Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-33:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò

• Số hiệu: TCVN8400-33:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

Bệnh	Biểu hiện
Biên trùng	Triệu chứng và bệnh tích nhẹ hơn bệnh lê dạng trùng. Nước tiểu không có màu đỏ.
Tiên mao trùng (Trypanosomosis)	Con vật sốt cao, theo chu kỳ.
Theileriosis	Hạch, lách sưng to.
Eperythrozoonosis	Máu khó đông. Gan và các cơ quan nội tạng màu vàng.
Nhiệt thán	Nước tiểu có màu đỏ nhưng để lâu thì lắng cặn. Bệnh lê dạng trùng: nước tiểu có màu đỏ nhưng để lâu không lắng cặn.
Niệu huyết	Gan hoại tử.

6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp nhuộm Giemsa kiểm tra hình thái lê dạng trùng

6.1.1. Lấy mẫu

Dùng xylanh 5 ml và kim tiêm 20 G (hoặc 18 G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi ngờ bệnh cho vào ống có chất chống đông (EDTA, natri xitrat hoặc heparin), ghi ký hiệu mẫu lên thành ống.

CHÚ THÍCH: Đồng thời Kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.1.2. Bảo quản mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay mẫu máu chống đông, bảo quản trong tủ lạnh (4.1.2).

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phẩm là mẫu máu (6.1.1).

...

...

...

6.1.4.1. Chuẩn bị tiêu bản

- Nhỏ 1 giọt máu (6.1.1) (tương đương từ 5 ml đến 10 ml) lên một dầu của phiến kính (4.2.1);

- Dàn mỏng giọt máu bằng lamen (4.2.2) hoặc một phiến kính khác (4.2.1);

- Tiêu bản để khô tự nhiên sau đó cố định bằng cách nhỏ metanol tuyệt đối (3.1.3) trong 1 min. Để khô.

6.1.4.2. Nhuộm tiêu bản

- Đặt tiêu bản (6.1.4.1) vào cốc đựng dung dịch Giemsa 10 % (xem điều A.2 phụ lục A) trong 1 min;

- Rửa tiêu bản bằng nước sạch từ 3 lần đến 4 lần;

- Để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng.

6.1.5. Xem hình thái lê dạng trùng

...

...

...

- Babesia bovis: hình dạng giống 2 quả lê chụm vào nhau tạo góc tù, nằm ở giữa hồng cầu. Kích thước chiều dài từ 1 mm đến 1,5 mm, chiều rộng từ 0,5 mm đến 1,0 mm;

- Babesia divergens: có hình dạng gần giống Babesia bovis nhưng nằm ở mép hồng cầu;

- Babesia bigemina: hình dạng quả lê đơn hoặc đôi chụm vào nhau tạo góc nhọn. Kích thước to hơn các loài khác, chiều dài từ 3 mm đến 3,5 mm, chiều rộng từ 1 mm đến 1,5 mm.

6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện kháng nguyên lê dạng trùng

6.2.1. Lấy mẫu

Xem 6.1.1.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Xem 6.1.2.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

...

...

...

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít tách chiết DNeasy^ÒBlood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)1) (xem Phụ lục B).

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.2) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 18S rADN của B. bovis hoặc B. bigemina sử dụng cặp mồi và mẫu dò (3.2.3) được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Trình tự cặp mồi và mẫu dò phát hiện B. bovis hoặc B. bigemina ^[1]

Gen đích

Loài

...

...

...

Trình tự 5’-3’

18S rADN

B. bovis

Mồi xuôi (forward primer)

AGCAGGTTTCGCCTGTATAATG

Mồi ngược (reverse primer)

AGTCGTGCGTCATCGACAAA

Mẫu dò (FAM)

CCTTGTATGACCCTGTCGTACCGTTGG

...

...

...

B. bigemina

Mồi xuôi (forward primer)

AATAACAATACAGGGCTTTCGTCT

Mồi ngược (reverse primer)

AACGCGAGGCTGAAATACAACT

Mẫu dò (VIC)

TTGGAATGATGGTGATGTACAACCTCA

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.3) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi và mẫu dò lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi, mẫu dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

...

...

...

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10 mM, pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.4) (10 ml mẫu dò gốc và 90 ml nước).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của QuantiTect Probe PCR, Qiagen (Cat No. 204341)2)

Thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần

Thể tích (ml)

...

...

...

12

Mồi xuôi, 20 mM

1

Mồi ngược, 20 mM

1

Mẫu dò, 10 mM

0,5

Nước tinh khiết không có nuclease

5,5

...

...

...

20

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ADN có giá trị chu kỳ ngưỡng (C_t) đã biết trước vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước (3.2.4) vào ống phản ứng;

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ADN bệnh phẩm (6.2.4.1) vào ống phản ứng.

