Gen đích
|
Mồi
|
Trình tự
5’-3’
|
Msp1b
|
Mồi xuôi (forward primer)
|
TTGGCAAGGCAGCAGCTT
|
Mồi ngược (reverse primer)
|
TTCCGCGAGCATGTGCAT
|
Mẫu dò
|
6 FAM -
TCGGTCTAACATCTCCAGGCTTTCAT - BHQ1
|
Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:
- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi
và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.3) ở gia
tốc 6 000 g trong 30 s để mồi và mẫu dò lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn
nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi, mẫu
dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc
và mẫu dò gốc;
- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM, pha loãng mồi gốc
bằng nước (3.2.4) (20 ml
mồi gốc và 80 ml nước);
- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10
mM, pha loãng
mẫu dò gốc bằng nước
(3.2.4) (10 ml mẫu dò gốc
và 90 ml nước).
6.2.4.3. Tiến hành
phản ứng
Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được
chuẩn bị (6.2.4.2).
Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của QuantiTect Probe
PCR, Qiagen (Cat No. 204341) 2)
Thành phần cho một phản ứng được nêu
trong Bảng 2.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thành phần
Thể tích
ml
QuantiTect Probe PCR master mix
12
Mồi xuôi, 20 mM
1
Mồi ngược, 20 mM
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5
Nước tinh khiết không có nuclease
5,5
Tổng thể
tích
20
Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen
vào mỗi ống phản ứng:
- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ADN có giá trị
chu kì ngưỡng (Ct) đã biết trước vào ống phản ứng;
- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước (3.2.4) vào
ống phản ứng;
- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ADN bệnh phẩm (6.2.4.1)
vào ống phản ứng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu bệnh
phẩm, mẫu kiểm
chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;
- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong
khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
Tiến hành phản ứng Realtime PCR bằng
máy nhân gen (Realtime PCR) (4.3.2) đã được cài đặt chu trình nhiệt
được nêu trong
Bảng
3.
Bảng 3 - Chu
trình nhiệt của phản ứng
realtime PCR
Nhiệt độ
Thời gian
Số chu kỳ
95 °C
10 min
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95 °C
45 s
45
60 °C
1 min
6.2.5. Đọc kết quả
Đọc kết quả bằng máy nhân gen
(realtime PCR) (4.3.2) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm
máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt
qua cường độ huỳnh quang nền);
Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu
kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước, mẫu kiểm
chứng âm tính không có Ct;
Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị
Ct ≤ 35 được coi
là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi
là nghi ngờ;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.3. Phương pháp
ELISA phát hiện kháng thể biên trùng
6.3.1. Lấy mẫu
Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 20G
(hoặc 18G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch
đuôi của trâu bò nghi mắc bệnh biên trùng. Sau khi lấy, rút
pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi
ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống
nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2
h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.
6.3.2. Bảo quản mẫu
Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo
quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong
vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly
tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh
âm sâu (4.1.1).
6.3.3. Chuẩn bị mẫu
Chắt huyết thanh từ xylanh (6.3.1)
sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá
24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.
6.3.4. Cách tiến
hành
VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể biên
trùng ở trâu bò của hãng SVANOVA3).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Dung dịch đệm: pha loãng PBS-Tween
20 X với nước cất theo tỷ lệ 1/20 (cho
25 ml dung dịch PBS-Tween 20 X vào 475 ml nước cất), lắc đều. Bảo quản dung
dịch đệm ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C;
- Dung dịch kháng kháng thể bò: pha
loãng kháng kháng thể bò với 11,5 ml dung dịch đệm (pha xong dùng ngay).
Sau khi pha loãng bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Dung dịch kháng
kháng thể bò đông
tan
tối đa 3 lần;
- Pha loãng mẫu kiểm chứng (âm, dương)
và mẫu bệnh phẩm (6.3.3) với
dung dịch đệm theo tỷ lệ 1/40 (cho 10 ml mẫu kiểm
chứng hoặc mẫu bệnh phẩm vào 390 ml dung dịch đệm).
