|
BỘ
Y TẾ
-------
|
CỘNG
HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------
|
|
Số:
2679/QĐ-BYT
|
Hà
Nội, ngày 22 tháng 8 năm 2025
|
QUYẾT ĐỊNH
VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI
LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ DỊ ỨNG - MIỄN DỊCH LÂM SÀNG -
TẬP 2”
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;
Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27/02/2025 của Chính phủ quy định
chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;
Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18/10/2024 của Bộ trưởng Bộ
Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh;
Căn cứ Biên bản họp
ngày 21/3/2024 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu quy trình kỹ thuật về Dị ứng
- Miễn dịch lâm sàng; Biên bản họp ngày 15/7/2025 về xây dựng định mức kinh tế
- kỹ thuật dịch vụ khám bệnh, chữa bệnh về Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng và công
văn số 4698/BM-KHTH ngày 21/7/2025 của Bệnh viện Bạch Mai gửi Cục QLKCB dự thảo
quy trình kỹ thuật về Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng đã được Chủ tịch Hội đồng
nghiệm thu duyệt dự thảo;
Theo đề nghị của Cục
trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.
QUYẾT ĐỊNH:
Điều
1.
Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn “Hướng
dẫn quy trình kỹ thuật về Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng - Tập 2”, gồm 24 quy
trình kỹ thuật.
Điều
2.
Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Dị ứng
- Miễn dịch lâm sàng - Tập 2” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh
từ ngày 01 tháng 07 năm 2026.
Điều
3.
Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ, Cục trưởng Cục Quản lý
Khám, chữa bệnh, Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các
bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc
trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu
trách nhiệm thi hành Quyết định này./.
|
Nơi nhận:
-
Như Điều 3;
- Bộ trưởng (để báo cáo);
- Các Thứ trưởng;
- BHXHVN - Bộ Tài chính;
- Cổng thông tin điện tử Bộ Y tế;
- Website Cục QLKCB;
- Tổng hội Y học Việt Nam và các hội y khoa;
- Lưu: VT, KCB.
|
KT.
BỘ TRƯỞNG
THỨ TRƯỞNG
Trần Văn Thuấn
|
HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ
THUẬT
VỀ DỊ ỨNG-MIỄN DỊCH LÂM
SÀNG-TẬP 2
(Ban
hành kèm theo Quyết định số 2679/QĐ-BYT ngày 22 tháng 8 năm 2025 của Bộ trưởng
Bộ Y tế)
DANH SÁCH BAN SOẠN THẢO
|
Chỉ
đạo biên soạn, thẩm định
|
|
|
GS.TS.
Trần Văn Thuấn
|
Thứ
trưởng Bộ Y tế
|
|
TS. Hà
Anh Đức
|
Cục trưởng
Cục Quản lý Khám, chữa bệnh (QLKCB)
|
|
Chủ
biên
|
|
|
TS.
Nguyễn Hoàng Phương
|
Giám đốc
Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai, Phó trưởng Bộ môn
Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội, Chủ tịch Hội Hen, Dị
ứng - Miễn dịch lâm sàng Việt Nam
|
|
TS. Vương
Ánh Dương
|
Phó Cục
trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh
|
|
Tham
gia biên soạn, thẩm định
|
|
|
TS. Phạm
Huy Thông
|
Phó Giám
đốc Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai, Tổng Thư ký
Hội Hen, Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Việt Nam
|
|
TS.
Nguyễn Hữu Trường
|
Trung tâm
Dị ứng Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
BS. Chu
Chí Hiếu
|
Trung tâm
Dị ứng Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
KS. Phan
Ngọc Bích
|
Kỹ thuật
viên trưởng Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
TS.
Nguyễn Lan Anh
|
Giám đốc
trung tâm Da liễu - Dị ứng, Chủ nhiệm khoa Dị ứng, Bệ nh viện Trung ương Quân
đội 108
|
|
TS. Bùi
Văn Dân
|
Trưởng
khoa Da liễu - Dị ứng Bệnh viện E
|
|
TS.
Nguyễn Văn Đĩnh
|
Trưởng
khoa Nội chung, Trưởng Đơn vị Dị ứng, Bệnh viện Vinmec Times City
|
|
PGS.TS.
Phan Quang Đoàn
|
Nguyên
trưởng Bộ môn Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội
|
|
PGS.TS.
Nguyễn Văn Đoàn
|
Nguyên
Giám đốc Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai, nguyên
trưởng Bộ môn Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội
|
|
ThS.
Nguyễn Thị Thanh Hà
|
Trưởng
phòng Chế độ bảo hiểm y tế, Ban Thực hiện chính sách bảo hiểm y tế, Bảo hiểm
xã hội Việt Nam
|
|
PGS.TS.
Trần Thúy Hạnh
|
Nguyên
Giám đốc Bệnh viện Bạch Mai, Phó Chủ tịch Hội Hen, Dị ứng - Miễn dịch lâm
sàng Việt Nam
|
|
ThS. Vũ
Thị Hằng
|
Trung tâm
Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
PGS.TS.
Trịnh Mạnh Hùng
|
Nguyên
Phó trưởng khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai, nguyên
Trưởng khoa Dị ứng - Hô hấp, Bệnh viện Hữu Nghị
|
|
TS. Bùi
Văn Khánh
|
Trung tâm
Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
PGS.TS.
Hoàng Thị Lâm
|
Bệnh viện
Tâm Anh thành phố Hồ Chí Minh
|
|
PGS.TS.
Đặng Hùng Minh
|
Phó
Trưởng khoa Khám bệnh, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
ThS.
Trương Lê Vân Ngọc
|
Trưởng
phòng Nghiệp vụ, Cục Quản lý Khám, chữa bệnh
|
|
ThS.
Nguyễn Như Nguyệt
|
Trung tâm
Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
TS.
Trương Thái Phương
|
Trưởng
khoa Vi sinh, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
BSCKII.
Trần Thái Sơn
|
Trưởng
khoa Da Liễu, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
PGS.TS.
Lê Đình Tùng
|
Phó Hiệu
trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Phụ trách Bộ môn Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng,
Trường Đại học Y Hà Nội
|
|
PGS.TS.
Vũ Thị Minh Thục
|
Nguyên
Trưởng khoa Dị ứng, Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương
|
|
GS.TS.
Phạm Văn Thức
|
Nguyên
Hiệu trưởng Đại học Y Dược Hải Phòng, Chủ tịch Hội Miễn dịch trị liệu ung thư
Việt Nam
|
|
PGS.TS.
Nguyễn Thị Vân
|
Nguyên
Giảng viên cao cấp bộ môn Dị ứng miễn dịch lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội
Hà Nội
|
|
Thư ký
|
|
|
KS. Phan
Ngọc Bích
|
Kỹ thuật
viên trưởng Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
CN. Vũ
Thị Dung
|
Trung tâm
Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
CN.
Nguyễn Thị Hoa
|
Trung tâm
Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
BSCKI.
Đoàn Quang Hiệt
|
Chuyên
viên phòng Phục hồi chức năng và Giám định, Cục Quản lý Khám, chữa bệnh
|
|
ThS.
Nguyễn Minh Hoàng
|
Trung tâm
Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai
|
|
DS. Đỗ
Thị Ngát
|
Chuyên
viên phòng Nghiệp vụ, Cục Quản lý Khám, chữa bệnh
|
|
BsCKII.
Cao Đức Phương
|
Chuyên
viên chính Phòng Quản lý hành nghề khám bệnh, chữa bệnh, Cục QLKCB
|
|
ThS. Đỗ
Thị Huyền Trang
|
Cục Quản
lý Khám, chữa bệnh
|
LỜI NÓI ĐẦU
Hướng dẫn quy trình kỹ
thuật là tài liệu chuyên môn hướng dẫn thực hiện kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh
trên lâm sàng, đồng thời là tài liệu để hỗ trợ công tác giảng dạy, đào tạo thực
hiện kỹ thuật. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật được Bộ Y tế ban hành nhằm chuẩn
hóa thực hiện quy trình kỹ thuật tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Đây là
công cụ để làm căn cứ đánh giá sự tuân thủ thực hiện kỹ thuật hoặc kiểm định
lâm sàng, xác định rõ các hoạt động cần phải thực hiện, phân công rõ trách
nhiệm, kiểm tra giám sát và bố trí hợp lý nguồn lực, giảm thiểu tối đa biến cố
bất lợi.
Để chuẩn hóa quy trình
kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh về Dị ứng - Miễn dịch, Bộ Y tế đã giao bệnh
viện Bạch Mai làm đầu mối xây dựng Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật về Dị ứng -
Miễn dịch lâm sàng cùng các bệnh viện E, bệnh viện Nhi Trung ương, bệnh viện
108,… Các bệnh viện được giao đã huy động và phân công các giáo sư, phó giáo
sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng biên soạn Hướng dẫn
quy trình kỹ thuật; tổ chức họp hội đồng khoa học trong bệnh viện để nghiệm
thu; biên tập, hoàn thiện theo ý kiến của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu do Bộ
Y tế thành lập và chịu trách nhiệm về chuyên môn kỹ thuật quy định trong Hướng
dẫn quy trình kỹ thuật. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật được các thành viên biên
soạn rà soát trên các hướng dẫn hiện có, tham khảo các tài liệu trong nước,
nước ngoài để cập nhật.
Bộ Y tế đã thành lập
Hội đồng chuyên môn nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Dị ứng - Miễn
dịch lâm sàng với sự tham gia của một số Vụ, Cục chức năng của Bộ Y tế, các
chuyên gia hàng đầu về Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng. Các thành viên chuyên môn
đã làm việc với tinh thần trách nhiệm, đóng góp về thời gian, trí tuệ, kinh
nghiệm để góp ý, nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật.
Hướng dẫn Quy trình kỹ
thuật về Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng - Tập 2 được xây dựng cho các kỹ thuật có
trong Phụ lục số 02 nhưng không có trong Phụ lục số 01 (của Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của
Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh) đã
được Hội đồng nghiệm thu với tổng số 24 quy trình kỹ thuật và được áp dụng tại
các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh từ ngày 01 tháng 7 năm 2026
Bộ Y tế xin trân trọng
cảm ơn sự đóng góp tích cực và hiệu quả của các chuyên gia về Dị ứng - Miễn
dịch lâm sàng, đặc biệt là tập thể lãnh đạo và nhóm thư ký biên soạn và nghiệm
thu của Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch, Bệnh viện Bạch Mai.
Trong quá trình biên
tập khó tránh được những sai sót, chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý
kiến từ quý độc giả đồng nghiệp để Tài liệu chuyên môn ngày một hoàn thiện hơn.
Mọi ý kiến góp ý xin gửi về Cục Quản lý Khám, chữa bệnh - Bộ Y tế, 138A phố
Giảng Võ, phường Giảng Võ, Hà Nội.
Xin trân trọng cảm ơn!
|
|
GS.TS.
Trần Văn Thuấn
THỨ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
|
NGUYÊN TẮC ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
1. Hướng dẫn quy trình
kỹ thuật được xây dựng và ban hành theo từng chương, chuyên ngành; bao gồm các
quy định về chỉ định, chống chỉ định, thận trọng, chuẩn bị thực hiện kỹ thuật,
đến các bước thực hiện theo trình tự từ khi bắt đầu đến khi kết thúc thực hiện
kỹ thuật.
2. Tài liệu chuyên môn
Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng - Tập 2 được xây
dựng và ban hành cho các kỹ thuật có trong Phụ lục số 02 nhưng không có trong
Phụ lục số 01 Thông tư số 23/2024/TT-BYT
ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật
trong khám bệnh, chữa bệnh. Tài liệu chuyên môn này được áp dụng tại các cơ sở
khám bệnh, chữa bệnh từ ngày 01 tháng 7 năm 2026.
3. Quy định về thời
gian thực hiện kỹ thuật, nhân lực (chức danh chuyên môn nghề nghiệp, số lượng
nhân lực), thuốc, thiết bị y tế… trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật do Bộ Y tế
ban hành dựa trên tính phổ biến, thường quy thực hiện tại cơ sở khám bệnh, chữa
bệnh. Trong thực tế triển khai, căn cứ diễn biến lâm sàng, tình trạng người
bệnh, điều kiện thực tế của cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, việc triển khai kỹ
thuật có thể cần huy động thêm nhân lực chuyên môn, bổ sung thuốc, thiết bị y
tế..., tăng thời gian thực hiện kỹ thuật…
4. Chỉ sử dụng các
thuốc, thiết bị y tế… được cấp phép lưu hành theo quy định hiện hành.
5. Trong quá trình
triển khai áp dụng Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, nếu thấy các bất cập hoặc nhu
cầu cần sửa đổi, bổ sung, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chủ động cập nhật và
ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, đồng thời báo cáo, đề xuất Bộ Y tế (Cục
QLKCB) về việc cập nhật để ban hành áp dụng trong cả nước.
MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU
NGUYÊN TẮC ÁP DỤNG
HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ
VIẾT TẮT
PHỤ LỤC: DANH MỤC KỸ
THUẬT VỀ DỊ ỨNG - MIỄN DỊCH LÂM SÀNG
1. Định lượng kháng thể
kháng Actin
2. Định lượng kháng thể
kháng kháng nguyên gan hòa tan - anti SLA
3. Định lượng kháng thể
kháng kháng nguyên gan tụy - anti LP
4. Định lượng kháng thể
kháng Gliadin
5. Định lượng kháng thể
kháng AChR Ab
6. Định lượng kháng thể
kháng MuSK
7. Định lượng kháng thể
kháng cơ trơn (SM)
8. Định lượng kháng thể
kháng NMDA
9. Glutamate receptor
(type NMDA) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
10. Glutamate receptor
(type AMPA1) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
11. Glutamate receptor
(type AMPA2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
12. Glutamate receptor
(type AMPA1/2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
13. Contactin-
associated protein 2 (CASPR2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
14. Dipeptidyl
aminopeptidase - like protein 6 (DPPX) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
15. Leucine- rich
glioma- inactivated protein 1 (LGI1) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
16. Gabab receptor
(GABARB1/B2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
17. Tự kháng thể trong
bệnh viêm não bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
18. Đa tự kháng thể
trong bệnh viêm não bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (2 loại)
19. Đa tự kháng thể
trong bệnh viêm não bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (6 loại)
20. Đa tự kháng thể
trong bệnh viêm màng thận nguyên phát bằng miễn dịch huỳnh quang (2 loại)
21. Tự kháng thể: GBM
(kháng thể trong hội chứng Goodpasture’s) bằng miễn dịch huỳnh quang
22. Đa tự kháng thể
ganglioside trong bệnh thần kinh bằng kỹ thuật sắc ký thanh giấy
23. Đa tự kháng thể
trong hội chứng thần kinh cận u bằng kỹ thuật sắc ký thanh giấy
24. Tiêm hoặc truyền
các chế phẩm sinh học
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
|
Chữ
viết tắt
|
Tiếng
Anh
|
Tiếng
Việt
|
|
AChR Ab
|
Anti-acetylcholine receptor antibody
|
Kháng thể kháng thụ thể Acetylcholine
|
|
AIDS
|
Acquired Immune Deficiency Syndrome
|
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
|
|
ANA
|
Anti nuclear antibody
|
Kháng thể kháng nhân
|
|
ANCA
|
Anti Neutrophil Cytoplasmic Antibody
|
Kháng thể kháng bạch cầu đa nhân trung
tính
|
|
ASA/NSAIDs
|
|
Aspirin và các thuốc chống viêm không
Steroid
|
|
AMA - M2
|
Anti-mitochondrial M2 Antibody
|
Kháng thể kháng kháng nguyên M2 ở ty lạp
thể
|
|
ASGPR
|
Asialoglycoprotein receptor
|
Kháng thể kháng thụ thể Glycoprotein ở
người Châu Á
|
|
AZT
|
Azidothymidine
|
|
|
C
|
Complement
|
Bổ thể
|
|
CCP
|
Cyclic Citrunilate Peptide
|
Peptid Citrullin vòng
|
|
C1INH
|
C1 Inhibitor
|
Chất ức chế C1 Esterase
|
|
CNHH
|
Chức năng hô hấp
|
|
|
COPD
|
Choronic obstructive pulmonary disease
|
Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính
|
|
DRESS
|
Drug rash with eosinophilia and systemic
symptoms
|
Ban đỏ tăng bạch cầu ái toan và triệu
chứng toàn thân do thuốc
|
|
DsDNA
|
Double strains desoxyribonucleic acid
|
Chuỗi kép DNA
|
|
ELISA
|
Enzyme Linked Immuno- Sorbent Assay
|
Phương pháp hấp phụ miễn dịch gắn men
|
|
ENA
|
Extractable Nuclear Antigen
|
Kháng nguyên chiết xuất từ nhân
|
|
EPO
|
Erythroprotein
|
|
|
ESCD
|
European Society of Contact Dermatitis
|
Hội viêm da tiếp xúc Châu Âu
|
|
FeNO
|
Fraction of exhaled nitric oxide
|
|
|
FEV1
|
Forced Expiratory volume during 1st
second
|
Thể tích thở ra gắng sức trong giây đầu
tiên
|
|
FEV1/FVC
|
Gaensler ratio:
|
Chỉ số Gaensler
|
|
FRC
|
Functional residual capacity
|
Dung tích cặn chức năng
|
|
FVC
|
Forced vital capacity
|
Dung tích sống gắng sức
|
|
SJS/TEN
|
Hội chứng Stevens - Johnson
|
Hoại tử thượng bì nhiễm độc
|
|
GMC
|
|
Giải mẫn cảm
|
|
GBM
|
Glomerular basement membrane
|
Kháng thể
kháng màng đáy cầu thận
|
|
HCSP
|
|
Hóa chất
sinh phẩm
|
|
HPQ
|
|
Hen phế
quản
|
|
IVIg
|
Intravenous
Immunoglobulin
|
Globulin
miễn dịch truyền tĩnh mạch
|
|
KN
|
Kháng
nguyên
|
|
|
KT
|
Kháng thể
|
|
|
LP
|
Liver and
Pancreas antigen
|
Kháng
nguyên gan tụy
|
|
MPO
|
Myeloperoxidase
|
|
|
MVV
|
Maximal
voluntary ventilation
|
Thông khí
tự ý tối đa
|
|
NMDA
|
N-Methyl-D-aspartic
acid
|
|
|
QC
|
Quality
Control
|
|
|
FITC
|
Fluorescein
isothiocyanate
|
Chất phát
huỳnh quang Isothiocyanate
|
|
PEF
|
Peak
expiratory flow
|
Lưu lượng
đỉnh thở ra
|
|
PR3
|
Proteinase
3
|
|
|
MuSK
|
Muscle-specific
kinase
|
Kinase
đặc hiệu cơ
|
|
RNP-70
|
Ribonucleoprotein-70
|
|
|
RNA
|
Ribonucleic
acid
|
Axit
Ribonucleic
|
|
RV
|
Residual
volume
|
Thể tích
khí cặn
|
|
Scl-70
|
Topoisomerase
antigen 70 kD
|
Kháng
nguyên Topoisomerase 70 kD
|
|
Sm
|
Smith
|
|
|
SLE
|
Systemic
lupus erythematosus
|
Lupus ban
đỏ hệ thống
|
|
SLA
|
Solube
liver antigen
|
Kháng
nguyên gan hòa tan
|
|
SSA
|
Sjögren's-syndrome-related
antigen A
|
Kháng
nguyên liên quan hội chứng Sjögren type A
|
|
SSB
|
Sjögren's-syndrome-related
antigen B
|
Kháng
nguyên liên quan hội chứng Sjögren type B
|
|
TLC
|
Total
lung capacity
|
Dung tích
phổi toàn phần
|
|
VC
|
Vital
capacity
|
Dung tích
sống
|
PHỤ LỤC
DANH MỤC KỸ THUẬT VỀ DỊ ỨNG - MIỄN DỊCH LÂM
SÀNG
|
STT trong QTKT (cột 1)
|
STT kỹ thuật trong Chương (cột 2)
|
Mã liên kết (cột 3)
|
Tên kỹ thuật được quy định tại phụ lục 2 Thông tư số 23/2023/TT-BYT (cột 4)
|
|
1
|
38
|
|
Định
lượng kháng thể kháng Actin
|
|
2
|
39
|
|
Định
lượng kháng thể kháng kháng nguyên gan hòa tan - Anti SLA
|
|
3
|
40
|
|
Định
lượng kháng thể kháng kháng nguyên gan tụy - Anti LP
|
|
4
|
41
|
|
Định
lượng kháng thể kháng Gliadin
|
|
5
|
42
|
|
Định
lượng kháng thể kháng AChR Ab
|
|
6
|
43
|
|
Định
lượng kháng thể kháng MuSK
|
|
7
|
44
|
|
Định
lượng kháng thể kháng cơ trơn (SM)
|
|
8
|
45
|
|
Định
lượng kháng thể kháng NMDA
|
|
9
|
46
|
|
Glutamate
receptor (type NMDA) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
|
|
10
|
47
|
|
Glutamate
receptor (type AMPA1) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
|
|
11
|
48
|
|
Glutamate
receptor (type AMPA2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
|
|
12
|
49
|
|
Glutamate
receptor (type AMPA1/2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
|
|
13
|
50
|
|
Contactin-associated
protein 2 (CASPR2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
|
|
14
|
51
|
|
Dipeptidyl
aminopeptidase - like protein 6 (DPPX) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
|
|
15
|
52
|
|
Leucine -
rich glioma - inactivated protein 1 (LGI1) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh
quang
|
|
16
|
53
|
|
GABAB receptor
(GABARB1/B2) viêm não tự miễn miễn dịch huỳnh quang
|
|
17
|
56
|
|
Tự kháng
thể trong bệnh viêm não bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
|
|
18
|
57
|
|
Đa tự
kháng thể trong bệnh viêm não bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (2 loại)
|
|
19
|
58
|
|
Đa tự
kháng thể trong bệnh viêm não bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (6 loại)
|
|
20
|
59
|
|
Đa tự
kháng thể trong bệnh viêm màng thận nguyên phát bằng miễn dịch huỳnh quang (2
loại)
|
|
21
|
60
|
|
Tự kháng
thể: GBM (kháng thể trong hội chứng Goodpasture's) bằng miễn dịch huỳnh quang
|
|
22
|
62
|
|
Đa tự
kháng thể ganglioside trong bệnh thần kinh bằng kỹ thuật sắc ký thanh giấy
|
|
23
|
63
|
|
Đa tự
kháng thể trong hội chứng thần kinh cận u bằng kỹ thuật sắc ký thanh giấy
|
|
24
|
120
|
|
Tiêm hoặc
truyền các chế phẩm sinh học
|
1. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG ACTIN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể Actin trong huyết thanh bệnh nhân như một
tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán xơ gan mật nguyên phát.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang.
Mức độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh
nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
-3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng.
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng
bệnh phẩm: pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm
dạng cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2 -8°C
trong 30 ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2 -8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng Actin của nhà sản xuất để nhận định kết
quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối thiểu 5 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vưc nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng
không tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại
thanh test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu
bệnh phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chít mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt: Tiến
hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng Actin của nhà sản xuất để nhận định
kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan huyết
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: Không sử
dụng mẫu máu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường
do bệnh lý cần hòa loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích. Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình, đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. Kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody tests
in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. Hovhannes hayrapetyan,
thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked
immunosorbent assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
2. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG KHÁNG NGUYÊN GAN HÒA TAN - ANTI SLA
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể SLA trong huyết thanh bệnh nhân như một
tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán viêm gan tự miễn type 3.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang.
Mức độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh
nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37º
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đực rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
-3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng
bệnh phẩm: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm
dạng cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C
trong 30 ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu cầu thì sử
dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều không đạt
yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng, báo cáo
lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải quyết.
Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng kháng nguyên gan hòa tan - anti SLA của nhà
sản xuất để nhận định kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo kiểm tra lại
sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2- 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vưc nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng
không tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại
thanh test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu
bệnh phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chit mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu qc
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu cầu thì sử
dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều không đạt
yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng, báo cáo
lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải quyết.
Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng kháng nguyên gan hòa tan - anti SLA
của nhà sản xuất để nhận định kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo kiểm tra lại
sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy trình
liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan huyết
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: Không sử
dụng mẫu máu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường
do bệnh lý cần hòa loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích. Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình, đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. Kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody tests
in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. Hovhannes hayrapetyan,
thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked
immunosorbent assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
3. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG KHÁNG NGUYÊN GAN TỤY - ANTI LP
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể LP trong huyết thanh bệnh nhân như một
tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán xơ gan mật nguyên phát.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang. Mức
độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37º
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đực rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng
bệnh phẩm: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm
dạng cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong
30 ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng kháng nguyên gan tụy - anti LP của nhà sản
xuất để nhận định kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vưc nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng
không tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại
thanh test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu
bệnh phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chit mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng kháng nguyên gan tụy - Anti LP của
nhà sản xuất để nhận định kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan huyết
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: Không sử
dụng mẫu máu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường
do bệnh lý cần hòa loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích. Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy trình,
đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. Kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody tests
in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. Hovhannes hayrapetyan,
thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked immunosorbent
assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
4. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG GLIADIN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể kháng Gliadin trong huyết thanh bệnh nhân
như một tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán bệnh Celiac-không dung nạp Gluten.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang.
Mức độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh
nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37º
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đực rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: Tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng
bệnh phẩm: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm
dạng cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C
trong 30 ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu qc khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng Gliadin của nhà sản xuất để nhận định kết
quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vưc nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng
không tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại
thanh test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu
bệnh phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chit mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu qc
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng gliadin của nhà sản xuất để nhận định
kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan huyết
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: Không sử
dụng mẫu máu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường
do bệnh lý cần hòa loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích.
Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình, đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. Kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody tests
in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. Hovhannes hayrapetyan,
thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked
immunosorbent assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
5. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG AChR Ab
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể kháng AChRAb trong huyết thanh bệnh nhân
như một tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán nhược cơ.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang.
Mức độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh
nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37º
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đực rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng
bệnh phẩm: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm
dạng cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C
trong 30 ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng AChR Ab của nhà sản xuất để nhận định kết
quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vực nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng
không tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại thanh
test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu bệnh
phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chit mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng AChR Ab của nhà sản xuất để nhận định
kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan huyết
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: Không sử
dụng mẫu máu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường
do bệnh lý cần hòa loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích. Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy trình,
đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. Kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody
tests in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. Hovhannes
hayrapetyan, thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked
immunosorbent assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
6. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG MuSK
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể kháng MuSK trong huyết thanh bệnh nhân như
một tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán nhược cơ.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang.
Mức độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh
nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đực rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: Thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: Tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng bệnh
phẩm: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm dạng
cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30
ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng MuSK của nhà sản xuất để nhận định kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vực nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng không
tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2 -8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại
thanh test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu
bệnh phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chit mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng MuSK của nhà sản xuất để nhận định
kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan huyết
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: Không sử
dụng mẫu máu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường
do bệnh lý cần hòa loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích. Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình, đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. Kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody
tests in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. Hovhannes
hayrapetyan, thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked
immunosorbent assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
7. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG CƠ TRƠN (SM)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể kháng cơ trơn (SM) trong huyết thanh bệnh
nhân như một tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán viêm gan tự miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang.
Mức độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh
nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đực rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: Thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: Tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng
bệnh phẩm: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm
dạng cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C
trong 30 ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng cơ trơn (SM) của nhà sản xuất để nhận định
kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vực nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng
không tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại
thanh test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu
bệnh phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chit mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước hoặc
song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng cơ trơn (SM) của nhà sản xuất để nhận
định kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan huyết
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: Không sử
dụng mẫu máu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường
do bệnh lý cần hòa loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích.
Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình, đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. Kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody
tests in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. Hovhannes
hayrapetyan, thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked
immunosorbent assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
8. ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ
KHÁNG NMDA
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của kháng thể kháng NMDA trong huyết thanh bệnh nhân như
một tiêu chuẩn hỗ trợ trong chẩn đoán viêm não tự miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Nguyên lý của kỹ thuật
ELISA là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể. Kháng
nguyên tinh khiết được gắn vào giếng, sau đó cho thêm huyết thanh có chứa kháng
thể cần phát hiện. Bổ sung kháng thể có gắn enzyme, thêm vào cơ chất tạo tín
hiệu màu. Tín hiệu màu có thể xác định được bằng phương pháp đo mật độ quang.
Mức độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ kháng thể có mặt trong huyết thanh bệnh
nhân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1 Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Chai thuỷ tinh nút
mài
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2 Hóa chất, thuốc
thử
- Dung dịch pha loãng bệnh
phẩm
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Dung dịch rửa máy xét
nghiệm
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Hóa chất sinh phẩm
chẩn đoán
- Nước cất 2 lần
2.2.3 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Mắt đọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Vật tư thay thế hệ
thống thủy
- Vật tư thay thế hệ
thống quang
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống máy xét
nghiệm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Thùng đực rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng ngâm dụng cụ
bẩn,…
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: máu tĩnh
mạch, 01 ống không có chất chống đông.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống không có chất
chống đông: Thể tích 3-5ml, mẫu máu không bị đục, không vỡ hồng cầu;
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: Tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
-3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét
nghiệm. Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Để tránh hiện tượng
bay hơi hóa chất sinh phẩm chẩn đoán, hóa chất sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm
tra chất lượng nên phân tích trong vòng 2h.
- Hộp chứa 96 giếng đã
được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong một túi thiếc với gói chất chống
ẩm.
- Các loại chứng bao
gồm các nồng độ.
- Chứng dương tính và
chứng âm tính.
- Dung dịch pha loãng
bệnh phẩm.
- Dung dịch rửa.
- Dung dịch chất cộng
hợp
- Dung dịch cơ chất
- Dung dịch dừng phản
ứng
- Chuẩn bị pha loãng bệnh
phẩm: pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch pha loãng bệnh phẩm dạng
cô đặc (pha loãng 5 lần) với nước cất hai lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30
ngày.
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: pha loãng phần chứa trong mỗi lọ của dung dịch rửa dạng cô đặc (pha loãng
gấp 50 lần) với nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh bệnh nhân) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với dung dịch pha
loãng bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Chuẩn bị đủ số giếng
cần thiết với những mẫu bệnh phẩm đã được pha loãng.
- Cho 100µl mẫu bệnh
phẩm đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Rửa toàn bộ giếng để
loại bỏ những kháng thể trong huyết thanh không gắn kết. Rửa 3 lần với 300µl
của dung dịch rửa.
- Thêm vào 100µl dung
dịch cộng hợp vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Loại bỏ những thành phần
thừa trong những giếng. Rửa 3 lần với 300µl của dung dịch rửa.
- Thêm 100µl dung dịch
cơ chất vào mỗi giếng.
- Ủ giếng trong máy ủ ở
nhiệt độ 20°C - 25°C thời gian 30’
- Thêm 100µl dung dịch
dừng phản ứng vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 5’.
- Khởi động và chọn các
chương trình phần mềm của các máy theo các loại xét nghiệm được yêu cầu.
- Đo mật độ quang học
của mẫu.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa theo tiêu chuẩn
đánh giá xét nghiệm kháng thể kháng NMDA của nhà sản xuất để nhận định kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch
vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng
cầu, không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản làm lạnh ở 2 - 8°C cho tối đa 2 ngày hoặc -20°C trong 6 tháng.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông
1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
- Cần tách huyết thanh
càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng
- Nếu có lẫn hồng cầu
hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại
bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn, không có chất chống đông và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
Máu không vỡ hồng cầu.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm.
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- 1 hộp hóa chất chứa 6
túi, mỗi túi gồm 6 thanh test đã được gắn kháng nguyên và được bảo quản trong
một túi thiếc với gói chất chống ẩm.
