Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9717:2013 về Chất lượng nước - Phát hiện Samonella spp

• Số hiệu: TCVN9717:2013
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2013

Dạng thể hiện	Giải thích
Phần dày hơn
Màu vàng (axit)	Gluco dương tính (sự lên men của glucoza)
Màu đỏ hoặc không đổi màu (kiềm)	Gluco âm tính (không lên men cacbohydrat)
Màu đen	Sinh sunfua hydro
Bọt hoặc vết rạn	Sinh khí từ glucoza
Phần bề mặt nghiêng
Màu vàng	Dương tính lactoza hoặc sucroza (sử dụng lactoza hoặc sucroza)
Màu đỏ hoặc không đổi màu	Âm tính lactoza và sucroza (không sử dụng lacto và sucro)

Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên mặt nghiêng của thạch, tính axit (màu vàng) phần dày hơn của ống thạch và sinh khí (bọt khí) và (khoảng 90 % các trường hợp) sinh sunfua hydro (thạch bị đen).

Khi Salmonella dương tính với lactoza được phân lập, thì mặt nghiêng của ống thạch TSI có màu vàng. Do vậy, việc khẳng định sơ bộ các chủng Salmonella không chỉ dựa trên các kết quả của phép thử trên thạch TSI.

8.5.3.3. Thạch urê

Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch urê (B.6). Ủ ở (36 ± 2) °C trong 24 h và kiểm tra thường xuyên. Nếu phản ứng là dương tính, thì sự thủy phân urê giải phóng ra amoniac, làm phenol màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ hồng. Phản ứng thường xuất hiện sau 2 h đến 4 h. Khuẩn lạc Salmonella điển hình cho phản ứng âm tính, tức là không có sự tạo màu.

8.5.3.4. Môi trường L-lysin khử caboxyl

Cấy ngay dưới bề mặt của môi trường L-lysin khử caboxyl lỏng (B.7). Ủ ở (36 ± 2 ) °C trong (24 ± 3) h. Khuẩn lạc Salmonella điển hình cho màu tím sau khi ủ.

8.5.3.5. Diễn giải phép thử sinh hóa

Nói chung, Salmonella cho các phản ứng được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Các phản ứng sinh hóa của Salmonella

...

...

...

Mục

Phản ứng

Chủng Salmonella cho phản ứng

%^b

TSI glucoza (tạo thành axit)

8.5.3.2

...

...

...

100,0

TSI glucoza (tạo thành khí)

8.5.3.2

+

91,9^c

TSI lactoza

8.5.3.2

-

99,2^d

...

...

...

8.5.3.2

-

99,5

TSI hydro sunfua

8.5.3.2

+

91,6^e

Thủy phân urê

8.5.3.3

...

...

...

99,0

L-lysin khử carboxyl

8.5.3.4

+

94,6^f

^aXem Tài liệu tham khảo [8].

^b Các số liệu này này chỉ ra rằng không phải tất cả các chủng của Salmonella đều cho các phản ứng đánh dấu + hoặc - rõ rệt. Các số liệu này có thể khác nhau về khu vực địa lý và nguồn nước.

^c Salmonella Typhi là loài yếm khí.

^d Loài phụ arizonae Salmonella enterica cho phản ứng lactoza dương tính hoặc âm tính nhưng luôn dương tính với b-galactosidase. Loài phụ diarizonae Salmonella enterica cho phản ứng lactoza âm tính, nhưng cho phản ứng b- galactosidase dương tính. Hơn nữa, có thể các chủng này không tạo ra H₂S. Để nghiên cứu các chủng này, có thể tiến hành thử sinh hóa bổ sung (Tài liệu tham khảo [9][10]).

...

...

...

^f Salmonella Paratyphi A là âm tính.

Các phản ứng sinh hóa trong Bảng 3 là điển hình của Salmonella spp.

Bảng 3 - Phản ứng sinh hóa điển hình của Salmonella spp tới phép thử

Phép thử

Mục

Phản ứng

TSI lactoza

8.5.3.2

-

...

...

...

8.5.3.2

+

TSI sucroza

8.5.3.2

-

TSI hydro sunfua

8.5.3.2

+

Thủy phân ure

...