6.3.4.2. Tiến hành
phản ứng
- Các thuốc thử để ở nhiệt độ phòng từ
18 °C đến 25 °C trước khi sử
dụng;
- Nhỏ 100 ml mẫu kiểm chứng (âm,
dương) đã pha loãng (6.3.4.1) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện
trên 2 giếng, vị trí của mẫu kiểm chứng
đã được đánh dấu trong đĩa);
- Nhỏ 100 ml mẫu bệnh phẩm đã
pha loãng (6.3.4.1) vào giếng được chọn (mỗi mẫu có thể làm 1 giếng hoặc 2
giếng, tuy nhiên trong trường hợp xác định lại mỗi mẫu nên làm 2 giếng);
- Phủ kín đĩa và ủ ở tủ ấm 37 °C (4.4.1)
trong vòng 30 min;
- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm
(6.3.4.1);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Phủ kín đĩa ủ ở tủ ấm 37
°C (4.4.1)
trong 30 min;
- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm;
- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất vào mỗi
giếng;
- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng từ
18 °C đến 25 °C trong 30
min;
- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản
ứng vào mỗi giếng;
- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng từ
18 °C đến 25 °C trong 30
min;
- Đọc đĩa ở bước sóng 405 nm bằng máy
đọc ELISA (4.4.2) trong vòng 15 min.
6.3.5. Đọc kết quả
- Tính giá trị mật độ quang
học (OD) của mẫu kiểm chứng âm, mẫu kiểm chứng dương và mẫu bệnh phẩm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
PP =
OD mẫu bệnh
phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm
x 100
OD mẫu kiểm
chứng dương
- Giá trị mẫu kiểm chứng nằm trong
khoảng giới hạn sau:
1) OD của mẫu kiểm chứng dương: lớn hơn khoảng
giá trị từ 0,9 đến 2,3;
2) PP của
mẫu kiểm chứng âm: nhỏ hơn 20.
- Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh
phẩm:
1) PP nhỏ hơn 25: mẫu âm tính;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Kít phát hiện kháng thể
biên trùng không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng
thể do tiêm vắc xin.
6.4. Phương pháp
CAT phát hiện kháng thể biên trùng
6.4.1. Lấy mẫu
Xem 6.3.1.
6.4.2. Bảo quản mẫu
Xem 6.3.2.
6.4.3. Chuẩn bị mẫu
Xem 6.3.3.
6.4.4. Cách tiến
hành
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Gây nhiễm qua đường tĩnh mạch bằng máu
có chứa Anaplasma spp. vào con bê cắt lách. Lấy máu của con
vật kiểm tra, nếu 50% máu con vật nhiễm Anaplasma spp. thì đem rửa, ly
giải và ly tâm (4.3.1) để thu hồi Anaplasma spp. ở dạng viên. Phần kháng
nguyên dạng viên sau khi đánh tan, rửa và cho vào dung dịch thuốc nhuộm để tạo
huyễn dịch kháng nguyên cuối cùng.
6.4.4.2. Tiến hành
phản ứng
- Các thuốc thử để ở nhiệt độ từ 25 °C đến 26 °C trước khi sử
dụng;
- Trên mỗi vòng tròn của bản nhựa: nhỏ 10 ml huyết thanh bò
không bị nhiễm Anaplsama (nồng độ conglutinin cao), 10 ml mẫu bệnh phẩm
(6.4.3) và 5 ml kháng
nguyên (6.4.4.1). Mẫu kiểm chứng
âm
và
dương cũng được thực hiện trên mỗi bản nhựa.
- Trộn các thành phần đã cho vào vòng
tròn bản nhựa bằng đũa thủy tinh. Sau khi trộn mỗi phản ứng, rửa sạch đũa
thủy tinh để tránh tạp sang mẫu khác;
- Đặt bản nhựa kiểm tra trên máy lắc
(4.5) với tốc độ từ 100 r/min đến 110 r/min trong 7 min.