- Dung dịch rửa.
- Mẫu calibration, mẫu
control
- Cấu tạo thanh test:
Vị trí số 1: giếng
trống khu vực nhỏ huyết thanh
Vị trí số 2: chất cộng
hợp
Vị trí số 3: dung dịch
pha loãng
Vị trí số 4: dung dịch
cơ chất
Vị trí số 5: giếng không
tráng kháng nguyên
Vị trí số 6: giếng
tráng kháng nguyên
Vị trí số 7: giếng
trống
Vị trí số 8: khu vực mã
code
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: pha loãng dung dịch rửa dạng cô đặc theo tỉ lệ khuyến cáo của hãng với
nước cất 2 lần. Bảo quản tủ lạnh 2-8°C trong 30 ngày.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Kiểm tra đối chiếu
trước khi tiến hành xét nghiệm
- Chuẩn bị đủ loại
thanh test tương ứng với các chỉ định xét nghiệm cần thiết với mẫu chứng, mẫu
bệnh phẩm.
- Cho 50µl mẫu chứng và
mẫu bệnh phẩm vào test
- Cho thanh test vào
đúng vị trí quy định trên máy.
- Chit mã code cho mỗi
thanh test
- Các bước tiến hành
dựa theo quy trình khuyến cáo chạy máy do hãng máy cung cấp.
- Kết quả xét nghiệm
được tự động chuyển sang máy tính.
- Rửa máy hàng ngày sau
khi kết thúc quá trình xét nghiệm
- Rửa máy tuần vào 1
ngày cố định trong tuần.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Chạy mẫu QC:
+ Chạy mẫu QC trước
hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu QC
tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
+ Xem xét kết quả QC:
● Nếu kết quả QC không
đạt:
Sử dụng mẫu QC khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
● Nếu kết quả QC đạt:
Tiến hành đọc kết quả xét nghiệm và nhận định kết quả:
Dựa vào tiêu chuẩn đánh
giá xét nghiệm định lượng kháng thể kháng NMDA của nhà sản xuất để nhận định
kết quả:
Âm tính, dương tính, nghi ngờ.
Đối với mẫu nghi ngờ khuyến cáo
kiểm tra lại sau 1 tuần.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Chất lượng của mẫu
bệnh phẩm:
+ Huyết thanh vàng
+ Huyết thanh tan máu
+ Huyết thanh đục
Giải pháp: không sử
dụng mẫu bị tan máu để làm xét nghiệm; đối với mẫu máu vàng, đục bất thường do
bệnh lý cần pha loãng bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm.
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..)
Giải pháp: kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện sai quy
trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào giếng phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu
phân tích.
Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình, đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Castro c, gourley m.
Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. J allergy clin
immunol. 2010, 125(2 suppl 2):s238-47.
2. kumar y, bhatia a,
walker minz r. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis
of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn pathol. 2009 jan
2:4:1.
3. Bossuyt x, de langhe
e, borghi mo, meroni pl. Understanding and interpreting antinuclear antibody
tests in systemic rheumatic diseases. Nat rev rheumatol. 2020;16(12):715-726.
4. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
5. hovhannes
hayrapetyan, thao tran, eglis tellez-corrales, charitha madiraju. Enzyme-linked
immunosorbent assay: types and applications. Methods mol biol. 2023:2612:1-17.
9. GLUTAMATE RECEPTOR
(TYPE NMDA) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng Glutamate receptor (type NMDA) của người
bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các bệnh viêm não tự
miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được
thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/IgM) được đánh dấu FITC và
có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng Glutamate receptor (type NMDA) trong mẫu bệnh
phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao cho
xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao cho
chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao cho
chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét nghiệm
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch, tẩy
rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng rửa
tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng cụ
bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Hệ thống máy miễn dịch
huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng cụ
bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
-3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được lưu
và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu vực
làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị làm
xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không
vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được lấy
đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu đã
pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dụng dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào infected hoặc transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng đạt:
chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không
vỡ hồng cầu.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng, báo
cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu.
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên giấy
chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
+ Bình ngâm rửa slide
có hóa chất còn sót lại làm sai biệt trong hình ảnh nhuộm.
Giải pháp: Vệ sinh bình
sạch sẽ, làm khô sau khi thực hiện xét nghiệm
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật
- Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào vị trí phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự
mẫu phân tích.
giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình; đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°C).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và phiên
giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m, chan
ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
10. GLUTAMATE RECEPTOR
(TYPE AMPA1) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng Glutamate receptor (type AMPA1) của người
bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các bệnh viêm não tự
miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được
thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu FITC và
có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng Glutamate receptor (type AMPA1) trong mẫu
bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.4 Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao cho
xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao cho
chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao cho
chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.5 Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét nghiệm
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch, tẩy
rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng rửa
tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.2. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Hệ thống máy miễn
dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: Thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được lưu
và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu vực
làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng… được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị làm
xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không
vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu đã
pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dụng dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không
vỡ hồng cầu.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn đều
mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: Lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°c, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên giấy
chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất: Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ thống
máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
+ Bình ngâm rửa slide
có hóa chất còn sót lại làm sai biệt trong hình ảnh nhuộm.
Giải pháp: vệ sinh bình
sạch sẽ, làm khô sau khi thực hiện xét nghiệm
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật
- Nhầm lẫn trong nhỏ mẫu
vào vị trí phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự
mẫu phân tích.
Giải pháp:
+ Thực hiện lại quy
trình, đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu
trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi
nhỏ mẫu
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°C).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và phiên
giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
11. GLUTAMATE RECEPTOR
(TYPE AMPA2) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng Glutamate receptor (type AMPA2) của người
bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các bệnh viêm não tự
miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được
thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu FITC và
có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng Glutamate receptor (type AMPA2) trong mẫu
bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích gắn camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Hệ thống máy miễn
dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: Thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng… được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu đã
pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dụng dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: Chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu.
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa
cồn 70% vào các kênh
hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: Chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): Tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: Kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°c, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp: kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật.
- Sai sót do quá trình
cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần mềm
Giải pháp: Kiểm tra
thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí đặt mẫu,
thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: Làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°C).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m. Antinuclear
antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
12. GLUTAMATE RECEPTOR
(TYPE AMPA1/2) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng Glutamate receptor (type AMPA1/2) của người
bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, hỗ trợ chẩn đoán các bệnh viêm não tự
miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được
thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu FITC và
có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng Glutamate receptor (type AMPA1/2) trong mẫu
bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Hệ thống máy miễn
dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: Thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ khi
làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được lưu
và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu vực
làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị làm
xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được lấy
đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu đã
pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dụng dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng đạt:
Chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): Tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: Kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°c, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật.
- Sai sót do quá trình
cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần mềm
Giải pháp: Kiểm tra
thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí đặt mẫu,
thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: Làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°c).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
13. CONTACTIN-
ASSOCIATED PROTEIN 2 (CASPR2) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng Contactin-associated protein 2 (CASPR2) của
người bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các bệnh viêm não
tự miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được
thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu FITC và
có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Xét nghiệm phát hiện
kháng thể nhóm IgG đặc hiệu của người kháng Contactin - associated protein 2
(CASPR2) trong mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Hệ thống máy miễn dịch
huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
- Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch:
+ 01 ống không có chất
chống đông hoặc có chất chống đông EDTA, Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: Thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
-3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu
đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dụng dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích: 450-490
nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: Lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật.
- Sai sót do quá trình
cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần mềm
Giải pháp: Kiểm tra
thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí đặt mẫu,
thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: Làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°C).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic diseases.
Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
14. DIPEPTIDYL
AMINOPEPTIDASE - LIKE PROTEIN 6 (DPPX) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng Dipeptidyl aminopeptidase-like protein 6
(DPPX) của người bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các
bệnh viêm não tự miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được
thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu FITC và
có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng Dipeptidyl aminopeptidase- like protein 6
(DPPX) trong mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Hệ thống máy miễn
dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: Thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải bảo
quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu
đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dụng dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh quang
đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: Dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: Lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật.
- Sai sót do quá trình
cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần mềm
Giải pháp: Kiểm tra
thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí đặt mẫu,
thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: Làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°c).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
15. LEUCINE- RICH
GLIOMA- INACTIVATED PROTEIN 1 (LGI1) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng Leucine-rich glioma- inactivated protein 1
(LGI1) của người bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các
bệnh viêm não tự miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được
thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu FITC và
có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng Leucine-rich glioma- inactivated protein 1
(LGI1) trong mẫu bệnh phẩm
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Hệ thống máy miễn
dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu
đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dụng dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra lần
3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy (CSF)
đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não tự
miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao gồm
chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng không
đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: Lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật.
- Sai sót do quá trình
cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần mềm
Giải pháp: Kiểm tra
thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí đặt mẫu,
thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: Làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°C).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
16. GABAB RECEPTOR
(GABARB1/B2) VIÊM NÃO TỰ MIỄN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể kháng GABAB receptor (GABARB1/B2) của người bằng
phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các bệnh viêm não tự miễn.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
Sử dụng kỹ thuật huỳnh
quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới kính
hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất nền
đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra, các
kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng nguyên
đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát hiện sự
xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ hai được thực
hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu FITC và có
thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng GABAB receptor (GABARB1/B2) trong mẫu bệnh
phẩm.
2. Chuẩn bị
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Hệ thống máy miễn
dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
- 3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu
đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dung dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình
ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở
nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng
phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: Lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật.
- Sai sót do quá trình
cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần mềm
Giải pháp: Kiểm tra
thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí đặt mẫu,
thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến “rửa
trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: Làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°C).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
17. TỰ KHÁNG THỂ TRONG
BỆNH VIÊM NÃO BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ
thuật
Xét nghiệm được sử dụng
để phát hiện các tự kháng thể trong bệnh viêm não của người bằng phương pháp
miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán bệnh viêm não.
1.2. Định nghĩa, nguyên
lý
- Sử dụng kỹ thuật
huỳnh quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể dưới
kính hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với chất
nền đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy ra,
các kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng
nguyên đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát
hiện sự xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ
hai được thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh dấu
FITC và có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
- Phát hiện kháng thể
nhóm IgG đặc hiệu của người kháng lại các kháng nguyên thần kinh trong mẫu bệnh
phẩm
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật y
- Điều dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng cụ
- Pipet
- Hộp đựng đầu côn
- Ống đong thủy tinh
- Khay đựng dựng cụ
- Bình thủy tinh 1 lít
pha dung dịch rửa
- Bình đứng ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm ống nghiệm
- Nhiệt kế, ẩm kế
2.2.2. Hóa chất, thuốc
thử
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Hóa chất nội kiểm
- Hóa chất ngoại kiểm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho xét nghiệm
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm tiêu hao
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Bơm tiêm nhựa 5ml
- Kim tiêm nhựa
- Ống đựng máu
- Ống nghiệm 14x105
- Pipettor thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn kết để đậy
kính
- Đầu côn vàng
- Đầu côn xanh
- Găng lấy mẫu
- Găng tay làm xét
nghiệm
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Bông, gạc sát khuẩn,
băng cá nhân
- Khăn giấy lau tay
- Túi nilon đựng rác
- Quần áo nhân viên
- Dung dịch làm sạch,
tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch sát khuẩn
tay
- Cồn sát khuẩn 70 độ
- Dung dịch xà phòng
rửa tay trung tính
- Vật tư thay thế hệ
thống điện
2.3. Trang thiết bị
2.3.1. Máy bán tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.3.2. Máy tự động
- Hệ thống máy miễn
dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển vi huỳnh
quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn bị slide tự
động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc barcode
- Máy in barcode
- Máy hút ẩm
- Tủ lạnh lưu mẫu
- Tủ lạnh đựng hóa chất
- Tủ sấy khô
- Tủ ấm 37ºC
- Máy ly tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu điện
- Thùng đựng rác tái
chế
- Thùng đựng rác lây
nhiễm
- Thùng đựng rác sinh
hoạt
- Thùng nhựa ngâm dụng
cụ bẩn….
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh
phẩm
+ Loại bệnh phẩm: Máu
tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Ống máu: Thể tích
3-5ml
+ Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
+ Trên ống có ghi đầy
đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh nhân.
2.5. Phiếu chỉ định xét
nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm ...
2.6. Thời gian thực
hiện kỹ thuật: 2
-3 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện
kỹ thuật: Phòng
xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang phục bảo hộ
khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ, vật tư tiêu
hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải y tế theo
quy định;
- Mẫu bệnh phẩm được
lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự cố tràn đổ
theo quy định;
- Vệ sinh sạch sẽ khu
vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều kiện môi
trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi, giám sát và
đảm bảo theo quy định;
- Các trang thiết bị
làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Máy bán tự động
4.1.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến hành kỹ
thuật
- Bước 1: Ủ 30 µl mẫu
đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng mỗi mẫu đều
liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và những mẫu riêng
lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C).
- Bước 2: Xả rửa nhanh
các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm ngập các slide
với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ lần 2 các
slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang: sau
khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh của slide
bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích loại bỏ phần
lớn các dung dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực hiện quá trình ủ
với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong vòng 30 phút ở nhiệt
độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác giữa các vùng phản ứng
và hóa chất.
- Lưu ý: Quá trình thực
hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô - thực
hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền gắn.
Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi dùng.
Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4. Bổ sung đầy
dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó tiếp tục
ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5: Chuẩn bị đọc
mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các slide lên
kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6: Đọc bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các mẫu thông
thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x (cơ
chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.2. Máy tự động
4.2.1. Chuẩn bị bệnh
phẩm
a. Lấy bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch não tủy
(CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh viêm não
tự miễn
- Mẫu máu: Lấy 3ml máu
tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi lấy máu, đem
li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết thanh.
- Mẫu bệnh phẩm phải
bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên được thực
hiện trong ngày.
- Pha loãng bệnh phẩm
(nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú ý: trộn
đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được
lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông tin trên
mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2. Chuẩn bị dụng
cụ, hóa chất
- Tất cả các hóa chất
của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút
trước khi thực hiện thao tác
- Các slide đã được phủ
mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Các loại chứng bao
gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể kháng IgG
người được gắn FITC
- Kít hóa chất (đệm pha
loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết gắn để phủ
kính đậy
- Chuẩn bị dung dịch
rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng
1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm bẩn.
- Pha loãng mẫu bệnh
phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến hành kỹ
thuật
Thao tác trên máy xét
nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1: Bật máy, kiểm
tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được bổ sung đầy
trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn 70% vào các
kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2: Xây dựng bảng
thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào vị trí tương
ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp tương ứng
cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực hiện cho
từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3: Chọn các vị
trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí tương ứng
trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực hiện.
- Bước 4: Chọn quét ID
của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương pháp xét
nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ thông tin
tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước khi tiến
hành chạy.
- Bước 5: Chọn start để
máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý: Sau khi kết
thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét nghiệm theo
hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy cơ lây
nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá kết quả bằng
kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết quả)
- Bước 6: Đọc các mẫu
thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected), 40x
(cơ chất tế bào)
- Bộ lọc kích thích:
450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận định kết
quả
- Xem xét kết quả chạy
chứng:
+ Chạy chứng dương,
chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình chạy mẫu
chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét kết quả
chứng:
+ Nếu kết quả chứng
không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để kiểm tra
lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không đạt yêu
cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để kiểm tra
lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3 lần đều
không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử dụng,
báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện pháp giải
quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
+ Nếu kết quả chứng
đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu trong khi
chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả xét
nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình ảnh cho
tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên bề mặt
của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả không
cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc hiệu
4.3. Trả kết quả và lưu
trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực
hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh phẩm: Máu
không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp: lấy lại mẫu
máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°c, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh nhân trên
giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp: Xác minh lại
thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm
- Thuốc thử, hóa chất
không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..):
Giải pháp: Kiểm tra
thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang thiết bị:
+ Hoạt động của hệ
thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp: Thực hiện
bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn sáng, bộ lọc và
đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp.
