Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-4:2015 Phát hiện và định lượng coliform và E.coli kỹ thuật đếm số thông dụng

• Số hiệu: TCVN11039-4:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

Tryptose hoặc trypticase	20 g
Lactose	5 g
Kali hydro phosphat (K2HPO4)	2,75 g
Kali dihydro phosphat (KH2PO4)	2,75 g
Natri clorua (NaCl)	5 g
Natri lauryl sulfat	0,1 g
Nước cất	1 lít

A.1.2. Chuẩn bị

Phân phối các phần 10 ml vào các ống Durham 20 mm x 150 mm chứa các ống lên men 10 mm x 75 mm đã úp ngược. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2.

A.2. Canh thang brilliant green-lactose-mật

A.2.1. Thành phần

Pepton

10 g

Lactose

10 g

Mật bò khô

...

...

...

Brilliant green

0,0133 g

Nước cất

1 lít

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan pepton và lactose trong 500 ml nước cất. Thêm 20 g mật bò khô đã hòa tan trong 200 ml nước cất, pH của dung dịch này phải đạt tử 7,0 đến 7.5. Trộn và thêm nước đến 975 ml. Chỉnh pH đến 7,4. Thêm 13,3 ml brilliant green 0,1 % trong nước cất. Thêm nước cất vừa đủ 1 lit. Phân phối vào các ống Durham, sao cho mức chất lỏng phủ các ống Durham đã được úp ngược. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,2 ± 0,1.

A.3. Canh thang EC

A.3.1. Thành phần

Trypticase hoặc tryptose

...

...

...

Hỗn hợp các muối mật No. 3

1.5 g

Lactose

5 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

4 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1.5 g

Natri clorua (NaCI)

...

...

...

Nước cất

1 lít

A.3.2. Chuẩn bị

Phân phối các phần 8 ml vào các ống 16 mm x 150 mm chứa các ống lên men 10 mm x 75 mm đã úp ngược. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.4. Thạch eosin Levine-metylen xanh (L-EMB)

A.4.1. Thành phần

Pepton

10 g

Lactose

...

...

...

Kali hydro phosphat

2 g

Thạch

15g

Eosin Y

0,4 g

Metylen xanh

0,065 g

Nước cất

...

...

...

A.4.2. Chuẩn bị

Đun sôi để hòa tan pepton, phosphat và thạch trong 1 lít nước. Bù nước đến thể tích ban đầu, nếu cần. Phân phối các phần 100 hoặc 200 ml và hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ không quá 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,1 ± 0,2.

Trước khi sử dụng, làm tan chảy thạch và cứ mỗi phần 100 ml thì thêm:

5 ml dung dịch lactose 20 % vô trùng;

2 ml dung dịch 2 % eosin Y;

4,3 ml dung dịch metylen xanh 0,15 %.

Khi sử dụng sản phẩm khô, đun sôi để hòa tan tất cả các thành phần trong 1 lít nước. Phân phối các phần 100 ml hoặc 200 ml và hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,1 ± 0,2.

A.5. Môi trường thạch để đếm đĩa (PCA)

A.5.1. Thành phần

...

...

...

5,0 g

Chất chiết nấm men

2,5 g

Dextrose

1,0 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Đun sôi nước để hòa tan các thành phần. Phân phối môi trường vào các ống hoặc bình thủy tinh có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 °C. pH cuối cùng 7,0 ± 0,2.

A.6. Canh thang trypton (tryptophan), 1 %

A.6.1. Thành phần

Trypton hoặc trypticase

10 g

Nước cất

1 lít

A.6.2. Chuẩn bị

Phân phối các phần 5 ml vào các ống Durham 16 mm x 125 mm hoặc 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

...

...

...

A.7.1. Môi trường 1

A.7.1.1. Thành phần

Bột nước đệm pepton

7 g

Glucose

5 g

Kali hydro phosphat

5 g

Nước cất

...

...

...