CHÚ THÍCH:

Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng Realtime PCR bằng máy nhân gen (Realtime PCR) (4.3.2) đã được cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 4.

...

...

...

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C

2 min

1

95 °C

10 min

95 °C

...

...

...

45

55 °C

1 min

45

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy nhân gen (realtime PCR) (4.3.2) dựa trên giá trị C_t (C_t là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền).

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị C_t biết trước, mẫu kiểm chứng âm tính không có C_t;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị C_t £ 35 được coi là dương tính; mẫu không có C_t được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < C_t £ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại quy trình xét nghiệm hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác để khẳng định.

...

...

...

6.3.1. Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 20G (hoặc 18G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi mắc bệnh lê dạng trùng. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1).

6.3.3. Chuẩn bị mẫu

Chắt huyết thanh từ xylanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.3.4. Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể lê dạng trùng ở trâu bò của hãng SVANOVA3).

6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

...

...

...

- Dung dịch kháng kháng thể bò: pha loãng kháng kháng thể bò với 11,5 ml dung dịch đệm (pha xong dùng ngay). Sau khi pha loãng bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Dung dịch kháng kháng thể bò đông tan tối đa 3 lần;

- Pha loãng mẫu kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm (6.3.3) với dung dịch đệm theo tỷ lệ 1/100 (cho 5 ml mẫu kiểm chứng hoặc mẫu bệnh phẩm vào 495 ml dung dịch đệm).

6.3.4.2. Tiến hành phản ứng

- Các thuốc thử để ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng;

- Nhỏ 100 ml mẫu kiểm chứng (âm, dương) đã pha loãng (6.3.4.1) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện trên 2 giếng, vị trí của mẫu kiểm chứng đã được đánh dấu trong đĩa);

- Nhỏ 100 ml mẫu bệnh phẩm đã pha loãng (6.3.4.1) vào giếng được chọn (mỗi mẫu có thể làm 1 giếng hoặc 2 giếng, tuy nhiên trong trường hợp xác định lại mỗi mẫu nên làm 2 giếng);

- Phủ kín đĩa và ủ ở tủ ấm 37°C (4.4.1) trong 30 min;

- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm;

- Nhỏ 100 ml dung dịch kháng kháng thể bò đã pha loãng (6.3.4.1) vào từng giếng;

...

...

...

- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm;

- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất vào mỗi giếng;

- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 18 °C đến 25 °C trong 30 min;

- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng;

- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 18 °C đến 25 °C trong 30 min;

- Đọc đĩa ở bước sóng 405 nm bằng máy đọc ELISA (4.4.2) trong vòng 15 min.

6.3.5. Đọc kết quả

- Tính giá trị mật độ quang học (OD) của mẫu kiểm chứng âm, mẫu kiểm chứng dương và mẫu bệnh phẩm.

- Tính tỷ lệ giá trị OD giữa mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm với mẫu kiểm chứng dương (PP) theo công thức sau:

...

...

...

OD mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm

x 100

OD mẫu kiểm chứng dương

- Giá trị mẫu kiểm chứng nằm trong khoảng giới hạn sau:

1) OD của mẫu kiểm chứng dương: trong khoảng 1,0 đến 2,3

2) PP của mẫu kiểm chứng âm: nhỏ hơn 20

- Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

1) PP nhỏ hơn hoặc bằng 25: mẫu âm tính;

2) PP trong khoảng 26 đến 39: mẫu nghi ngờ;

...

...

...

CHÚ THÍCH: Kít phát hiện kháng thể lê dạng trùng không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do tiêm vắc xin.

6.4. Phương pháp IFAT phát hiện kháng thể lê dạng trùng

6.4.1. Lấy mẫu

Xem 6.3.1.

6.4.2. Bảo quản mẫu

Xem 6.3.2.

6.4.3. Chuẩn bị mẫu

Xem 6.3.3.

6.4.4. Cách tiến hành

...

...

...

- Lấy máu con vật nhiễm lê dạng trùng ở mật độ từ 2 % đến 5 % cho vào ống có chứa chất chống đông;

- Rửa 3 lần với dung dịch PBS (3.4.1) theo tỷ lệ 1/5 (hoặc 1/10) để loại bỏ huyết tương;

- Sau khi rửa, hồng cầu được tái hòa tan bằng 2 lần thể tích PBS đã cho thêm 1 % albumin huyết thanh bò (3.4.2);

- Nhỏ 1 giọt máu đã pha loãng ở trên vào một phiến kính (4.2.1) và dùng một phiến kính khác dàn mỏng;

- Để phiến kính khô ở nhiệt độ phòng và cố định 5 min ở nhiệt độ 80 °C. Bọc kín tiêu bản máu đã cố định và bảo quản ở âm 70 °C, thời gian bảo quản tiêu bản tối đa 5 năm.