Giải pháp: Sử dụng hệ
thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ phụ thuộc
vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt động quá
thời gian cho phép.
5.2. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật
Thực hiện sai quy trình
kỹ thuật.
- Sai sót do quá trình
cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần mềm
Giải pháp: Kiểm tra
thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí đặt mẫu,
thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai các slide
trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ dẫn đến
“rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp: Làm lại xét
nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét
nghiệm (25°C).
5.3. Sau khi thực hiện
kỹ thuật
- Đọc, nhận định và
phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp: Đào tạo lại
và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai kết quả xét
nghiệm.
Giải pháp: Quản lý bệnh
nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ
VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tebo ae. Recent
approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies. Clin
vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2. Vercammen m, bonroy
c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l, coucke w, de melo
cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj, schouwers s, van
hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity testing. Analytical
aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect immunofluorescence:
eflm report on an international survey. Clin chem lab med. 2023 mar
30;61(7):1199-1208.
3. Olsen nj, choi my,
fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler m, fritzler
mj. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence
pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin
dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m, murali m.
Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6. Damoiseaux j,
andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler mj, garcia de
la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen c, satoh m,
chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent patterns: the
international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann rheum dis. 2019
jul;78(7):879-889.
18. ĐA TỰ KHÁNG THỂ
TRONG BỆNH VIÊM NÃO BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG (2 LOẠI)
1. ĐẠI
CƯƠNG
1.1. Mục
đích của kỹ thuật
Xét nghiệm
được sử dụng để phát hiện các đa tự kháng thể (AQP4a và MOG) của người bằng
phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán các bệnh viêm não.
1.2. Định
nghĩa, nguyên lý
Sử dụng kỹ
thuật huỳnh quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể
dưới kính hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với
chất nền đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy
ra, các kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng
nguyên đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát
hiện sự xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ
hai được thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh
dấu FITC và có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện
kháng thể nhóm IgG đặc hiệu của người kháng lại các kháng nguyên thần kinh (2
loại: AQP4a và MOG) trong mẫu bệnh phẩm
2. Chuẩn bị
2.1. Người
thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật
y
- Điều
dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng
cụ
- Pipet
- Hộp đựng
đầu côn
- Ống đong
thủy tinh
- Khay đựng
dựng cụ
- Bình thủy
tinh 1 lít pha dung dịch rửa
- Bình đứng
ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa
chất
- Giá cắm
ống nghiệm
- Nhiệt kế,
ẩm kế
2.2.2. Hóa
chất, thuốc thử
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Hóa chất
nội kiểm
- Hóa chất
ngoại kiểm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho xét nghiệm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất
2 lần
2.2.3. Vật
tư tiêu hao
- Bơm tiêm
nhựa 5ml
- Kim tiêm
nhựa
- Ống đựng
máu
- Ống
nghiệm 14x105
- Pipettor
thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn
kết để đậy kính
- Đầu côn
vàng
- Đầu côn
xanh
- Găng lấy
mẫu
- Găng tay
làm xét nghiệm
- Găng tay
xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu
trang
- Bông, gạc
sát khuẩn, băng cá nhân
- Khăn giấy
lau tay
- Túi nilon
đựng rác
- Quần áo
nhân viên
- Dung dịch
làm sạch, tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch
sát khuẩn tay
- Cồn sát
khuẩn 70 độ
- Dung dịch
xà phòng rửa tay trung tính
- Vật tư
thay thế hệ thống điện
2.3. Trang
thiết bị
2.3.1. Máy
bán tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.3.2. Máy
tự động
- Hệ thống
máy miễn dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn
bị slide tự động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.4. Chuẩn
bị mẫu bệnh phẩm
+ Loại bệnh
phẩm: Máu tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông
EDTA, Heparin.
+ Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu
chuẩn mẫu bệnh phẩm:
+ Ống máu:
Thể tích 3-5ml
+ Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
+ Trên ống
có ghi đầy đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh
nhân.
2.5. Phiếu
chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra
phiếu chỉ định xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người
bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời
gian lấy mẫu bệnh phẩm ...
2.6. Thời
gian thực hiện kỹ thuật: 2 - 3 giờ
2.7. Địa điểm
thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang
phục bảo hộ khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ,
vật tư tiêu hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải
y tế theo quy định;
- Mẫu bệnh
phẩm được lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự
cố tràn đổ theo quy định;
- Vệ sinh
sạch sẽ khu vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều
kiện môi trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi,
giám sát và đảm bảo theo quy định;
- Các trang
thiết bị làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản
xuất.
4. CÁC BƯỚC
TIẾN HÀNH
4.1. Máy
bán tự động
4.1.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không
bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện
nhiễm bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1: Ủ
30 µl mẫu đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng
mỗi mẫu đều liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và
những mẫu riêng lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến
+25°C).
- Bước 2:
Xả rửa nhanh các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm
ngập các slide với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ
lần 2 các slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh
quang: sau khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh
của slide bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục
đích loại bỏ phần lớn các dung dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức
thực hiện quá trình ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang
trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính
xác giữa các vùng phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý:
Quá trình thực hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị
khô - thực hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất
nền gắn. Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước
khi dùng. Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4.
Bổ sung đầy dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó
tiếp tục ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5:
Chuẩn bị đọc mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các
slide lên kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6:
Đọc bằng kính hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các
mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected),
40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy chứng
dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang
sử dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu. Ph
Phản ứng âm tính: kết quả
không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc
hiệu
4.2. Máy tự
động
4.2.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu
không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện
nhiễm bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến
hành kỹ thuật
Thao tác
trên máy xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1:
Bật máy, kiểm tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được
bổ sung đầy trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn
70% vào các kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2:
Xây dựng bảng thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào
vị trí tương ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp
tương ứng cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực
hiện cho từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3:
Chọn các vị trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí
tương ứng trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực
hiện.
- Bước 4:
Chọn quét ID của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương
pháp xét nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ
thông tin tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước
khi tiến hành chạy.
- Bước 5:
Chọn start để máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý:
Sau khi kết thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét
nghiệm theo hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy
cơ lây nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá
kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết
quả)
- Bước 6:
Đọc các mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected),
40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy
chứng dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh
nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang
sử dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả
không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc
hiệu
4.3. Trả
kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả
theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ
sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG
SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước
khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh
phẩm: máu không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp:
Lấy lại mẫu máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°c, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh
nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp:
Xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh
phẩm
- Thuốc
thử, hóa chất không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp:
Kiểm tra thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang
thiết bị:
+ Hoạt động
của hệ thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp:
Thực hiện bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn
sáng, bộ lọc và đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng
đến độ nhạy của phương pháp.
Giải pháp:
Sử dụng hệ thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ
phụ thuộc vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt
động quá thời gian cho phép.
5.2. Trong
quá trình thực hiện kỹ thuật
Thực hiện
sai quy trình kỹ thuật.
- Sai sót
do quá trình cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần
mềm
Giải pháp:
Kiểm tra thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí
đặt mẫu, thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai
các slide trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ
dẫn đến “rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp:
Làm lại xét nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ
phòng xét nghiệm (25°C).
5.3. Sau
khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận
định và phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai
kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Quản lý bệnh nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU
CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu
thực hiện nội kiểm chất lượng.
- Yêu cầu
thực hiện ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1. Tebo ae.
Recent approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies.
Clin vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2.
Vercammen m, bonroy c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l,
coucke w, de melo cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj,
schouwers s, van hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity
testing. Analytical aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect
immunofluorescence: eflm report on an international survey. Clin chem lab med.
2023 mar 30;61(7):1199-1208.
3. Olsen
nj, choi my, fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for
rheumatic diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler
m, fritzler mj. The clinical significance of the dense fine speckled
immunofluorescence pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic
autoimmune diseases. Clin dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m,
murali m. Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6.
Damoiseaux j, andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler
mj, garcia de la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen
c, satoh m, chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent
patterns: the international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann
rheum dis. 2019 jul;78(7):879-889.
19. ĐA TỰ
KHÁNG THỂ TRONG BỆNH VIÊM NÃO BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG (6 LOẠI)
1. ĐẠI
CƯƠNG
1.1. Mục
đích của kỹ thuật
Xét nghiệm
được sử dụng để phát hiện các đa tự kháng thể (Glutamate receptor (type nmda),
Contactin- associated protein 2, Glutamate receptor (type AMPA1/2),
Leucine-rich glioma-inactivated protein 1, Dipeptidyl aminopeptidase- like
protein 6(DPPX), GABAB receptor) của người bằng phương pháp miễn dịch huỳnh
quang hỗ trợ chẩn đoán bệnh viêm não.
1.2. Định
nghĩa, nguyên lý
Sử dụng kỹ
thuật huỳnh quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể
dưới kính hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với
chất nền đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy
ra, các kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng
nguyên đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát
hiện sự xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ
hai được thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh
dấu FITC và có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện
kháng thể nhóm IgG đặc hiệu của người kháng kháng lại các kháng nguyên thần kinh
(6 loại: Glutamate receptor (type NMDA), Contactin- associated protein 2,
Glutamate receptor(type AMPA1/2), Leucine-rich glioma-inactivated protein 1,
Dipeptidyl aminopeptidase- like protein 6 (DPPX), GABAB receptor) trong mẫu
bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người
thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật
y
- Điều
dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng
cụ
- Pipet
- Hộp đựng
đầu côn
- Ống đong
thủy tinh
- Khay đựng
dựng cụ
- Bình thủy
tinh 1 lít pha dung dịch rửa
- Bình đứng
ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa
chất
- Giá cắm
ống nghiệm
- Nhiệt kế,
ẩm kế
2.2.2. Hóa
chất, thuốc thử
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Hóa chất
nội kiểm
- Hóa chất
ngoại kiểm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho xét nghiệm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất
2 lần
2.2.3. Vật
tư tiêu hao
- Bơm tiêm
nhựa 5ml
- Kim tiêm
nhựa
- Ống đựng
máu
- Ống
nghiệm 14x105
- Pipettor
thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn
kết để đậy kính
- Đầu côn
vàng
- Đầu côn
xanh
- Găng lấy
mẫu
- Găng tay
làm xét nghiệm
- Găng tay
xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu
trang
- Bông, gạc
sát khuẩn, băng cá nhân
- Khăn giấy
lau tay
- Túi nilon
đựng rác
- Quần áo
nhân viên
- Dung dịch
làm sạch, tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch
sát khuẩn tay
- Cồn sát
khuẩn 70 độ
- Dung dịch
xà phòng rửa tay trung tính
- Vật tư
thay thế hệ thống điện
2.3. Trang
thiết bị
2.3.1. Máy
bán tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.3.2. Máy
tự động
- Hệ thống
máy miễn dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn
bị slide tự động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.4. Chuẩn
bị mẫu bệnh phẩm
+ Loại bệnh
phẩm: Máu tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông EDTA,
Heparin.
+ Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu
chuẩn mẫu bệnh phẩm:
+ Ống máu:
Thể tích 3-5ml
+ Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
+ Trên ống
có ghi đầy đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh
nhân.
2.5. Phiếu
chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra
phiếu chỉ định xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người
bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời
gian lấy mẫu bệnh phẩm ...
2.6. Thời
gian thực hiện kỹ thuật: 2 - 3 giờ
2.7. Địa điểm
thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang
phục bảo hộ khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ,
vật tư tiêu hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải
y tế theo quy định;
- Mẫu bệnh
phẩm được lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự
cố tràn đổ theo quy định;
- Vệ sinh
sạch sẽ khu vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều
kiện môi trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi,
giám sát và đảm bảo theo quy định;
- Các trang
thiết bị làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản
xuất.
4. CÁC BƯỚC
TIẾN HÀNH
4.1. Máy
bán tự động
4.1.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu
không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện nhiễm
bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1: Ủ
30 µl mẫu đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng
mỗi mẫu đều liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và
những mẫu riêng lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến
+25°C).
- Bước 2:
Xả rửa nhanh các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm
ngập các slide với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ
lần 2 các slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh
quang: sau khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh
của slide bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục
đích loại bỏ phần lớn các dung dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức
thực hiện quá trình ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang
trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính
xác giữa các vùng phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý: Quá
trình thực hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị khô
- thực hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất nền
gắn. Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước khi
dùng. Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4.
Bổ sung đầy dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó
tiếp tục ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5:
Chuẩn bị đọc mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các
slide lên kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6:
Đọc bằng kính hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các
mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected),
40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy
chứng dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh
nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang
sử dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết
quả không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không
đặc hiệu
4.2. Máy tự
động
4.2.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu
không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện
nhiễm bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến
hành kỹ thuật
Thao tác
trên máy xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1:
Bật máy, kiểm tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được
bổ sung đầy trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn
70% vào các kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2:
Xây dựng bảng thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào
vị trí tương ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp
tương ứng cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực
hiện cho từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3:
Chọn các vị trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí
tương ứng trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực
hiện.
- Bước 4:
Chọn quét ID của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương
pháp xét nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ
thông tin tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước
khi tiến hành chạy.
- Bước 5:
Chọn start để máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý:
Sau khi kết thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét
nghiệm theo hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy
cơ lây nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá
kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết
quả)
- Bước 6:
Đọc các mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc
Transfected), 40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy
chứng dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh
nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang
sử dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả
không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc
hiệu
4.3. Trả
kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả
theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ
sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG
SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước
khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh
phẩm: Máu không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp:
Lấy lại mẫu máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh
nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp:
Xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh
phẩm
- Thuốc
thử, hóa chất không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp:
Kiểm tra thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang
thiết bị:
+ Hoạt động
của hệ thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp:
Thực hiện bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn
sáng, bộ lọc và đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng
đến độ nhạy của phương pháp.
Giải pháp:
Sử dụng hệ thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ
phụ thuộc vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt
động quá thời gian cho phép.
5.2. Trong
quá trình thực hiện kỹ thuật
Thực hiện
sai quy trình kỹ thuật.
- Sai sót
do quá trình cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần
mềm
Giải pháp:
kiểm tra thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí
đặt mẫu, thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai
các slide trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ
dẫn đến “rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp:
làm lại xét nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ
phòng xét nghiệm (25°C).
5.3. Sau
khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận
định và phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai
kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Quản lý bệnh nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU
CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu
thực hiện nội kiểm chất lượng.
- Yêu cầu
thực hiện ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1. Tebo ae.
Recent approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies.
Clin vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2.
Vercammen m, bonroy c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l,
coucke w, de melo cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj,
schouwers s, van hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity
testing. Analytical aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect
immunofluorescence: eflm report on an international survey. Clin chem lab med.
2023 mar 30;61(7):1199-1208.
3. Olsen
nj, choi my, fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for
rheumatic diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler
m, fritzler mj. The clinical significance of the dense fine speckled
immunofluorescence pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic
autoimmune diseases. Clin dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m,
murali m. Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6.
Damoiseaux j, andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler
mj, garcia de la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen
c, satoh m, chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent
patterns: the international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann
rheum dis. 2019 jul;78(7):879-889.
20. ĐA TỰ
KHÁNG THỂ TRONG BỆNH VIÊM MÀNG THẬN NGUYÊN PHÁT BẰNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG (2
LOẠI)
1. ĐẠI
CƯƠNG
1.1. Mục
đích của kỹ thuật
Xét nghiệm
được sử dụng để phát hiện các đa tự kháng thể ( PLA2R và THSD7A) của người bằng
phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn đoán bệnh viêm màng thận nguyên
phát.