...

...

-

L-lysin khử cacboxyl

8.5.3.4

+

Phân lập chỉ khác nhau từ các thông số điển hình đã liệt kê trong Bảng 3 bằng một hoặc hai phản ứng có thể vẫn là Salmonella và có thể sẽ được khảo sát tiếp và gửi tới phòng thử nghiệm chuẩn đã được công nhận để khẳng định.

8.5.4. Khẳng định huyết thanh và kiểu huyết thanh

Phản lập Salmonella điển hình theo các phản ứng sinh hóa đã liệt kê trong Bảng 3 là Salmonella spp. giả định và cần được khảo sát tiếp bằng phòng thử nghiệm chuẩn, nếu cần. Sự có mặt của Salmonella và kháng nguyên H, O-, Vi-, được phát hiện bằng sự ngưng kết trên mặt nghiêng như đã quy định trong TCVN 4829 (ISO 6579) với huyết thanh thích hợp, từ các khuẩn lạc nguyên chất (8.5.2) và sau đó loại bỏ các chủng tự ngưng kết.

Phân lập Salmonella cho phản ứng huyết thanh dương tính được khẳng định là Salmonella spp.

9. Biểu thị kết quả

...

...

...

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất thông tin sau:

a) Phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Tất cả thông tin được yêu cầu để nhận dạng đầy đủ mẫu:

c) Kết quả, được biểu thị là Salmonella khẳng định hay giả định được phát hiện hoặc không được phát hiện trong phần mẫu thử V mL nước.

d) Nếu thực hiện quan trắc dịch tễ học, đặc tính kỹ thuật của số khuẩn Iạc được phân lập từ môi trường đặc chọn lọc (8.5.2) và các loại hoặc kiểu huyết thanh được quan sát (8.5.4);

e) Đối với phép thử MPN, ước lượng số Salmonella trên mỗi thể tích mẫu.

11. Đảm bảo chất lượng

Phòng thí nghiệm phải có hệ thống kiểm soát chất lượng xác định rõ ràng để đảm bảo rằng các thiết bị dụng cụ, thuốc thử, và kỹ thuật là phù hợp với phép thử. Sử dụng đối chứng dương, đối chứng âm, và mẫu trắng là một phần của phép thử.

...

...

...

Chủng đối chứng được chọn phải dễ nhận dạng và không phải là chủng được phân lập thường xuyên bằng phép thử trong phòng thí nghiệm. Nên tham khảo phòng thí nghiệm chuẩn quốc gia thích hợp.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỬ

Hình A.1

PHỤ LỤC B

...

...

...

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THUỐC THỬ

Như một cách chuẩn bị thay thế đã quy định trong phụ lục này, có thể sử dụng chất pha loãng hoặc môi trường đã loại nước hoàn toàn. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Để chuẩn bị môi trường, sử dụng nước (7.2) không chứa chất ảnh hưởng đến phát triển của các loài vi sinh vật dưới các điều kiện thử.

B.1. Môi trường đệm nước pepton (BPW)

Nồng độ

Nồng độ gấp đôi

Men tiêu hóa của casein

10,0 g

...

...

...

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

10,0 g

Dinatri hydrophosphat ngậm mười hai phân tử nước (Na₂HPO₄.12H₂O)^a

9,0 g

18,0 g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

1,5 g

3,0 g

...

...

...

1 000 mL

1 000 mL

^a Nếu sử dụng dinatri hydrophosphat khan (Na₂HPO₄), thì phải thêm 3,5 g đối với BPW nồng độ và 7,0 g BPW nồng độ gấp đôi.

Hòa tan các thành phần trong nước, nếu cần, đun nóng (mà không đun sôi).

Điều chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử khuẩn pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân chia môi trường vào các bình có dung tích thích hợp để thu được các phần cần cho thử nghiệm.

Khử khuẩn 15 min trong nồi hấp (5.2) đặt ở (121 ± 3) °C.

Bảo quản khoảng 3 tháng ở (5 ± 3) °C.

B.2. Canh rappaport-vassiliadis với đậu tương (RVs)

...

...

...