6.4.5. Đọc kết quả
- Nếu phát hiện đám kết tủa: mẫu dương
tính;
- Nếu không có đám kết tủa: mẫu âm
tính.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7. Kết luận
Trâu bò được kết luận là mắc bệnh biên
trùng khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của
bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính bằng một
trong những phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.
Phụ lục A
(Quy định)
Thành phần và chuẩn bị thuốc thử cho phương
pháp nhuộm Giemsa
A.1. Dung dịch
muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0
A.1.1. Thành phần
Natri hydrophosphat (Na2HPO4) 9,47 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước cất 900 ml
A.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan natri hydrophosphat và kali
dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương
mại và chuẩn bị theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.2. Dung dịch
Giemsa,
10 %
Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen
blue) 1 phần
Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,0 (A.1) 9 phần
CHÚ THÍCH: Nồng độ dung dịch Giemsa có
thể thay đổi theo các
phòng thí nghiệm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(Tham khảo)
Quy trình tách chiết ADN
CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử
dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng
gây hại nếu
thao
tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi
của các hóa chất này.
Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao
tác này.
Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít
DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) như sau:
B.1. Pha dung dịch
- Dung dịch AW 1 (Wash buffer 1): thêm
125 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;
- Dung dịch AW 2 (Wash buffer 2): thêm
160 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 66 ml dung dịch
AW2 đậm đặc.
B.2. Cách tiến
hành
- Bước 1: nhỏ 20 ml proteinase K vào
ống 1,5 ml; nhỏ thêm 100 ml mẫu máu
(6.2,3); và thêm dung dịch PBS để được thể tích 220 ml. Tiến hành tiếp
bước 2;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Bước 3: nhỏ 200 ml etanol từ 96
% đến 100 % (thể tích)
(3.2.5) vào ống, trộn đều
bằng máy lắc trộn
vortex
(4.1.3).
- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch
trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g
bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại bỏ ống thu;
- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu
mới; nhỏ 500 ml dung dịch
AW 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại bỏ
ống thu;
- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu
mới; nhỏ 500 ml dung dịch
AW 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 3 min,
loại bỏ ống thu;
- Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5
ml hoặc 2 ml
sạch;
- Bước 8: nhỏ 50 ml dung dịch AE
(Elution buffer) vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C);
ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong
1 min
- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5
ml hoặc 2 ml có chứa ADN;
Bảo quản ADN ở tủ lạnh (4.1.2)
nếu thực hiện phản ứng realtime PCR ngay hoặc ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu
thực hiện phản ứng realtime PCR sau 24 h.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1] Carelli G., Decaro N., Lorusso A.,
Elia G., Lorusso E., Mari V., Ceci L and Buonavoglia C. (2007). Detection
and quantification of
Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR. Vet.
Microbiol., 124, 107-114.
[2] A. marginale Antibody Test.
Available at: http://www.svanova.com/content/dam/internet/ah/svanova/dk_EN/documents/Kit%20inserts/lnsert%20A%20marginale%2019-2960-00_04.pdf.
[3] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996, Giáo
trình ký sinh trùng thú y. NXB Đại học Nông nghiệp I, 243-244.
[4] Reinbold J.B., Coetzee J.F.,
Sirigireddy K.R & Ganta R.R (2010). Detection of Anaplasma marginale and
A. phagocytophilumin bovine peripheral blood samples by duplex real-time
reverse transcriptase PCR assay. J.CIin. Microbiol., 48, 2424-2432.
1) Thông tin này đưa ra
tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng
tiêu chuẩn và không ấn định sử
dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể
sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
2) Thông tin
này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử
dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng
các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. Tuy nhiên, thành phần và thể
tích của phản ứng
realtime PCR có thể thay đổi phù hợp với từng phòng thí nghiệm
3) Thông tin này đưa ra
tạo điều kiện thuận tiện cho người
sử dụng tiêu chuẩn và không ấn
định sử dụng sản phẩm của nhà cung
cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.