1.2. Định
nghĩa, nguyên lý
Sử dụng kỹ
thuật huỳnh quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể
dưới kính hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với
chất nền đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy
ra, các kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng
nguyên đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát
hiện sự xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ
hai được thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh
dấu FITC và có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Xét nghiệm
phát hiện các tự kháng thể nhóm IgG đặc hiệu của người liên quan đến bệnh viêm
màng thận nguyên phát (2 loại: PLA2R VÀ THSD7A) trong mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người
thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật
y
- Điều
dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng
cụ
- Pipet
- Hộp đựng
đầu côn
- Ống đong
thủy tinh
- Khay đựng
dựng cụ
- Bình thủy
tinh 1 lít pha dung dịch rửa
- Bình đứng
ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa
chất
- Giá cắm
ống nghiệm
- Nhiệt kế,
ẩm kế
2.2.2. Hóa
chất, thuốc thử
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Hóa chất
nội kiểm
- Hóa chất
ngoại kiểm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho xét nghiệm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất
2 lần
2.2.3. Vật
tư tiêu hao
- Bơm tiêm
nhựa 5ml
- Kim tiêm
nhựa
- Ống đựng
máu
- Ống
nghiệm 14x105
- Pipettor
thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn
kết để đậy kính
- Đầu côn
vàng
- Đầu côn
xanh
- Găng lấy
mẫu
- Găng tay
làm xét nghiệm
- Găng tay
xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu
trang
- Bông, gạc
sát khuẩn, băng cá nhân
- Khăn giấy
lau tay
- Túi nilon
đựng rác
- Quần áo
nhân viên
- Dung dịch
làm sạch, tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch
sát khuẩn tay
- Cồn sát
khuẩn 70 độ
- Dung dịch
xà phòng rửa tay trung tính
- Vật tư
thay thế hệ thống điện
2.3. Trang
thiết bị
2.3.1. Máy
bán tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.3.2. Máy
tự động
- Hệ thống
máy miễn dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn
bị slide tự động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.4. Chuẩn
bị mẫu bệnh phẩm
+ Loại bệnh
phẩm: Máu tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông
EDTA, Heparin.
+ Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu
chuẩn mẫu bệnh phẩm:
+ Ống máu:
Thể tích 3-5ml
+ Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
+ Trên ống
có ghi đầy đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh
nhân.
2.5. Phiếu
chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra
phiếu chỉ định xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người
bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời
gian lấy mẫu bệnh phẩm ...
2.6. Thời
gian thực hiện kỹ thuật: 2 - 3 giờ
2.7. Địa điểm
thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang
phục bảo hộ khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ,
vật tư tiêu hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải
y tế theo quy định;
- Mẫu bệnh
phẩm được lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự
cố tràn đổ theo quy định;
- Vệ sinh
sạch sẽ khu vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều
kiện môi trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi,
giám sát và đảm bảo theo quy định;
- Các trang
thiết bị làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản
xuất.
4. Các bước
tiến hành
4.1. Máy
bán tự động
4.1.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu
không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện
nhiễm bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1: Ủ
30 µl mẫu đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng
mỗi mẫu đều liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và
những mẫu riêng lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến
+25°C).
- Bước 2:
Xả rửa nhanh các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm
ngập các slide với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ
lần 2 các slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh
quang: sau khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh
của slide bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích
loại bỏ phần lớn các dung dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực
hiện quá trình ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong
vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác
giữa các vùng phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý:
Quá trình thực hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị
khô - thực hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất
nền gắn. Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước
khi dùng. Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4.
Bổ sung đầy dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó
tiếp tục ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5:
Chuẩn bị đọc mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các
slide lên kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6:
Đọc bằng kính hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các
mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected),
40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy
chứng dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh
nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang
sử dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả
không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc
hiệu
4.2. Máy tự
động
4.2.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu
không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết
thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện
nhiễm bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến
hành kỹ thuật
Thao tác
trên máy xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1:
Bật máy, kiểm tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được
bổ sung đầy trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn
70% vào các kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2:
Xây dựng bảng thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào
vị trí tương ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp
tương ứng cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực
hiện cho từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3:
Chọn các vị trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí
tương ứng trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực
hiện.
- Bước 4:
Chọn quét ID của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương
pháp xét nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ
thông tin tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước
khi tiến hành chạy.
- Bước 5:
Chọn start để máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý:
Sau khi kết thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét
nghiệm theo hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy
cơ lây nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá
kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết
quả)
- Bước 6:
đọc các mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc
Transfected), 40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy
chứng dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh
nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang sử
dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả
không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc
hiệu
4.3. Trả
kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả
theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ
sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG
SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước
khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh
phẩm: Máu không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp:
lấy lại mẫu máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh
nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp:
Xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh
phẩm
- Thuốc
thử, hóa chất không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi...):
Giải pháp:
Kiểm tra thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang
thiết bị:
+ Hoạt động
của hệ thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp:
Thực hiện bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn
sáng, bộ lọc và đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng
đến độ nhạy của phương pháp.
Giải pháp:
Sử dụng hệ thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ
phụ thuộc vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt
động quá thời gian cho phép.
5.2. Trong
quá trình thực hiện kỹ thuật
Thực hiện
sai quy trình kỹ thuật.
- Sai sót
do quá trình cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần
mềm
Giải pháp:
kiểm tra thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí
đặt mẫu, thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai
các slide trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ
dẫn đến “rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp:
làm lại xét nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ
phòng xét nghiệm (25°C).
5.3. Sau
khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận
định và phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai
kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Quản lý bệnh nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU
CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu
thực hiện nội kiểm chất lượng.
- Yêu cầu
thực hiện ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1. Tebo ae.
Recent approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies.
Clin vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2.
Vercammen m, bonroy c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l,
coucke w, de melo cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj,
schouwers s, van hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity
testing. Analytical aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect
immunofluorescence: eflm report on an international survey. Clin chem lab med.
2023 mar 30;61(7):1199-1208.
3. Olsen
nj, choi my, fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler
m, fritzler mj. The clinical significance of the dense fine speckled
immunofluorescence pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic
autoimmune diseases. Clin dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m,
murali m. Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6.
Damoiseaux j, andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler
mj, garcia de la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen
c, satoh m, chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent
patterns: the international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann
rheum dis. 2019 jul;78(7):879-889.
21. TỰ
KHÁNG THỂ: GBM (KHÁNG THỂ TRONG HỘI CHỨNG GOODPASTURE’S) BẰNG MIỄN DỊCH HUỲNH
QUANG
1. ĐẠI
CƯƠNG
1.1. Mục
đích của kỹ thuật
Xét nghiệm
được sử dụng để phát hiện tự kháng thể GBM (kháng thể trong hội chứng
Goodpasture's) của người bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hỗ trợ chẩn
đoán hội chứng Goodpasture.
1.2. Định
nghĩa, nguyên lý
Sử dụng kỹ
thuật huỳnh quang gián tiếp (IIFT) phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể
dưới kính hiển vi huỳnh quang. Trong đó, mẫu bệnh phẩm đã pha loãng được ủ với
chất nền đặc hiệu biểu hiện các kháng nguyên đích. Nếu phản ứng dương tính xảy
ra, các kháng thể đặc hiệu IgA, IgG và IgM trong mẫu bệnh phẩm kháng các kháng
nguyên đích cần phát hiện sẽ gắn vào các kháng nguyên của chất nền. Để phát
hiện sự xuất hiện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể, quá trình ủ lần thứ
hai được thực hiện với kháng thể đặc hiệu Anti-IgG (hoặc IgA/ IgM) được đánh
dấu FITC và có thể được phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Phát hiện
các tự kháng thể nhóm IgG đặc hiệu của người kháng GBM (kháng thể trong hội
chứng Goodpasture's) trong mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người
thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật
y
- Điều
dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng
cụ
- Pipet
- Hộp đựng
đầu côn
- Ống đong
thủy tinh
- Khay đựng
dựng cụ
- Bình thủy
tinh 1 lít pha dung dịch rửa
- Bình đứng
ngâm lam
- Cốc đong
- Khay hóa chất
- Giá cắm
ống nghiệm
- Nhiệt kế,
ẩm kế
2.2.2. Hóa
chất, thuốc thử
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Hóa chất
nội kiểm
- Hóa chất
ngoại kiểm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho xét nghiệm
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chuẩn
- Sinh phẩm
tiêu hao cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Nước cất
2 lần
2.2.3. Vật
tư tiêu hao
- Bơm tiêm
nhựa 5ml
- Kim tiêm
nhựa
- Ống đựng
máu
- Ống
nghiệm 14x105
- Pipettor
thủy tinh
- Slide
- Lame kính
- Chất gắn
kết để đậy kính
- Đầu côn
vàng
- Đầu côn
xanh
- Găng lấy
mẫu
- Găng tay
làm xét nghiệm
- Găng tay
xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu
trang
- Bông, gạc
sát khuẩn, băng cá nhân
- Khăn giấy
lau tay
- Túi nilon
đựng rác
- Quần áo
nhân viên
- Dung dịch
làm sạch, tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch
sát khuẩn tay
- Cồn sát
khuẩn 70 độ
- Dung dịch
xà phòng rửa tay trung tính
- Vật tư
thay thế hệ thống điện
2.3. Trang
thiết bị
2.3.1. Máy
bán tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang kèm camera
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.3.2. Máy
tự động
- Hệ thống
máy miễn dịch huỳnh quang tự động
- Kính hiển
vi huỳnh quang tích hợp phần mềm đọc kết quả
- Máy chuẩn
bị slide tự động
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Tủ hồ sơ
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.4. Chuẩn
bị mẫu bệnh phẩm
+ Loại bệnh
phẩm: Máu tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông
EDTA, Heparin.
+ Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
- Tiêu
chuẩn mẫu bệnh phẩm:
+ Ống máu:
thể tích 3-5ml
+ Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
+ Trên ống
có ghi đầy đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh
nhân.
2.5. Phiếu
chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra
phiếu chỉ định xét nghiệm: Có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người
bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời
gian lấy mẫu bệnh phẩm ...
2.6. Thời
gian thực hiện kỹ thuật: 2 -3 giờ
2.7. Địa điểm
thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang
phục bảo hộ khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ,
vật tư tiêu hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải
y tế theo quy định;
- Mẫu bệnh
phẩm được lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự
cố tràn đổ theo quy định;
- Vệ sinh
sạch sẽ khu vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều
kiện môi trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi,
giám sát và đảm bảo theo quy định;
- Các trang
thiết bị làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản
xuất.
4. CÁC BƯỚC
TIẾN HÀNH
4.1. Máy
bán tự động
4.1.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu
không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện
nhiễm bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.1.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1: Ủ
30 µl mẫu đã pha loãng với các slide có gắn chất nền tương ứng. Đảm bảo rằng
mỗi mẫu đều liên kết với miền phản ứng có chứa chất nền đặc hiệu của nó và
những mẫu riêng lẻ không lẫn vào nhau. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến
+25°C).
- Bước 2:
Xả rửa nhanh các slide với đệm rửa. Sử dụng bình ngâm lam dạng đứng để ngâm
ngập các slide với đệm rửa ít nhất 5 phút
- Bước 3: Ủ
lần 2 các slide phản ứng với 25 µl kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh
quang: sau khi lấy các slide ra khỏi bình ngâm lam, lau khô phần lưng và cạnh
của slide bằng khăn giấy, đập mạnh các cạnh của slide vào khăn giấy với mục đích
loại bỏ phần lớn các dung dịch đệm của quá trình ngâm rửa. Ngay lập tức thực
hiện quá trình ủ với kháng thể Anti-IgG đặc hiệu gắn nhãn huỳnh quang trong
vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C). Kiểm tra tương tác chính xác
giữa các vùng phản ứng và hóa chất.
- Lưu ý:
Quá trình thực hiện phải nhanh chóng tránh để bề mặt gắn chất nền trên slide bị
khô - thực hiện trong vòng 5s. Không chạm vào khu vực phản ứng chưa các chất
nền gắn. Kháng thể Anti-IgG người gắn nhãn huỳnh quang nên được trộn đều trước
khi dùng. Quá trình ủ cần tránh ánh sáng trực tiếp.
- Bước 4.
Bổ sung đầy dung dịch rửa vào bình ngâm lam. Xối rửa slide bằng đệm rửa sau đó
tiếp tục ngâm slide vào đệm rửa trong bình ngâm lam ít nhất 5 phút.
- Bước 5:
Chuẩn bị đọc mẫu: nhỏ khoảng 10µl dung dịch kết dính lên kính phủ, úp ngược các
slide lên kính phủ để chuẩn bị đọc kết quả.
- Bước 6:
Đọc bằng kính hiển vi huỳnh quang.
- Đọc các
mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc Transfected),
40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.1.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy
chứng dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh
nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang
sử dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả
không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc
hiệu
4.2. Máy tự
động
4.2.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, Heparin hoặc Citrat. Dịch
não tủy (CSF) đối với một số các xét nghiệm phát hiện tự kháng thể trong bệnh
viêm não tự miễn
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu tiêu chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu
không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách huyết
thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các slide
đã được phủ mô/ tế bào có biểu hiện kháng nguyên đích và được bảo bản trong một
túi thiếc với gói chất chống ẩm
- Các loại
chứng bao gồm chứng âm, chứng dương
- Kháng thể
kháng IgG người được gắn FITC
- Kít hóa
chất (đệm pha loãng mẫu, hóa chất pha dung dịch rửa)
- Chất kết
gắn để phủ kính đậy
- Chuẩn bị
dung dịch rửa: dung dịch rửa sau khi được chuẩn bị cần được bảo quản ở 2 - 8°C
trong vòng 1 tuần. Lưu ý không sử dụng dung dịch rửa đã bị đục hoặc xuất hiện
nhiễm bẩn.
- Pha loãng
mẫu bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của bộ xét nghiệm.
4.2.3. Tiến
hành kỹ thuật
Thao tác
trên máy xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang
- Bước 1:
Bật máy, kiểm tra bình thải trống và bình chứa dung dịch rửa hệ thống phải được
bổ sung đầy trước khi tiến hành chạy máy. Đặt lọ chứa đệm rửa và lọ chứa cồn
70% vào các kênh hút tương ứng trên máy
- Bước 2:
Xây dựng bảng thông tin chạy mẫu “worklist” trên máy: (1) đặt các ống mẫu vào
vị trí tương ứng trên máy; (2) tiến hành quét barcode mẫu; (3) chọn phương pháp
tương ứng cho loại xét nghiệm muốn thực hiện; (4) chọn độ pha loãng muốn thực
hiện cho từng mẫu; (5) chọn lưu bảng thông tin mẫu “worklist” vừa thiết lập.
- Bước 3:
Chọn các vị trí sẽ đặt slide trên phần mềm máy tính, đặt các slide vào vị trí
tương ứng trên máy. Số lượng slide phải phù hợp với số lượng mẫu định thực
hiện.
- Bước 4:
Chọn quét ID của từng slide tương ứng. ID slide sẽ cung cấp thông tin về phương
pháp xét nghiệm được sử dụng tương ứng với chất nền trên slide. Kiểm tra kỹ
thông tin tương thích với “worklist” đã tạo và vị trí mẫu được hiện thị trước
khi tiến hành chạy.
- Bước 5:
Chọn start để máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý:
Sau khi kết thúc xét nghiệm cần tiến hành quy trình vệ sinh tự động của máy xét
nghiệm theo hướng dẫn sử dụng của máy để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân có nguy
cơ lây nhiễm và tránh nhiễm chéo kết quả cho lần chạy tiếp theo.
- Đánh giá
kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang (đã tích hợp với phần mềm phân tích kết
quả)
- Bước 6:
Đọc các mẫu thông thường: vật kính 20x (đối với mô, tế bào Infected hoặc
Transfected), 40x (cơ chất tế bào)
- Bộ lọc
kích thích: 450-490 nm, bộ tách màu: 510 nm, bộ lọc chặn: 515 nm.