Men tiêu hóa của đậu tương

5,0 g

Natri clorua (NaCI)

8,0 g

Kali dihydrrophosphat (KH₂PO₄)

1,4 g

Dikali hydrophosphat (K₂HPO₄)

0,2 g

Nước (7.2)

...

...

...

Hòa tan các thành phần trong nước, nếu cần, đun nóng tới khoảng 70 °C.

Chuẩn bị dung dịch này trong cùng ngày chuẩn bị môi trường RVs.

B.2.2. Dung dịch B

Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI₂.6H₂O)

400 g

Nước (7.2)

1 000 mL

Hòa tan magie clorua trong nước.

Ngược lại với sự chuẩn bị các dung dịch thuốc thử thường dùng, nhưng theo công thức nguyên bản của Tài liệu tham khảo [5][6], thêm các chất vào thể tích nước đã định để có dung dịch với tổng thể tích là 1,26 L.

...

...

...

Dung dịch này bền trong khoảng 2 năm, nếu được bảo quản trong chai thủy tinh tối màu đậy kín ở nhiệt độ phòng.

B.2.3. Dung dịch C

Oxalat xanh malachit

0,4 g

Nước (7.2)

100 mL

Hòa tan oxalat xanh malachit trong nước.

Dung dịch bền trong 8 tháng nếu được bảo quản trong chai thủy tinh tối màu ở nhiệt độ phòng.

B.2.4. Môi trường hoàn chỉnh

...

...

...

1 000 mL

Dung dịch B (B.2.2)

100 mL

Dung dịch C (B.2.3)

10 mL

Cho 100 mL dung dịch B và 10 mL dung dịch C (thể tích tổng số là 1 110 mL) vào 1 000 mL môi trường cơ bản (dung dịch A).

Điều chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử khuẩn pH là 5,2 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân chia vào các ống nghiệm với định lượng 10 mL hoặc vào bình với định lượng 100 mL.

Khử khuẩn 15 min trong nồi hấp (5.2) ở (115 ± 3) °C.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Thành phần môi trường cuối cùng (thể tích tổng là 1 110 mL) là: 4,5 g/L enzym phân hủy của đậu tương; 7,2 g/L natri clorua (NaCI); 1,44 g/L kali dihydrophosphat (KH₂PO₄) + dikali hydrophosphat (K₂HPO₄); 28,6 g/L magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI₂.6H₂O); 0,036 g/L oxalat xanh malachit.

Khối lượng của 28,6 g MgCI₂.6H₂O tương ứng với 13,4 g MgCI₂ (khan).

B.3. Thạch lysin xyloza deoxycholat (thạch XLD)

D(+)-Xyloza

3,75 g

L(+)-Lysin hydroclorua

5,0 g

Natri deoxycholat

1,0 g

...

...

...

3,0 g

Sucroza

7,5 g

Lactoza

7,5 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Natri thiosunfat (Na₂S₂O₃)

6,8 g

...

...

...

0,8 g

Phenol đỏ

0,08 g

Thạch

9 g đến 18 g

Nước (7.2)

1 000 mL

^a Phụ thuộc vào tính đông của thạch

...

...

...

Làm mát ngay trong bể điều nhiệt tới 45 °C đến 50 °C. Đun quá mức hoặc làm mát kéo dài có thể tạo ra kết tủa.

Điều chỉnh pH. nếu cần, sao cho pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C.

Rót môi trường vào trong đĩa Petri và bảo quản môi trường đã làm mát trong túi nhựa được làm kín tới 2 tuần ở (5 ± 3) °C. Nếu cần, làm khô đĩa trước khi sử dụng.

B.4. Thạch dinh dưỡng

Cao thịt

3,0 g

Men tiêu hóa pepton

5,0 g

Thạch

...

...

...

Nước (7.2)

1 000 mL

* Phụ thuộc vào tính đông của thạch

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi.

Điều chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử khuẩn pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

Chuyển môi trường nuôi cấy vào trong ống hoặc chai có dung tích thích hợp.

Khử khuẩn 15 min trong nồi hấp (5.2) ở (121 ± 3) °C.

Chuyển khoảng 15 mL môi trường tan chảy vào đĩa Petri vô khuẩn.

...

