩn nội (liên quan đến K_C16);

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng miligam (mg);

m_s là khối lượng chất chuẩn nội, tính bằng miligam (mg).

Lấy kết quả đến một chữ số thập phân.

...

...

...

Các giá trị đối với độ lặp lại và độ tái lập được nêu dưới đây bao gồm cả việc chuẩn bị các metyl este theo ISO 5509^1), cùng với phép phân tích sắc ký khí được quy định trong tiêu chuẩn này.

6.2.3.1. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa các giá trị của hai phép xác định, tiến hành nhanh liên tiếp trên cùng một mẫu thử, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị đối với các thành phần có mặt với các lượng vượt quá 5 % (khối lượng), không được quá 3 % (tương đối) giá trị xác định được, với chênh lệch tối đa 1 % (khối lượng). Đối với các thành phần có mặt với các lượng nhỏ hơn, thì chênh lệch này không được quá giá trị 0,2 % (khối lượng).

6.2.3.2. Độ tái lập

Chênh lệch giữa các giá trị của kết quả cuối cùng thu được trong hai phòng thử nghiệm khác nhau, sử dụng cùng một phương pháp để phân tích cùng một mẫu phòng thử nghiệm đối với các thành phần có mặt với các lượng vượt quá 5 % (khối lượng), không được quá 10 % (tương đối) giá trị xác định được, với chênh lệch tối đa 3 % (khối lượng). Đối với các thành phần có mặt với các lượng nhỏ hơn, chênh lệch này không được quá giá trị 0,5 % (khối lượng).

7. Trường hợp đặc biệt - Sử dụng detector đo độ dẫn nhiệt của khí (làm việc dựa trên nguyên tắc đo sự thay đổi độ dẫn nhiệt)

Có thể sử dụng phương pháp sắc ký khí sử dụng detector làm việc dựa trên nguyên tắc đo sự thay đổi độ dẫn nhiệt (độ dẫn nhiệt của khí) để định lượng và định tính thành phần hỗn hợp metyl este của axit béo.

Nếu sử dụng phương pháp này thì các điều kiện được quy định trong Điều 4 và Điều 5 cần được thay đổi như trong Bảng 3.

Đối với phép phân tích định lượng thì sử dụng hệ số hiệu chính được quy định trong 6.2.2.2.

...

...

...

Thông số

Giá trị/điều kiện

Cột

Chiều dài: từ 2 m đến 4 m

Đường kính trong: 4 mm

Giá đỡ

Cỡ hạt khoảng từ 160 μm đến 200 μm

Nồng độ pha tĩnh

Từ 15 % (khối lượng) đến 25 % (khối lượng)

...

...

...

Heli hoặc hydro có hàm lương oxy thấp nhất có thể

Khí phụ trợ

Không có

Nhiệt độ bơm

Cao hơn nhiệt độ cột từ 40 °C đến 60 °C

Nhiệt độ cột

Từ 180 °C đến 200 °C

Dòng khí mang

Thường khoảng từ 60 ml/min đến 80 ml/min

...

...

...

Thường khoảng từ 0,5 μl đến 2 μl

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp thử đã dùng để chuẩn bị metyl este và để phân tích sắc ký khí và các kết quả thử nghiệm thu được. Báo cáo cũng phải nêu rõ tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

Báo cáo cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

1) Tiêu chuẩn ISO 5509:1978 đã hủy và thay thế bằng tiêu chuẩn ISO 12966-2:2011 được chấp nhận thành TCVN 9675-2:2013 (ISO 12966-2:2011). Dầu mỡ động vật và thực vật - Phương pháp sắc kí khí các metyl este của axit béo - Phần 2: Chuẩn bị metyl este của axit béo.