4.2.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Chạy
chứng dương, chứng âm trước hoặc song song cùng với mẫu xét nghiệm của bệnh
nhân
+ Quy trình
chạy mẫu chứng tương tự như quy trình chạy mẫu xét nghiệm.
- Xem xét
kết quả chứng:
+ Nếu kết
quả chứng không đạt:
Sử dụng mẫu chứng khác để
kiểm tra lần 2.
Nếu kiểm tra lần 2 không
đạt yêu cầu thì sử dụng thuốc thử khác của cùng lô sinh phẩm đang sử dụng để
kiểm tra lần 3.
Nếu kết quả kiểm tra cả 3
lần đều không đạt yêu cầu thì tạm dừng việc xét nghiệm bằng lô sinh phẩm đang
sử dụng, báo cáo lãnh đạo phòng xét nghiệm để tìm hiểu nguyên nhân và tìm biện
pháp giải quyết. Chỉ tiếp tục thực hiện xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc
khắc phục.
+ Nếu kết
quả chứng đạt: chất chứng dương cho tín hiệu huỳnh quang sáng rõ ràng, đặc hiệu
trong khi chứng âm phải cho tín hiệu huỳnh quang âm tính, tiến hành đọc kết quả
xét nghiệm và nhận định kết quả. Kết quả được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh
quang đã được tích hợp với phần mềm đọc kết quả tự động với:
Phản ứng dương tính (hình
ảnh cho tín hiệu huỳnh quang): tự kháng thể phản ứng với kháng nguyên đích trên
bề mặt của chất nền tạo tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu.
Phản ứng âm tính: kết quả
không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc các phản ứng bắt màu huỳnh quang không đặc
hiệu
4.3. Trả
kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả
theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ
sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG
SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước
khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh
phẩm: Máu không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp:
Lấy lại mẫu máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh
nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp:
Xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh
phẩm
- Thuốc
thử, hóa chất không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp:
Kiểm tra thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang
thiết bị:
+ Hoạt động
của hệ thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp:
Thực hiện bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
+ Nguồn
sáng, bộ lọc và đơn vị quang học của kính hiển vi huỳnh quang có thể ảnh hưởng
đến độ nhạy của phương pháp.
Giải pháp:
Sử dụng hệ thống hơi thủy ngân truyền thống, sự hoạt động của kính hiển vi sẽ
phụ thuộc vào sự bảo trì của thiết bị, đặc biệt là thay thế đèn sau khi hoạt
động quá thời gian cho phép.
5.2. Trong
quá trình thực hiện kỹ thuật
Thực hiện
sai quy trình kỹ thuật.
- Sai sót
do quá trình cài đặt mẫu vào vị trí không tương ứng với vị trí đã cài đặt trên phần
mềm
Giải pháp:
Kiểm tra thông tin lại trên miền làm việc “work list” về phương pháp, vị trí
đặt mẫu, thứ tự các mẫu sau khi đã khai báo
- Xử lý sai
các slide trong quá trình nhuộm, đặc biệt để các slide bị khô giữa các bước sẽ
dẫn đến “rửa trôi” hình ảnh và/ hoặc hình ảnh nhuộm bị sáng màu.
Giải pháp:
Làm lại xét nghiệm, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ
phòng xét nghiệm (25°c).
5.3. Sau
khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận
định và phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai
kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Quản lý bệnh nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU
CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu
thực hiện nội kiểm chất lượng.
- Yêu cầu
thực hiện ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1. Tebo ae.
Recent approaches to optimize laboratory assessment of antinuclear antibodies.
Clin vaccine immunol. 2017 dec 5;24(12):e00270-17.
2.
Vercammen m, bonroy c, broeders s, chan ekl, bizzaro n, bogdanos dp, andrade l,
coucke w, de melo cruvinel w, kozmar a, kuhi l, lutteri l, rego de sousa mj,
schouwers s, van hoovels l, bossuyt x; eflm working group on autoimmunity
testing. Analytical aspects of the antinuclear antibody test by hep-2 indirect
immunofluorescence: eflm report on an international survey. Clin chem lab med.
2023 mar 30;61(7):1199-1208.
3. Olsen
nj, choi my, fritzler mj. Emerging technologies in autoantibody testing for rheumatic
diseases. Arthritis res ther. 2017 jul 24;19(1):172.
4. Mahler
m, fritzler mj. The clinical significance of the dense fine speckled
immunofluorescence pattern on hep-2 cells for the diagnosis of systemic
autoimmune diseases. Clin dev immunol. 2012;2012:494356.
5. Ling m,
murali m. Antinuclear antibody tests. Clin lab med. 2019 dec;39(4):513-524.
6.
Damoiseaux j, andrade lec, carballo og, conrad k, francescantonio plc, fritzler
mj, garcia de la torre i, herold m, klotz w, cruvinel wm, mimori t, von muhlen
c, satoh m, chan ek. Clinical relevance of hep-2 indirect immunofluorescent
patterns: the international consensus on ana patterns (icap) perspective. Ann
rheum dis. 2019 jul;78(7):879-889.
22. ĐA TỰ
KHÁNG THỂ GANGLIOSIDE TRONG BỆNH THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ THANH GIẤY
1. ĐẠI
CƯƠNG
1.1. Mục
đích của kỹ thuật
Xét nghiệm
được sử dụng để phát hiện các tự kháng thể với Gangliosides được tìm thấy trong
mẫu bệnh nhân để hỗ trợ chẩn đoán các bệnh về thần kinh ngoại biên bao gồm: hội
chứng Guillain-barre, bệnh viêm đa dây thần kinh hủy Myelin mạn tính, bệnh dây
thần kinh vận động đa ổ, bệnh thần kinh cảm giác và hội chứng Miller - fisher.
1.2. Định
nghĩa, nguyên lý
Thanh giấy
có gắn các kháng nguyên tinh khiết được ủ với bệnh phẩm pha loãng, nếu trong
bệnh phẩm có chứa các tự kháng thể, các kháng thể đặt hiệu này sẽ gắn với các
kháng nguyên tương ứng. Để phát hiện các kháng thể đã gắn, bước ủ thứ hai sẽ
được thực hiện với kháng thể gắn enzym đánh dấu, sau đó cơ chất sẽ được thêm
vào để xúc tác cho phản ứng tạo màu.
Xét nghiệm
phát hiện đa tự kháng thể đặc hiệu nhóm IgM/ IgG của người kháng lại 7 loại
Gangliosides (GM1, GM2, GM3, GD1A, GD1B, GT1B, GQ1B trong mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người
thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật
y
- Điều
dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng
cụ
- Pipet
- Giá cắm
đầu côn
- Giá đựng
pipet man
- Khay ủ
- Chai thủy
tinh nút mài
- Ống đong
thủy tinh
- Giá cắm
ống nghiệm
- Nhiệt kế,
ẩm kế
2.2.2. Hóa
chất, thuốc thử
- Dung dịch
đệm
- Dung dịch
pha loãng bệnh phẩm
- Dung dịch
chất cộng hợp
- Dung dịch
cơ chất
- Dung dịch
rửa bệnh phẩm
- Dung dịch
rửa máy xét nghiệm
- Hóa chất
ngoại kiểm
- Hcsp chẩn
đoán
- Nước cất
2 lần
2.2.3. Vật
tư tiêu hao
- Bơm tiêm
nhựa 5ml
- Kim tiêm
nhựa
- Ống đựng
máu 3ml
- Ống
nghiệm 14x105
- Pipettor
thủy tinh
- Đầu côn vàng)
- Đầu côn
xanh
- Găng lấy
mẫu
- Găng tay
làm xét nghiệm
- Găng tay
xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu
trang
- Bông, gạc
sát khuẩn, băng cá nhân
- Khăn giấy
lau tay
- Túi nilon
đựng rác
- Quần áo
nhân viên
- Dung dịch
làm sạch, tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch
sát khuẩn tay
- Cồn sát
khuẩn 70 độ
- Dung dịch
xà phòng rửa tay trung tính
- Vật tư
thay thế hệ thống điện
2.3. Trang
thiết bị
- Hệ thống
máy xét nghiệm sắc ký miễn dịch (quy trình máy bán tự động)
- Hệ thống
máy xét nghiệm sắc ký miễn dịch tự động (quy trình máy tự động)
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Máy lắc
- Máy ủ
- Máy scan
- Máy sấy
- Đồng hồ
bấm giờ
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Máy lưu
điện
- Thùng đựng
rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.4. Chuẩn
bị mẫu bệnh phẩm
+ Loại bệnh
phẩm: Máu tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông
EDTA, hoặc Citrat.
+ Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết): bệnh phẩm dùng cho phân tích được pha loãng theo
hướng dẫn của bộ xét nghiệm với dung dịch đệm. Sử dụng đầu côn sạch trong quá
trình thao tác
- Tiêu
chuẩn mẫu bệnh phẩm:
+ Ống máu:
thể tích 3-5ml
+ Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
+ Trên ống
có ghi đầy đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh
nhân.
2.5. Phiếu
chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra
phiếu chỉ định xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người
bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời
gian lấy mẫu bệnh phẩm ...
2.6. Thời
gian thực hiện kỹ thuật: 3 - 4 giờ
2.7. Địa điểm
thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang
phục bảo hộ khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ,
vật tư tiêu hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải
y tế theo quy định;
- Mẫu bệnh
phẩm được lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự
cố tràn đổ theo quy định;
- Vệ sinh
sạch sẽ khu vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều
kiện môi trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi,
giám sát và đảm bảo theo quy định.
- Các trang
thiết bị làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản
xuất.
4. CÁC BƯỚC
TIẾN HÀNH
4.1. Máy
bán tự động
4.1.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, hoặc Citrat.
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu
chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các thanh
xét nghiệm đã được phủ kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Chất cộng
hợp: kháng thể kháng IgG của người gắn Alkaline phosphatase
- Dung dịch
pha loãng bệnh phẩm
- Dung dịch
rửa: pha loãng 10 lần dạng cô đặc với nước cất 2 lần, đưa dung dịch về nồng độ
hoạt động.
- Dung dịch
cơ chất: Nitroblue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro- 3- indolylphosphate
(nbt/bcip).
- Khay ủ
4.1.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1:
Lấy số thanh thử xét nghiệm theo yêu cầu và đặt vào các giếng trống. (đảm bảo bề
mặt của thanh thử không bị hư hỏng). Số trên thanh thử phải được nhìn thấy. Ủ
thanh xét nghiệm với 1.5ml đệm trên máy lắc ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C)
với thời gian tương ứng với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Sau đó
hút sạch.
- Bước 2:
Sử dụng đầu côn sạch thêm 1.5ml bệnh phẩm đã được pha loãng ủ với thanh xét
nghiệm ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C) trên máy lắc với thời gian tương ứng
với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
- Bước 3:
Hút sạch dung dịch trong các giếng, rửa với 1.5ml dung dịch đệm rửa trong vòng
5 phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình được thực hiện trên máy lắc. Lặp lại bước
này 3 lần.
- Bước 4:
Thêm 1.5ml kháng thể kháng IgG của người gắn enzyme đã pha loãng về nồng độ
hoạt động vào mỗi giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với thời gian tương
ứng với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm
- Bước 5:
Hút sạch dung dịch từ mỗi giếng. Rửa với 1.5ml dung dịch đệm rửa trong vòng 5
phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình được thực hiện trên máy lắc. Lặp lại bước này
3 lần.
- Bước 6:
Thêm dung dịch cơ chất vào mỗi giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với thời
gian theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
- Bước 7:
Hút sạch dung dịch từ mỗi giếng. Dừng phản ứng và rửa sạch thanh bằng 1.5ml
nước ro hoặc nước cất theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit xét nghiệm. Quy trình
được thực hiện trên máy lắc.
- Bước 8:
Đặt thanh thử lên giấy, chờ khô và đánh giá kết quả bằng phần mềm.
4.1.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Trên mỗi
thanh xét nghiệm đều có một vạch chứng dương đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng cho
quá trình thực hiện cho từng xét nghiệm. Cần đảm bảo mỗi mẫu bệnh phẩm cho ra
kết quả vạch kháng nguyên chứng dương tính mạnh mới được coi là một kết quả
đạt. Đối với một kết quả không đạt (vạch chứng không lên hoặc lên yếu) cần được
tiến hành tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục nguyên nhân và chạy lại xét nghiệm
đó.
+ Đảm bảo
chất lượng xét nghiệm theo quy trình thực hiện nội kiểm
- Đọc kết
quả và nhận định kết quả:
+ Sử dụng phần
mềm để đánh giá kết quả.
+ Kết quả
được giải thích dựa trên cường độ tín hiệu bao gồm các nhóm sau: Âm tính, dương
tính, nghi ngờ (khuyến cáo nên kiểm tra lại xét nghiệm sau 1 tuần với mẫu bệnh
phẩm mới).
4.2. Máy tự
động
4.2.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, hoặc Citrat.
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu
chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các thanh
xét nghiệm đã được phủ kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Chất cộng
hợp: kháng thể của dê kháng IgG của người gắn alkaline phosphatase
- Dung dịch
pha loãng bệnh phẩm
- Dung dịch
rửa: pha loãng 10 lần dạng cô đặc với nước cất 2 lần, đưa dung dịch về nồng độ
hoạt động.
- Dung dịch
cơ chất: Nitroblue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro- 3- indolylphosphate
(nbt/bcip).
- Khay ủ
4.2.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1:
Lấy số thanh thử xét nghiệm theo yêu cầu và đặt vào các giếng trống. (đảm bảo
bề mặt của thanh thử không bị hư hỏng). Số trên thanh thử phải được nhìn thấy.
Ủ thanh xét nghiệm với 1.5ml đệm trên máy lắc ở nhiệt độ phòng (+18°C đến
+25°C) với thời gian tương ứng với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
Sau đó hút sạch.
- Bước 2:
Sử dụng đầu côn sạch thêm 1.5ml bệnh phẩm đã được pha loãng ủ với thanh xét
nghiệm ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C) trên máy lắc với thời gian tương ứng
với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
- Bước 3:
Hút sạch dung dịch trong các giếng, rửa với 1.5ml dung dịch đệm rửa trong vòng
5 phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình được thực hiện trên máy lắc. Lặp lại bước
này 3 lần.
- Bước 4:
Thêm 1.5ml kháng thể kháng IgG của người gắn enzyme đã pha loãng về nồng độ
hoạt động vào mỗi giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với thời gian tương
ứng với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm
- Bước 5:
Hút sạch dung dịch từ mỗi giếng. Rửa với 1.5ml dung dịch đệm rửa trong vòng 5
phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình được thực hiện trên máy lắc. Lặp lại bước này
3 lần.
- Bước 6:
Thêm dung dịch cơ chất vào mỗi giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với thời
gian theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
- Bước 7:
Hút sạch dung dịch từ mỗi giếng. Dừng phản ứng và rửa sạch thanh bằng 1.5ml
nước ro hoặc nước cất theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit xét nghiệm. Quy trình
được thực hiện trên máy lắc.
- Bước 8:
Đặt thanh thử lên giấy, chờ khô và đánh giá kết quả bằng phần mềm.
4.2.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Trên mỗi
thanh xét nghiệm đều có một vạch chứng dương đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng cho
quá trình thực hiện cho từng xét nghiệm. Cần đảm bảo mỗi mẫu bệnh phẩm cho ra
kết quả vạch kháng nguyên chứng dương tính mạnh mới được coi là một kết quả
đạt. Đối với một kết quả không đạt (vạch chứng không lên hoặc lên yếu) cần được
tiến hành tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục nguyên nhân và chạy lại xét nghiệm
đó.
+ Đảm bảo
chất lượng xét nghiệm theo quy trình thực hiện nội kiểm
- Đọc kết
quả và nhận định kết quả:
+ Sử dụng phần
mềm để đánh giá kết quả.