...

...

Có thể sử dụng môi trường thạch không chọn Iọc thích hợp khác để thay thế.

B.5. Thạch triple sugar và iron (thạch TSI)

Cao thịt

3,0 g

Cao nấm men

3,0 g

Men tiêu hóa pepton

20,0 g

Natri clorua (NaCI)

...

...

...

Lactoza

10,0 g

Sucroza

10,0 g

Glucoza

1,0 g

Sắt (III) citrat

0,3 g

Natri thiosunfat (Na₂S₂O₃)

...

...

...

Phenol đỏ

0,024 g

Thạch

9 g đến 18 g

Nước (7.2)

1 000 mL

^a Phụ thuộc vào tính đông của thạch

Hòa tan các thành phần trong nước, nếu cần bằng cách đun nóng.

...

...

...

Phân chia môi trường với định lượng 10 mL vào trong các ống nghiệm, tốt nhất là có nút vặn.

Khử khuẩn 15 min trong nồi hấp (5.2) ở (121 ± 3) °C. Đặt ở vị trí nghiêng để bề dày thạch trên đáy từ 25 mm đến 50 mm.

Bảo quản các ống nghiệm khoảng 1 tháng ở (5 ± 3) °C.

B.6. Thạch urê (Christensen)

B.6.1. Môi trường cơ bản

Men tiêu hóa pepton

1,0 g

Glucoza

1,0 g

...

...

...

5,0 g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

2,0 g

Phenol đỏ

0,012 g

Thạch

9 g đến 18 g

Nước (7.2)

1 000 mL

...

...

...

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, nếu cần, đun nóng.

Điều chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử khuẩn pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C.

Khử khuẩn 15 min trong nồi hấp (5.2) ở (121 ± 3) °C. Sau khi hấp, làm mát trong bồn nước tới khoảng 50 °C. Bảo quản 1 tháng ở (5± 3) °C.

B.6.2. Dung dịch urê

Urê

400 g

Nước (7.2) vừa đủ

1 000 mL

...

...

...

B.6.3. Môi trường hoàn chỉnh

Môi trường cơ bản (B.6.1)

950 mL

Dung dịch urê (B.6.2)

50 mL

Ở điều kiện vô khuẩn, cho dung dịch urê vào môi trường cơ bản, làm tan chảy trước và sau đó để nguội đến nhiệt độ (45 ± 1) °C.

Điều chỉnh pH, nếu cần, sao cho pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân chia môi trường hoàn chỉnh vào trong ống nghiệm vô khuẩn với định lượng 10 mL.

Đặt nghiêng ống nghiệm.

...

...

...

B.7. Môi trường L-Lyzin đã khử nhóm cacboxyl

L-Lyzin monohydroclorua

5,0 g

Cao nấm men

3,0 g

Glucoza

1,0 g

Bromocresol đỏ tía

0,015 g

...

...

...

1 000 mL

Hòa tan các thành phần trong nước, nếu cần, đun nóng.

Điều chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử khuẩn pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân chia môi trường với định lượng 2 mL đến 5 mL vào trong, ống cấy hẹp vô khuẩn, tốt nhất là có nắp vặn.

Khử khuẩn 15 min trong nồi hấp (5.2) ở (121 ± 3) °C. Bảo quản trong ống nghiệm khoảng 3 tháng ở (5 ± 3) °C.

B.8. Canh selenit cystine

Trypton

5,0 g

Lactoza

...

...

...

Dinatri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

10,0 g

L-Cystin

0,01 g

Natri biselenit (NaHSeO₃)

4,0 g

Nước (7.2)

1 000 mL

Hòa tan 4 g natri biselenit trong 1 000 mL nước và sau đó thêm thành phần duy trì.

...

...

...

Khử khuẩn bằng cách đặt trong buồng hơi nước chảy tự do trong 15 min.

CẢNH BÁO - Không hấp.

Bảo quản môi trường đã chuẩn bị ở (5 ± 3) °C tránh ánh sáng.