A.7.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong 800 ml nước có đun nhẹ. Lọc và để nguội đến 20 °C và thêm nước đến 1 lít. Hấp áp lực từ 12 min đến 15 min at 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.7.2. Môi trường 2

A.7.2.1. Thành phần

Pepton casein

3,5 g

Pepton thịt

3,5 g

Dextrose

...

...

...

Kali phosphat

5 g

Nước cất

1 lít

A.7.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước có đun nhẹ nếu cần. Phân phối 10 ml vào các ống Durham 16 mm x 150 mm và hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ từ 118 °C đến 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.7.3. Môi trường 3

A.7.3.1. Thành phần

Pepton

...

...

...

Glucose

5 g

Đệm phosphat

5 g

Nước cất

1 lít

A.7.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Phân phối 10 ml vào các ống Durham 16 mm x 150 mm và hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,5 ± 0,2.

A.8. Canh thang xitrat Koser

...

...

...

Natri amoni hydro phosphat ngậm bốn phân tử nước (NaNH₄HPO₄·4H₂O)

1,5 9

Kali hydro phosphat

1 g

Magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄·7H₂O)

0,2 g

Natri xitrat ngậm hai phân tử nước

3 g

Nước cất

...

...

...

A.8.2. Chuẩn bị

Phân phối vào các ống nắp vặn nếu có yêu cầu. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,2 ± 0,2.

CHÚ THÍCH: Công thức này được nêu trong các phương pháp phân tích của AOAC. Công thức này khác với môi trường khô bán sẵn. Môi trường này được coi là thích hợp.

A.9. Thuốc thử Kovacs

A.9.1. Thành phần (Tham khảo [1])

p-Dimethylaminobenzaldehyde

5 g

2-Metylbutan-2-ol (amyl alcohol)

75 ml

...

...

...

25 ml

A.9.2. Chuẩn bị

Hòa tan p-dimethylaminobenzaldehyde trong 2-metylbutan-2-ol. Thêm từ từ axit clohydric đặc. Bảo quản ở 4 °C. Để thử indol, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử đã chuẩn bị vào 5 ml chủng cấy vi khuẩn trong canh thang trypton 24 h. Phản ứng dương tính indol nếu có màu đỏ sẫm trên lớp bề mặt. Đối với E. coli gây bệnh đường ruột, nếu âm tính sau 24 h thì thử thêm sau 72 h.

A.10. Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP)

A.10.1. Dung dịch alpha-naphthol trong etanol

Thành phần:

alpha-Naphthol

5 g

Etanol (tuyệt đối)

...

...

...

A.10.2 Dung dịch kali hydroxit, 40 % (khối lượng)

Thành phần:

Kali hydroxit

40 g

Nước cất

100 ml

A.10.3. Phép thử Voges-Proskauer (VP)

Ở nhiệt độ phòng, chuyển 1 ml chủng cấy 48 h vào ống nghiệm và thêm 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Lắc sau khi thêm mỗi dung dịch. Để tăng cường độ và tốc độ phản ứng, thêm vài tinh thể creatine vào hỗn hợp. Đọc kết quả sau khi thêm các thuốc thử 4 h. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng eosin.

A.11. Dung dịch pha loãng phosphat Butterfield

...

...

...

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

34 g

Nước cất

500 ml

A.11.2. Chuẩn bị

Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M. Thêm nước đến 1 lít. Tiệt trùng 15 min ở 121 °C. Bảo quản trong tủ lạnh.

Thuốc thử trắng pha loãng: Lấy 1,25 ml dung dịch gốc nêu trên, thêm nước đến 1 lít. Phân phối vào các chai 90 ml hoặc 99 ml ± 1 ml. Tiệt trùng 15 min ở 121 °C.

A.12. Chất chỉ thị metyl đỏ

Metyl đỏ

...

...

...

Etanol (95 %)

300 ml

Nước cất

500 ml

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch

[2] TCVN 4882:2007 (ISO 4831:2006) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng coliform - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất

[3] TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

...

...

...