+ Kết quả
được giải thích dựa trên cường độ tín hiệu bao gồm các nhóm sau: âm tính, dương
tính, nghi ngờ (khuyến cáo nên kiểm tra lại xét nghiệm sau 1 tuần với mẫu bệnh
phẩm mới).
4.3. Trả
kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả
theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ
sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG
SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước
khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh
phẩm:
+ Máu không
được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp:
Lấy lại mẫu máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
+ Tên bệnh
nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp:
Xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh
phẩm
- Thuốc
thử, hóa chất không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi..):
Giải pháp:
kiểm tra thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang
thiết bị: Hoạt động của hệ thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp:
thực hiện bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo quy định.
5.2. Trong
quá trình thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện
sai quy trình kỹ thuật.
+ Nhầm lẫn
trong nhỏ mẫu vào vị trí phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh
nhân và thứ tự mẫu phân tích.
+ Quá trình
ủ rửa không chính xác
Giải pháp:
+ Thực hiện
lại quy trình; đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ
nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu
trước khi nhỏ mẫu
5.3. Sau
khi thực hiện kỹ thuật
- Thanh xét
nghiệm không được khô hoàn toàn trước khi đánh giá kết quả dẫn đến những vệt
bám không đặc hiệu hoặc tín hiệu nền bị cao
Giải pháp:
phơi khô hoàn toàn thanh xét nghiệm ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành chụp
đánh giá kết quả
- Đọc, nhận
định và phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai
kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Quản lý bệnh nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU
CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu
thực hiện nội kiểm chất lượng.
- Yêu cầu
thực hiện ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1. Sun, y.,
li, z., liang, w. Et al. A novel immunochromatographic strips assay for rapid
and simple detection of systemic lupus erythematosus. Sci rep 10, 14178 (2020).
2. S h
paek, s h lee, j h cho, y s kim. Development of rapid one-step
immunochromatographic assay. Methods. 2000 sep;22(1):53-60.
3. Alexandr
e urusov , alina v petrakova, milyausha k gubaydullina, anatoly v zherdev 1,
sergei a eremin 1 2, dezhao kong 3, liqiang liu 3, chuanlai xu 3, boris b
dzantiev. High-sensitivity immunochromatographic assay for fumonisin b1 based
on indirect antibody labeling. Biotechnol lett. 2017 may;39(5):751-758.
4. Qin q ,
wang k , yang j , xu h , cao b , wo y , jin q , cui d. Algorithms for
immunochromatographic assay: review and impact on future application. Analyst.
2019 sep 23;144(19):5659-5676.
23. ĐA TỰ
KHÁNG THỂ TRONG HỘI CHỨNG THẦN KINH CẬN U BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ THANH GIẤY
1. ĐẠI
CƯƠNG
1.1. Mục
đích của kỹ thuật
Xét nghiệm
được sử dụng để phát hiện đa tự kháng thể với 12 loại kháng nguyên Amphyphisin,
CV2, PNMA2, (Ma2/Ta), Ri, Yo, Hu, recoverin, SOX1, titin, Zic4, GAD65, Tr
(DNER) trong mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán hội chứng thần kinh cận u.
1.2. Định
nghĩa, nguyên lý
Thanh giấy
có gắn các kháng nguyên tinh khiết được ủ với bệnh phẩm pha loãng, nếu trong
bệnh phẩm có chứa các tự kháng thể, các kháng thể đặt hiệu này sẽ gắn với các
kháng nguyên tương ứng. Để phát hiện các kháng thể đã gắn, bước ủ thứ hai sẽ
được thực hiện với kháng thể gắn enzym đánh dấu, sau đó cơ chất sẽ được thêm
vào để xúc tác cho phản ứng tạo màu.
Xét nghiệm
phát hiện đa tự kháng thể đặc hiệu nhóm IgG của người kháng lại 12 loại kháng
nguyên Amphyphisin, CV2, PNMA2, (Ma2/Ta), Ri, Yo, Hu, recoverin, SOX1, titin,
Zic4, GAD65, Tr (DNER).
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người
thực hiện
- Bác sỹ
- Kỹ thuật
y
- Điều
dưỡng
2.2. Vật tư
2.2.1. Dụng
cụ
- Pipet
- Giá cắm
đầu côn
- Giá đựng
pipet man
- Khay ủ
- Chai thủy
tinh nút mài
- Ống đong
thủy tinh
- Giá cắm
ống nghiệm
- Nhiệt kế,
ẩm kế
2.2.2. Hóa
chất, thuốc thử
- Dung dịch
đệm
- Dung dịch
pha loãng bệnh phẩm
- Dung dịch
chất cộng hợp
- Dung dịch
cơ chất
- Dung dịch
rửa bệnh phẩm
- Dung dịch
rửa máy xét nghiệm
- Hóa chất
ngoại kiểm
- Hcsp chẩn
đoán
- Nước cất
2 lần
2.2.3. Vật
tư tiêu hao
- Bơm tiêm
nhựa 5ml
- Kim tiêm
nhựa
- Ống đựng
máu 3ml
- Ống
nghiệm 14x105
- Pipettor
thủy tinh
- Đầu côn
vàng
- Đầu côn
xanh
- Găng lấy
mẫu
- Găng tay
làm xét nghiệm
- Găng tay
xử lý dụng cụ
- Mũ giấy
- Khẩu
trang
- Bông, gạc
sát khuẩn, băng urgo
- Khăn giấy
lau tay
- Túi nilon
đựng rác
- Quần áo
nhân viên
- Dung dịch
làm sạch, tẩy rửa dụng cụ y tế
- Dung dịch
sát khuẩn tay
- Cồn sát
khuẩn 70 độ
- Dung dịch
xà phòng rửa tay trung tính
- Vật tư
thay thế hệ thống điện
2.3. Trang
thiết bị
- Hệ thống
máy xét nghiệm sắc ký miễn dịch (quy trình máy bán tự động)
- Hệ thống
máy xét nghiệm sắc ký miễn dịch tự động (quy trình máy tự động)
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Máy hút
ẩm
- Máy scan
- Máy sấy
- Tủ lạnh
lưu mẫu
- Tủ lạnh
đựng hóa chất
- Tủ sấy
khô
- Tủ ấm
37ºC
- Máy ly
tâm
- Máy lưu
điện
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
2.4. Chuẩn
bị mẫu bệnh phẩm
+ Loại bệnh
phẩm: Máu tĩnh mạch, 01 ống không có chất chống đông hoặc có chất chống đông
EDTA, hoặc Citrat.
+ Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết): bệnh phẩm dùng cho phân tích được pha loãng theo
hướng dẫn của bộ xét nghiệm với dung dịch đệm. Sử dụng đầu côn sạch trong quá
trình thao tác
- Tiêu
chuẩn mẫu bệnh phẩm:
+ Ống máu:
thể tích 3-5ml
+ Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
+ Trên ống
có ghi đầy đủ thông tin: tên, tuổi, khoa, giường hoặc barcode nhận dạng bệnh
nhân.
2.5. Phiếu
chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra
phiếu chỉ định xét nghiệm: có đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người
bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời
gian lấy mẫu bệnh phẩm ...
2.6. Thời
gian thực hiện kỹ thuật: 3 - 4 giờ
2.7. Địa điểm
thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm.
3. AN TOÀN
- Mặc trang
phục bảo hộ khi làm xét nghiệm;
- Dụng cụ,
vật tư tiêu hao sau khi làm xét nghiệm phải cho vào hộp dụng cụ chứa chất thải
y tế theo quy định;
- Mẫu bệnh
phẩm được lưu và hủy theo quy định;
- Xử lý sự
cố tràn đổ theo quy định;
- Vệ sinh
sạch sẽ khu vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc;
- Các điều
kiện môi trường phòng xét nghiệm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … được theo dõi,
giám sát và đảm bảo theo quy định;
- Các trang
thiết bị làm xét nghiệm được bảo dưỡng, hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản
xuất.
4. CÁC BƯỚC
TIẾN HÀNH
4.1. Máy
bán tự động
4.1.1. Chuẩn
bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, hoặc Citrat.
- Mẫu máu:
lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu
chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu, máu không bị đục.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.1.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các thanh
xét nghiệm đã được phủ kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Chất cộng
hợp: kháng thể kháng IgG của người gắn Alkaline phosphatase (từ dê)
- Dung dịch
pha loãng bệnh phẩm
- Dung dịch
rửa: pha loãng 10 lần dạng cô đặc với nước cất 2 lần, đưa dung dịch về nồng độ
hoạt động.
- Dung dịch
cơ chất: Nitroblue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro- 3- indolylphosphate
(nbt/bcip).
- Khay ủ
4.1.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1:
Lấy số thanh thử xét nghiệm theo yêu cầu và đặt vào các giếng trống. (đảm bảo
bề mặt của thanh thử không bị hư hỏng). Số trên thanh thử phải được nhìn thấy.
Ủ thanh xét nghiệm với 1.5ml đệm trên máy lắc ở nhiệt độ phòng (+18°C đến
+25°C) với thời gian tương ứng với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
Sau đó hút sạch.
- Bước 2:
Sử dụng đầu côn sạch thêm 1.5ml bệnh phẩm đã được pha loãng ủ với thanh xét
nghiệm ở nhiệt độ phòng (+18°C đến +25°C) trên máy lắc với thời gian tương ứng
với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
- Bước 3:
Hút sạch dung dịch trong các giếng, rửa với 1.5ml dung dịch đệm rửa trong vòng
5 phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình được thực hiện trên máy lắc. Lặp lại bước
này 3 lần.
- Bước 4:
Thêm 1.5ml kháng thể kháng IgG của người gắn enzyme đã pha loãng về nồng độ
hoạt động vào mỗi giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với thời gian tương
ứng với hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm
- Bước 5:
Hút sạch dung dịch từ mỗi giếng. Rửa với 1.5ml dung dịch đệm rửa trong vòng 5
phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình được thực hiện trên máy lắc. Lặp lại bước này
3 lần.
- Bước 6:
Thêm dung dịch cơ chất vào mỗi giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với thời
gian theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm.
- Bước 7:
Hút sạch dung dịch từ mỗi giếng. Dừng phản ứng và rửa sạch thanh bằng 1.5ml
nước ro hoặc nước cất theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit xét nghiệm. Quy trình được
thực hiện trên máy lắc.
- Bước 8:
Đặt thanh thử lên giấy, chờ khô và đánh giá kết quả bằng phần mềm.
4.1.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Trên mỗi
thanh xét nghiệm đều có một vạch chứng dương đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng cho
quá trình thực hiện cho từng xét nghiệm. Cần đảm bảo mỗi mẫu bệnh phẩm cho ra
kết quả vạch kháng nguyên chứng dương tính mạnh mới được coi là một kết quả
đạt. Đối với một kết quả không đạt (vạch chứng không lên hoặc lên yếu) cần được
tiến hành tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục nguyên nhân và chạy lại xét nghiệm
đó.
+ Đảm bảo
chất lượng xét nghiệm theo quy trình thực hiện nội kiểm
- Đọc kết
quả và nhận định kết quả.
+ Sử dụng phần
mềm để đánh giá kết quả.
+ Kết quả
được giải thích dựa trên cường độ tín hiệu bao gồm các nhóm sau: âm tính, dương
tính, nghi ngờ (khuyến cáo nên kiểm tra lại xét nghiệm sau 1 tuần với mẫu bệnh
phẩm mới).
4.2. Máy tự
động
4.2.1.
Chuẩn bị bệnh phẩm
a. Lấy bệnh
phẩm
- Loại bệnh
phẩm: Huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDTA, hoặc Citrat.
- Mẫu máu:
Lấy 3ml máu tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông - ống đựng máu tiêu
chuẩn. Máu không vỡ hồng cầu.
- Sau khi
lấy máu, đem li tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương cho vào ống tách
huyết thanh.
- Mẫu bệnh
phẩm phải bảo quản ở 2 - 8°C trong vòng 14 ngày. Mẫu bệnh phẩm đã pha loãng nên
được thực hiện trong ngày.
- Pha loãng
bệnh phẩm (nếu cần thiết) theo hướng dẫn sử dụng của từng loại xét nghiệm. Chú
ý: trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Nhận
bệnh phẩm
- Mẫu bệnh
phẩm được lấy đúng tiêu chuẩn và đủ thể tích theo yêu cầu xét nghiệm.
- Các thông
tin trên mẫu bệnh phẩm phù hợp với phiếu chỉ định xét nghiệm
4.2.2.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Tất cả
các hóa chất của bộ kit xét nghiệm cần được để ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất
30 phút trước khi thực hiện thao tác
- Các thanh
xét nghiệm đã được phủ kháng nguyên đích và được bảo bản trong một túi thiếc
với gói chất chống ẩm
- Dung dịch
chất cộng hợp
- Dung dịch
pha loãng bệnh phẩm
- Dung dịch
rửa: pha loãng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
- Dung dịch
cơ chất
- Khay ủ
4.2.3. Tiến
hành kỹ thuật
- Bước 1:
Kiểm tra bình thải phải trống và bình đựng dung dịch rửa hệ thống phải được bổ
sung đầy.
- Bước 2:
Bật máy, máy tiến hành kiểm tra tự động “selftest” tình trạng của thiết bị
trước khi chạy.
- Bước 3:
Xây dựng bảng thông tin xét nghiệm thực hiện “worklist” bao gồm: mã bệnh phẩm,
thông tin cơ bản của bệnh nhân, mã xét nghiệm thực hiện trên phần mềm tương
thích.
- Bước 4:
Nạp mẫu vào máy và chuẩn bị hóa chất theo hướng dẫn. Để các lọ đựng hóa chất đã
chuẩn bị vào các kênh tương ứng theo hướng dẫn của máy
- Bước 5:
Đặt thanh thử vào các giếng trên máy tương ứng với số bệnh phẩm cần thực hiện.
- Bước 6:
Chọn chương trình chạy tương ứng.
- Bước 7:
Chọn start để máy bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
- Lưu ý:
Cần tiến hành thực hiện vệ sinh thiết bị theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản
xuất trước hoặc sau khi thực hiện xét nghiệm để tránh nhiễm chéo giữa các lần
thực hiện
- Bước 8:
Đánh giá kết quả bằng phần mềm và in kết quả.
4.2.4. Nhận
định kết quả
- Xem xét
kết quả chạy chứng:
+ Trên mỗi
thanh xét nghiệm đều có một vạch chứng dương đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng cho
quá trình thực hiện cho từng xét nghiệm. Cần đảm bảo mỗi mẫu bệnh phẩm cho ra
kết quả vạch kháng nguyên chứng dương tính mạnh mới được coi là một kết quả
đạt. Đối với một kết quả không đạt (vạch chứng không lên hoặc lên yếu) cần được
tiến hành tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục nguyên nhân và chạy lại xét nghiệm
đó.
+ Đảm bảo
chất lượng xét nghiệm theo quy trình thực hiện nội kiểm
- Đọc kết
quả và nhận định kết quả
+ Sử dụng phần
mềm để đánh giá kết quả
+ Kết quả
được giải thích dựa trên cường độ tín hiệu bao gồm các nhóm sau: âm tính, dương
tính, nghị ngờ (khuyến cáo nên kiểm tra lại xét nghiệm sau 1 tuần với mẫu bệnh
phẩm mới).
4.3. Trả kết
quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả
theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ
sơ xét nghiệm.
5. NHỮNG
SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước
khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh
phẩm: Máu không được bảo quản đúng cách làm biến tính các tự kháng thể.
Giải pháp:
lấy lại mẫu máu. Mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8°C, sử dụng trong vòng 14 ngày
- Tên bệnh
nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất:
Giải pháp:
Xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh
phẩm
- Thuốc
thử, hóa chất không đảm bảo chất lượng (hết hạn, hỏng, lỗi…):
Giải pháp:
Kiểm tra thuốc thử, hoá chất và thực hiện nội kiểm theo quy định.
- Trang
thiết bị: Hoạt động của hệ thống máy phục vụ xét nghiệm không ổn định.
Giải pháp:
Thực hiện bảo dưỡng, hiệu chuẩn máy theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
5.2. Trong
quá trình thực hiện kỹ thuật
- Thực hiện
sai quy trình kỹ thuật.