CHÚ Ý - Tài liệu tham khảo [7] báo cáo sẩy thai và có thể ảnh hưởng gây quái thai lên người có thai làm việc trong phòng thí nghiệm do có thể nuốt phải natri biselenit. Để giảm thiểu rủi ro ảnh hưởng gây quái thai tới người làm việc trong phòng thí nghiệm, không thêm natri biselenit dạng bột khô nhưng nên chuẩn bị riêng rẽ như dạng dung dịch để duy trì thành phần được thêm.

B.9. Canh muller-kauffmann tetrathionat-novobiocin (MKTTn)

B.9.1 Môi trường cơ bản

Men tiêu hóa cao thịt

4,3 g

Men tiêu hóa casein

...

...

...

Natri clorua (NaCI)

2,6 g

Canxi cacbonat (CaCO₃)

38,7 g

Natri thiosunfat ngậm năm phân tử nước (Na₂S₂O₃.5H₂O)

47,8 g

Mật bò để vi khuẩn sử dụng

4,78 g

Briliiant xanh

...

...

...

Nước (7.2)

1 000 mL

Hòa tan thành phần cơ bản đã sấy khô hoặc môi trường hoàn chỉnh đã sấy khô vào trong nước bằng cách đun sôi trong 5 min.

Điều chỉnh pH, nếu cần, sao cho pH là 8,2 ± 0,2 ở 25 °C.

Trộn kỹ môi trường vô khuẩn và phân chia vào trong các ống nghiệm vô khuẩn có dung tích 10 mL.

Môi trường cơ bản có thể được bảo quản khoảng 4 tuần ở (5 ± 3) °C.

B.9.2. Dung dịch iot và iodua

lot (l₂)

20,0 g

...

...

...

25,0 g

Nước (7.2)

100 mL

Hòa tan hoàn toàn kali iodua trong 10 mL nước, sau đó thêm iot và pha loãng tới 100 mL bằng nước. Không đun nóng.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong tối ở nhiệt độ xung quanh trong bình chứa được đóng kín.

B.9.3. Dung dịch novobiocin

Muối natri novobiocin

0,04 g

Nước (7.2)

...

...

...

Hòa tan muối natri novobiocin trong nước và lọc để khử khuẩn.

Bảo quản tới khoảng 4 tuần ở (3 ± 2) °C.

B.9.4. Môi trường hoàn chỉnh

Môi trường cơ bản (B.9.1)

1 000 mL

Dung dịch iot-iodua (B.9.2)

20 mL

Dung dịch novobiocin (B.9.3)

5 mL

...

...

...

Phân chia môi trường vô khuẩn theo định lượng 10 mL vào trong bình chứa vô khuẩn.

Sử dụng môi trường hoàn chỉnh trong ngày chuẩn bị.

B.10. Chất trợ lọc

Điatomit

1 g

Nước (7.2)

15 mL

Cân lượng thích hợp điatomit vào chai phù hợp và thêm nước.

Khử khuẩn 15 min trong nồi hấp (5.2) ở (121 ± 3) °C.

...

...

...

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

KẾT QUẢ THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

C.1. Giới thiệu

Phép thử liên phòng thử nghiệm quốc tế được tổ chức với 26 phòng thí nghiệm từ bảy nước tham gia nghiên cứu. Đĩa Lenticule chứa tổ hợp Salmonella Gold Coast và các sinh vật nền khác nhau (Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Enterococcus faecalis, Citrobacter spp. và Acinetobacter baumanil) phòng thí nghiệm kiểm soát chất lượng nước của các tổ chức bảo vệ sức khỏe, Newcastle- upon-Tyne, UK chuẩn bị (xem Bảng C.1), cùng đối chứng âm (mẫu trắng), được gửi tới các phòng thí nghiệm thành viên và được thử ở hai mức nồng độ khác nhau.

Các phòng thí nghiệm được gửi hai bộ của năm đĩa Lenticule khác nhau đã mã hóa từ A đến E và được đề nghị thử một trong mỗi bộ ở các ngày riêng biệt để thu được số liệu có độ tái lập trong các phòng thí nghiệm. Các đĩa Lenticule được hòa tan trong 1 000 mL nước và năm mẫu thử 100 mL sau đó được đánh giá cho sự có mặt của Salmonella. Các mẫu thử có Salmonella được phát hiện sau đó được pha loãng thêm (1->5) và kiểm tra mỗi phần thử.