Nhầm lẫn
trong nhỏ mẫu vào vị trí phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh
nhân và thứ tự mẫu phân tích.
- Giải
pháp:
+ Thực hiện
lại quy trình; đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
+ Vẽ sơ đồ
nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu
trước khi nhỏ mẫu
5.3. Sau
khi thực hiện kỹ thuật
- Thanh xét
nghiệm không được khô hoàn toàn trước khi đánh giá kết quả dẫn đến những vệt
bám không đặc hiệu hoặc tín hiệu nền bị cao
Giải pháp:
phơi khô hoàn toàn thanh xét nghiệm ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành chụp
đánh giá kết quả
- Đọc, nhận
định và phiên giải sai kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Đào tạo lại và đào tạo liên tục cho nhân viên
- Trả sai
kết quả xét nghiệm.
Giải pháp:
Quản lý bệnh nhân, chỉ định xét nghiệm và mẫu bệnh phẩm theo mã.
6. TIÊU
CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu
thực hiện nội kiểm chất lượng.
- Yêu cầu
thực hiện ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù.
TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1. Sun, y.,
li, z., liang, w. Et al. A novel immunochromatographic strips assay for rapid
and simple detection of systemic lupus erythematosus. Sci rep 10, 14178 (2020).
2. S h
paek, s h lee, j h cho, y s kim. Development of rapid one-step
immunochromatographic assay. Methods. 2000 sep;22(1):53-60.
3. Alexandr
e urusov , alina v petrakova, milyausha k gubaydullina, anatoly v zherdev 1,
sergei a eremin 1 2, dezhao kong 3, liqiang liu 3, chuanlai xu 3, boris b
dzantiev. High-sensitivity immunochromatographic assay for fumonisin b1 based
on indirect antibody labeling. Biotechnol lett. 2017 may;39(5):751-758.
4. Qin q ,
wang k , yang j , xu h , cao b , wo y , jin q , cui d. Algorithms for
immunochromatographic assay: review and impact on future application. Analyst.
2019 sep 23;144(19):5659-5676.
24. TIÊM
HOẶC TRUYỀN CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC
1. ĐẠI
CƯƠNG
1.1. Định
nghĩa, nguyên lý
Tiêm truyền
các chế phẩm sinh học đường tĩnh mạch là đưa vào cơ thể người bệnh một khối
lượng dung dịch và thuốc bằng đường tĩnh mạch
1.2. Mục
đích của kỹ thuật
Truyền các
chế phẩm sinh học được dùng để điểu trị các bệnh lý dị ứng, bệnh tự miễn và ung
thư rất có hiệu quả nhưng giá thành cao và cũng có thể có các tác dụng phụ
trước mắt và lâu dài nên chỉ dùng cho những trường hợp bệnh nặng.
2. CHỈ ĐỊNH
- Được chỉ
định để điều trị nhiều loại bệnh tự miễn dịch trong các trường hợp nặng không
đáp ứng với các thuốc điều trị thông thường. Mỗi loại chế phẩm sinh học sẽ có
các chỉ định riêng.
- Một số
bệnh lý dị ứng, bệnh tự miễn và bệnh lý viêm có thể được chỉ định điều trị các
chế phẩm sinh học bao gồm:
+ Viêm khớp
dạng thấp
+ viêm cột
sống dính khớp
+ Bệnh
Crohn
+ Viêm loét
đại trực tràng
+ Vảy nến
+ Xơ cứng
rải rác
+ Lupus ban
đỏ hệ thống
+ Hen phế
quản dị ứng
+ Mày đay
mạn tính
+ Giảm tiểu
cầu miễn dịch vô căn không đáp ứng với Corticoid
+ Người
bệnh viêm cơ tự miễn có tổn thương phổi kẽ hoặc có viêm mạch nặng, hoặc đáp ứng
kém với Corticoid phối hợp với Metrothexate.
+ Hội chứng
Guillain-barre
+ Viêm đa
rễ thần kinh mất Myelin
+ Bệnh
Kawasaki
+ Hội chứng
Stevens-Johnson và hội chứng Lyell do thuốc
+ Suy giảm
miễn dịch dịch thể
3. CHỐNG
CHỈ ĐỊNH
Mỗi loại
chế phẩm sinh học sẽ có các chống chỉ định riêng biệt, dưới đây là một số chống
chỉ định thường gặp:
- Phụ nữ có
thai
- Suy tim
nặng
- Mẫn cảm
với các thành phần của thuốc
4. THẬN
TRỌNG
- Tiền sử
mắc Lao
- Phụ nữ
đang cho con bú
5. CHUẨN BỊ
5.1. Người
thực hiện
- Bác sỹ:
01 người
- Điều
dưỡng: 01 người
5.2. Thuốc,
hóa chất
-
Methylprednisolon 40 mg
- Dopamin
200 mg
- Morphin
0,1% - 2ml
-
Epinephrine 1mg
-
Diphenhydramin hydrochloride 10 mg
-
Salbutamol 5 mg kd
-
Salbutamol 0,5 mg
- Glucose
5% 500ml
-
Natriclorid 0,9% 100ml
-
Natriclorid 0,9% 500ml
- Thuốc
chống nôn, thuốc lợi tiểu
5.3. Vật tư
5.3.1 Dụng
cụ
- Kéo, băng
dính
- Huyết áp,
ống nghe
- Gối kê
tay, dây garo, cọc truyền
- Hộp vô
khuẩn đựng: gạc tam giác, gạc phủ vùng truyền, bông cầu
- Găng tay
vô khuẩn
- Khay quả
đậu hoặc túi đựng đồ bẩn, hộp đựng vật sắc nhọn
- Xe tiêm
chuyên dụng
- Lồng kính
pha thuốc chuyên dụng
- Quần áo,
mũ, găng, kính bảo hộ để pha thuốc
5.3.2 Vật
tư tiêu hao
- Dung dịch
khử khuẩn tẩy rửa
- Dung dịch
khử khuẩn tay chứa cồn
- Dung dịch
khử khuẩn
- Cồn sát
khuẩn 70ºC
- Bơm tiêm
nhựa 1ml
- Bơm tiêm
nhựa 5ml
- Bơm tiêm
nhựa 10ml
- Bơm tiêm
nhựa 20ml
- Bơm tiêm
nhựa 50ml
- Dây
truyền huyết thanh
- Điện cực
dán cho máy theo dõi người bệnh
- Kim luồn
Catheter
- Chạc ba
dịch truyền có dây nối
- Gạc lót
đốc kim 4cmx5cmx4l
- Băng dính
y tế
- Băng keo
cá nhân 2cm x 6cm
- Canuyn
mayo
- Găng khám
- Mũ giấy
- Khẩu
trang giấy dây buộc
- Bông hút
- Oxy
- Dây oxy
- Dây nối
bơm tiêm điện
- Mask khí
dung
5.4. Trang
thiết bị
- Máy theo
dõi dấu hiệu sinh tồn
- Máy tính
- Máy in
- Đầu đọc
barcode
- Máy in
barcode
- Thùng
đựng rác tái chế
- Thùng
đựng rác lây nhiễm
- Thùng
đựng rác sinh hoạt
- Thùng
nhựa ngâm dụng cụ bẩn….
5.5. Chuẩn
bị bệnh nhân
- Bác sỹ
giải thích cho người bệnh liệu pháp điều trị, sự cần thiết, hiệu quả và các tác
dụng không mong muốn có thể có.
- Người
bệnh đồng ý tham gia liệu pháp điều trị.
- Động viên
và dặn người bệnh đi đại tiểu trước khi truyền.
5.6. Hồ sơ
bệnh án
- Kiểm tra
y lệnh, thực hiện 5 đúng
- Kiểm tra
lại xét nghiệm, đánh giá chức năng thận, tình trạng của người bệnh.
5.7. Thời
gian thực hiện kỹ thuật: 1-2 giờ
5.8. Địa điểm
thực hiện kỹ thuật: Buồng bệnh
5.9. Kiểm
tra hồ sơ
a. Kiểm tra
người bệnh: đánh giá tính chính xác của người bệnh: đúng người bệnh, đúng chẩn
đoán, đúng vị trí cần thực hiện thủ thuật.
b. Thực
hiện bảng kiểm an toàn thủ thuật
c. Tư thế
bệnh nhân: nằm
6. CÁC BƯỚC
TIẾN HÀNH
6.1. Các
bước thực hiện
- Điều
dưỡng rửa tay đội mũ, đeo khẩu trang, mặc quần áo, đi găng bảo hộ
- Kiểm tra
chai dịch, thuốc và bật nút chai, sát khuẩn tiến hành pha thuốc trong lồng kính
chuyên dụng
- Xé túi
đựng dây truyền, khóa dây truyền, cắm dây truyền vào chai dịch, treo chai dịch
lên cọc truyền, đuổi hết khí trong dây truyền và khóa lại.
- Điều
dưỡng thay găng, đặt người bệnh nằm tư thế thuận lợi, bộc lộ vùng truyền, xác
định vị trí truyền
- Đặt gối
dưới vùng truyền, nẹp (nếu cần), đặt dây garo trên vị trí truyền
- Thắt dây
garo, sát khuẩn vị trí truyền 2 lần bằng cồn 70ºC.
- 1 tay cố
định tĩnh mạch nơi truyền, 1 tay cầm kim catherte đâm qua da một góc 15 độ đến
30 độ, hạ kim tiêm sát mặt da và luồn kim vào tĩnh mạch, khi thấy máu vào đốc
kim tháo dây garo,
- Lắp ba
chạc, dây truyền,
- Mở khóa
cho dịch chảy, quan sát sắc mặt người bệnh.
- Cố định
đốc kim, đặt gạc phủ vùng truyền, cố định dây truyền, điều chỉnh tốc độ nhỏ
giọt theo chỉ định. Bỏ nilon, gối kê tay và dây garo
- Tiêm
thuốc chống nôn cho người bệnh
- Truyền
cho người bệnh chai dịch có pha chế phẩm sinh học với tốc độ 60 giọt/phút
- Tiêm
thuốc lợi tiểu cho người bệnh
- Ghi phiếu
tiêm truyền:
+ Giờ bắt
đầu truyền
+ Số lượng
dịch truyền
+ Giờ kết
thúc
- Dặn người
bệnh những điều cần thiết trước khi rời phòng
- Theo dõi
sát tình trạng người bệnh
6.2. Nhận
định kết quả
- Trong 15
phút đầu theo dõi người bệnh về sắc mặt, mạch, huyết áp, nhịp thở, vùng truyền.
Nếu thấy những biểu hiện thất thường phải báo ngay cho bác sĩ biết
- Quan sát
sự lưu thông của dịch
- Chai dịch
pha chế phẩm sinh học luôn được bảo quản tránh ánh sáng mặt trời và truyền
nhanh 60giọt/ phút
- Thường
xuyên kiểm tra:
+ Xem nơi
truyền có sưng phồng không
+ Dịch chảy
có bị tắc không
+ Không khí
có trong dây truyền hay không
+ Có bị
tuột dây truyền ra khỏi đốc kim không
+ Khi còn khoảng
10-15 ml dịch thì khóa lại, rút kim truyền hoặc thay chai khác nếu truyền tiếp
- Đánh giá
lại tình trạng người bệnh qua xét nghiệm: tế bào máu, điện giải đồ, sau truyền
lần đầu 3-5 ngày và sau 2 tuần nếu điều trị lâu dài
- Theo dõi
tình trạng viêm, chảy máu của đường tiết niệu. Nếu có đái máu đại thể cần ngừng
trị liệu.
6.3. Trả
kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả
theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ
sơ xét nghiệm.
7. THEO DÕI
VÀ XỬ TRÍ TAI BIẾN
7.1. Tai
biến trong khi thực hiện kỹ thuật
- Dịch
không chảy:
+ Do mũi
vát của thành kim áp sát vào thành mạch
+ Do mạch
xẹp
+ Do tắc
kim thường do cục máu đông trong lòng mạch
Giải pháp:
kiểm tra nguyên nhân và điều chỉnh kim truyền, dây truyền cho phù hợp.
- Phồng nơi
tiêm do kim truyền bị chệch khỏi lòng mạch, dịch thoát ra ngoài gây phồng nơi
truyền làm cho người bệnh đau, gây hoại tử tổ chức nếu dịch truyền là ưu
trương, hóa chất…
Giải pháp:
Kiểm tra nguyên nhân và cắm lại đường truyền cho phù hợp.
- Người
bệnh bị sốc: trong quá trình truyền dung dịch tĩnh mạch, người bệnh có thể bị
sốc do phản ứng với thuốc, hoặc dịch truyền không đảm bảo. Sốc cũng có thể xảy
ra nếu lượng dich đi vào cơ thể người bệnh quá nhanh với số lượng lớn.
Giải pháp:
ngừng truyền, cấp cứu bệnh nhân theo phác đồ cấp cứu sốc phản vệ của bộ y tế.
- Phù phổi
cấp: trong trường hợp người bệnh bị bệnh tim, phổi, khi truyền dịch với số
lượng lớn, tốc độ nhanh có thể dẫn đến phù phổi cấp nguy hiểm tính mạng người
bệnh.
Giải pháp:
ngừng truyền, thăm khám điều trị.
- Tắc mạch
phổi: truyền dung dịch tĩnh mạch cho người bệnh nếu không đúng qui trình kỹ
thuật, không khí lọt vào trong lòng mạch gây tắc ở những vùng mạch nhỏ, não,
phổi…
Giải pháp:
ngừng truyền, thăm khám điều trị.
7.2. Tai
biến sau khi thực hiện kỹ thuật
- Bệnh nhân
có biểu hiện dị ứng cấp tính - sốc phản vệ
Giải pháp:
Cấp cứu bệnh nhân theo phác đồ cấp cứu sốc phản vệ của Bộ y tế.
- Bệnh nhân
có biểu hiện: ban đỏ trên da, mày đay, phù, ngứa…
Giải pháp:
Thăm khám, đánh giá mức độ dị ứng của bệnh nhân và chỉ định thuốc điều trị.
7.3. Biến
chứng muộn
- Bệnh nhân
có biểu hiện dị ứng muộn
Giải pháp:
Thăm khám, đánh giá mức độ dị ứng của bệnh nhân và chỉ định thuốc điều trị.
TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1. White b,
moore wc, wigley fm, et al. Cyclophosphamide is associated with pulmonary
function and survival benefit in patients with scleroderma and alveolitis. Ann
intern med. 2000;132:947-54.
2. Teles
ka, medeiros-souza p, lima fac, araújo bg, lima rac. Cyclophosphamide
administration routine in autoimmune rheumatic diseases: a review. Rev bras
reumatol engl ed. 2017 nov-dec;57(6):596-604.
3. Dan d,
fischer r, adler s, förger f, villiger pm. Cyclophosphamide: as bad as its
reputation? Long-term single centre experience of cyclophosphamide side effects
in the treatment of systemic autoimmune diseases. Swiss med wkly. 2014 oct
23;144:w14030.
4. Woytala
pj, morgiel e, łuczak a, czesak-woytala k, wiland p. The safety of intravenous
cyclophosphamide in the treatment of rheumatic diseases. Adv clin exp med. 2016
may-jun;25(3):479-84.
5. Mehra s,
usdadiya jb, jain vk, misra dp, negi vs. Comparing the efficacy of low- dose vs
high-dose cyclophosphamide regimen as induction therapy in the treatment of
proliferative lupus nephritis: a single center study. Rheumatol int. 2018
apr;38(4):557-568.
6. Crispin
p, burgess m, beath a. Unified infusion rates for 10% intravenous immunoglobulin.
Transfus apher sci. 2018 apr;57(2):243-246.
7. Sriaroon
p, ballow m. Immunoglobulin replacement therapy for primary immunodeficiency.
immunol allergy clin north am. 2015 nov;35(4):713-30.
8. Paul f,
cartron g.infusion-related reactions to rituximab: frequency, mechanisms and
predictors. Expert rev clin immunol. 2019 apr;15(4):383-389.