Phương pháp quy định sử dụng hai môi trường chọn lọc khác nhau với kể cả XLD và một môi trường phù hợp khác. Các thành viên tham gia được yêu cầu ghi lại chi tiết về môi trường, nhà sản xuất, mẻ và ngày hết hạn của môi trường sử dụng.

Các kết quả được ghi là "phát hiện được” hoặc “không phát hiện được” và các bảng số liệu đầy đủ được gửi trở lại phòng thí nghiệm tổ chức.

...

...

...

Các đĩa Lenticule[1]^) được thiết kế để chứa khoảng 100 đơn vị khuẩn lạc (cfu) khi được hoàn nguyên trong 1 000 mL nước cho ra khoảng 10 cfu trên 100 mL như mẫu thử. Khi được pha loãng (1 —>5), thì cho khoảng 2 cfu trên 100 mL. Nếu tế bào trong mẫu tuân theo phân phối Poisson, thì có khả năng rằng trong 100 mL mẫu không chứa bất cứ một tế bào nào là rất nhỏ (1/220 26) và xác suất mẫu chứa ít nhất một tế bào là rất cao (p = 0,999 95). Xác suất này của một kết quả dương tính, trong mỗi mẫu của năm mẫu lặp lại, giá trị kết quả dương tính trung bình sẽ là 4,999 77 với độ lệch chuẩn, s, là 0,015 066. Tỷ lệ phát hiện 100 % sẽ cho ra năm kết quả không năm trong năm kết quả dương tính của mỗi phòng thí nghiệm.

Trong trường hợp các mẫu phụ được pha loãng, xác suất mà mẫu chứa ít nhất một tế bào vi khuẩn là khoảng 86 % (p =0,864 66). Mỗi mẫu của 10 phép thử lặp lại thành công với xác suất này. Nếu nghi ngờ số dương tính đúng theo sự phân phối nhị thức có thông số n = 10 và p = 0,865, thì số dương tính trung bình qua 10 phép thử sẽ là 8,646 65 với s =1,081 76. Tuy nhiên, phép thử ngẫu nhiên của đĩa Lenticule^1) được chỉ thị phép đếm tế bào đúng giữa 130 cfu/đĩa đến 200 cfu/đĩa. Do đó, giá trị Poisson coi như ở giữa 10 cfu/100 mL đến 20 cfu/100 mL trong mẫu không được pha loãng, và 2 cfu/100 mL và 4 cfu/100 mL cho các mẫu phụ đã pha loãng khi phân tích số liệu sử dụng hồi quy logictic [SAS 8.2^1)].

Các kết quả được ghi là “được phát hiện" hoặc “không được phát hiện" và các dãy số liệu đầy đủ được quay trở lại phòng thí nghiệm.

Bảng C.1 - Thành phần mẫu

Mẫu

[Bộ đĩa Lenticule]

Sinh vật

Mục tiêu

cfu/đĩa

...

...

...

E. coli

100

A

K. aerogenes

1 000

E. faecalis

1 000

...

...

...

1 000

B

Salmonella Gold Coast

10

Salmonella Gold Coast

10

C

E. coli

...

...

...

K. aerogenes

1 000

E. faecalis

1 000

D

Mẫu trắng

...

...

...

Salmonella Gold Coast

10

E. coli

100

E

K. aerogenes

1 000

...

...

...

1 000

A. baumanii

1 000

C.2.1. Kết quả

Các kết quả nhận được từ 26 phòng thí nghiệm tham gia và kết quả được tóm tắt trong Bảng C.2 và C.3.

Bảng C.2 - Tổng các kết quả đối với mẫu không pha loãng

Thông số

Mẫu trắng

...

...

...

Chỉ có Salmonella Gold Coast

Salmonella Gold Coast và sinh vật nền

Số phòng thí nghiệm gửi kết quả

26

26

26

26

Tổng số kết quả

245

...

...

...

246

611

Số kết quả loại trừ

5

0

0

15

Số kết quả chấp nhận

240

...

...

...

246

596

Bảng C.3 - Tổng các kết quả đối với mẫu pha loãng

Thông số

Chỉ có Salmonella Gold Coast

Salmonella Gold Coast và sinh vật nền

Số phòng thí nghiệm gửi kết quả

26

26

...

...

...

485

935

Số kết quả loại trừ

0

30

Số kết quả chấp nhận

485

905

Hồi quy Logistic [SAS 8.2] cho thấy không có không có chênh lệch đáng kể giữa mẫu chứa Salmonella (p =0,98) hoặc giữa các ngày (p = 0,83) đối với mẫu pha loãng. Có rất ít biến động trong kết quả từ mẫu không pha loãng (p = 0,98) và không có sự khác nhau giữa mẫu thử B, C và E hoặc giữa A và D. Do vậy, số liệu được tổng hợp toàn bộ các phòng thí nghiệm, mẫu thử, và ngày thử. Tất cả các số liệu gửi về từ một phòng thí nghiệm (phòng thí nghiệm 14) đã được loại trừ, khi có bằng chứng rõ ràng của các vấn đề kỹ thuật trong phòng thí nghiệm này. Các phân tích thống kê cũng loại trừ các số liệu trong trường hợp dán nhãn sai hoặc lỗi ghi chép. Xem Bảng C.4.

...

...

...

Mẫu

Sinh vật

Số dương tính/số kết quả

Dương tính

%

A1

E. coli, K. aerogenes

0/130

0

...

...

...

E. faecalis, Citrobacter spp.

0/130

0

B1

Salmonella Gold Coast

130/130

100

B1 đã pha loãng 1->5

236/250

...

...

...

B2

126/126

100

B2 đã pha loãng 1->5

252/255

98,9

C1

Salmonella Gold Coast, E. coli

129/130

...

...

...

C1 đã pha loãng 1->5

243/250

97,2

C2

K. aerogenes, E. faecalis

126/126

100

C2 đã pha loãng 1->5

236/240

...

...

...

D1

Mẫu trắng

0/130

0

D2

0/125

0

E1P

Salmonella Gold Coast, E. coli

...

...

...

98,5

E1P đã pha loãng 1->5

236/240

98,3

E2P

K. aerogenes, E. faecalis A. baumanii

120/121

99,2

E2P đã pha loãng 1->5

...

...

...

97,6

Phương pháp quy định sử dụng hai môi trường đặc chọn lọc với bao gồm cả thạch XLD và môi trường phù hợp khác, do phòng thí nghiệm quyết định. Môi trường thứ cấp khác nhau được sử dụng được tóm tắt trong Bảng C.5.

Bảng C.5 - Môi trường thứ cấp

Môi trường

Số phòng thí nghiệm

Thạch Brilliant xanh (BGA)

8

Đĩa Salmonella AES (ASAP)

2

...

...

...

10

Thạch sucrose lacto phenol đỏ brilliant xanh (BPLS)

2

Phát hiện Salmonella và môi trường nhận dạng (SMID)

2

Môi trường Ônoz

2

C.2.2. Mẫu không pha loãng A1 đến E1

Mỗi một đĩa Lenticule, thực hiện phép thử lặp lại 130. Số lượng tổng số của các kết quả chắc chắn là 763 trong 759 là dương tính (Bảng C.3). Số lượng được chấp nhận là 762,965 có độ lệch chuẩn là 0,186. Điều này gợi ý rằng hoặc tốc độ phát hiện là thấp hơn 100 % hoặc phân phối nhị thức bị quá phân tán. Khi xuất hiện số lượng tế bào > 10 trên đĩa (disc), sự quá phân tán gần như có khả năng giải thích kết quả, và không được chấp nhận trong xem xét vi sinh vật.

...

...

...

1 480 phép thử chắc chắn đã thực hiện, 1 442 là dương tính. Giả thiết đếm trung bình 2 cfu và tốc độ phát hiện 100 %, số lượng dương tính được chấp nhận là 1 279,6 (s =5,52). Khoảng thời gian dung sai 99 % từ 1 254 đến 1 304 kết quả dương tính. Các kết quả chỉ ra số lượng trung bình của cfu trên mẫu phụ > 2. Số lượng kết quả dương tính cao chỉ thị rằng phân phối nhị thức phân tán, nhưng càng có nhiều khả năng rằng đếm tế bào trung bình cao hơn đã dự đoán.

C.2.4. Độ nhạy và độ đặc hiệu

Đối với mẫu thử không pha loãng, khoảng dung sai 99 % được giới hạn tới k = 763. Do đó, số lượng tổng số của dương tính đúng từ mẫu không pha loãng là 763 và số lượng âm tính giả là bốn. Từ các phần thử pha loãng, số lượng tổng số dương tính thu được và “tiêu chuẩn vàng” của các phòng thí nghiệm tương ứng được đếm như dương tính đúng. Do đó, có 1,442 dương tính đúng và ba âm tính giả. Số lượng âm tính đúng là 130 và không có dương tính giả được báo cáo. Do đó, độ nhạy của phương pháp đối với mẫu nguyên chất là 0,995 và đối với mẫu phụ đã pha loãng là 0,998; độ đặc hiệu vì thế gần tới 100 %.

C.2.5. Kết luận

Các kết quả từ 26 phòng thí nghiệm tham gia cho thấy tính đồng nhất đáng kể, ngoại trừ dán nhãn sai trong một phòng thí nghiệm và các vấn đề về thao tác trong phòng thí nghiệm thứ hai. Không quan sát có sự khác biệt giữa việc sử dụng môi trường khác nhau (Bảng C.5) hoặc giữa mẫu được thử trong các ngày khác nhau. Thiếu các kết quả dương tính giả chỉ ra rằng phương pháp rất đặc thù và cho độ nhạy đủ để phát hiện số lượng vi khuẩn rất thấp thậm chí trong trường hợp các sinh vật nền ở mức cao. Phương pháp này được sử dụng thành công để phát hiện Salmonella từ mẫu nước sông đã nhiễm nước thải qua thời gian một tháng với chủng Salmonella trong phạm vi rộng được phát hiện (Bảng C.6).

Bảng C.6 - Các chủng Salmonella từ mẫu nước sông nhiễm bẩn tự nhiên được phân lập bởi phòng thí nghiệm tham gia sử dụng phương pháp này (2005)

Chủng Salmonella

Số phân lập

Salmonella Typhimurium

...

...

...

Salmonella Enteritidis

2

Salmonella Kentucky

1

Salmonella Kottbus

4

Salmonella Newport

4

Salmonella Chester

...

...

...

Salmonella Fresno

1

Salmonella Colindale

1

Salmonella Agone

4

Salmonella Virchow

3

Salmonella Falkensee

...

...

...

Salmonella Virginia

3

Salmonella Oakland

2

Salmonella Adane

1

Salmonella Muenchen

1

Salmonella Weltevreden

...

...

...

Salmonella Derby

1

Salmonella Bareilly

1

Salmonella Mbandka

2

Salmonella Saint-Paul

1

Salmonella Thompson

...

...

...

Salmonella Stanley

1

Salmonella Oranienburg

1

Salmonella Braenderup

1

Salmonella Unnamed

6

...

...

...

[1] TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

[2] TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm.

[3] TCVN 8128-2 (ISO/TS 11133-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 2: Các hướng dẫn thực hành về thử nghiệm hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

[4] ISO/TR 13843:2000, Water Quality - Guidance on validation of microbiological methods.

[5] PETERZ, . WIBERG, C., NORBERG, P. J. Appl. Bacteriol. 1989, 66, pp. 523-528

[6] VASSILIADIS, P. J. Appl. Bacteriol. 1983, 54, pp. 69-76

[7] ROBERTSON, D.S.F. Selenium — A possible teratogen? Lancet 1970-03-07, i (7645), pp. 518-519

[8] EWING, W.H., BALL, M.M. The biochemical reactions of the genus Salmonella. Atlanta, GA: National Communicable Disease Center, 1966

[9] MURRAY, P.R., BARON, E.J., editors. Manual of clinical microbiology, 9th edition, 2 vols. Washington, DC: American Society of Microbiology, 2007

...

...

...

[1] Sản phẩm có bán sẵn. Thông tin này được nêu ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không bắt buộc bởi sản phẩm quy định trong tiêu chuẩn.