6.4.4.2. Tiến hành phản ứng

- Mẫu bệnh phẩm (6.4.3) pha loãng với dung dịch PBS (3.4.1) theo tỷ lệ 1 : 30;

- Chia nhỏ phiến kính chứa kháng nguyên (được chuẩn bị ở (6.4.4.1)) từ 8 ô đến 10 ô bằng bút dầu;

- Nhỏ từ 5 ml đến 10 ml mẫu bệnh phẩm đã pha loãng và mẫu kiểm chứng (âm, dương) vào các ô đã chia ở trên qua miếng giấy lọc;

...

...

...

- Rửa phiến kính bằng dung dịch PBS để loại bỏ miếng giấy lọc;

- Rửa lại phiến kính bằng dung dịch PBS và nước. Mỗi lần rửa cho phiến kính vào máy lắc trộn vortex (4.1.3) trong 10 min;

- Nhỏ kháng kháng thể có gắn chất màu huỳnh quang (fluorescein isothiocyanate - FITC) đã pha loãng ở nồng độ từ 1/400 đến 1/1200 vào mỗi ô;

- Ủ phiến kính ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

- Rửa phiến kính bằng dung dịch PBS và nước. Mỗi lần rửa cho phiến kính vào máy lắc trộn vortex (4.1.3) trong 10 min;

- Gắn lamen (4.2.2) lên trên phiến kính sau khi làm ẩm phiến kính bằng dung dịch glyxerol (3.4.3) và PBS theo tỷ lệ 1/1.

6.4.5. Đọc kết quả

Kiểm tra phiến kính (6.4.4.2) bằng kính hiển vi huỳnh quang (4.5):

- Mẫu dương tính đối với lê dạng trùng khi có màu huỳnh quang giống với màu của mẫu kiểm chứng dương;

...

...

...

7. Kết luận

Trâu bò được kết luận là mắc bệnh lê dạng trùng khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính bằng một trong những phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử cho phương pháp nhuộm Giemsa

A.1. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0

A.1.1. Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

...

...

...

Nước cất

9,47 g

9,08 g

900 ml

A.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất

A.2. Dung dịch Giemsa, 10 %

Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen blue)

...

...

...

1 phần

9 phần

CHÚ THÍCH: Nồng độ dung dịch Giemsa có thể thay đổi theo các phòng thí nghiệm.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít DNeasy^®Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) như sau:

...

...

...

- Dung dịch AW 1 (Wash buffer 1): thêm 125 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

- Dung dịch AW 2 (Wash buffer 2): thêm 160 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc.

B.1. Cách tiến hành

- Bước 1: nhỏ 20 ml proteinase K vào ống 1,5 ml; nhỏ thêm 100 ml mẫu máu (6.2.3); và thêm dung dịch PBS để được thể tích 220 ml. Tiến hành tiếp bước 2;

- Bước 2: nhỏ 200 ml dung dịch AL (Lysis buffer) vào ống; trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

- Bước 3: nhỏ 200 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.3).

- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 ml dung dịch AW 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 ml dung dịch AW 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 3 min, loại bỏ ống thu;

...

...

...

- Bước 8: nhỏ 50 ml dung dịch AE (Elution buffer) vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min;

- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa ADN;

Bảo quản ADN ở tủ lạnh (4.1.2) nếu thực hiện phản ứng realtime PCR ngay hoặc ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu thực hiện phản ứng realtime PCR sau 24 h.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Kim C, Iseki H, Herbas MS, Yokoyama N, Suzuki H, Xuan X, Fujisaki K, Igarashi I. Development of TaqMan-based real-time PCR assays for diagnostic detection of Babesia bovis and Babesia bigemina. Am J Trop Med Hyg. 2007 Nov;77(5):837-41.

[2] Buling A., Criado-Fornelio A., Asenzo G., Benitez D., Barba-Carretero J.C. & Florin-Christensen M., 2002. A quantitative PCR assay for the detection and quantification of Babesia bovis and B. bigemina. Vet. Parasitol. 147,16-25.

[3] Babesia bigemina Antibody Test. Available at: http://www.svanova.com/conten/dam/internet/ah/svanova/dk_EN/documents/Kit%20inserts/lnsert%20B%20Bigenima-Ab%2019-2970-00_05.pdf

[4] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996, Giáo trình ký sinh trùng thú y. NXB Đại học Nông Nghiệp I. 235-240.

...

...

...

[6] Moses Sibusiso Mtshali., Phillip Senzo Mtshali, Molecular diagnosis and phylogenetic analysis of Babesia bigemina and Babesia bovis hemoparasites from cattle in South Africa, BMC Vet Res. 2013; 9: 154.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. Tuy nhiên, thành phần và thể tích của phản ứng realtime PCR có thể thay đổi phù hợp với từng phòng thí nghiệm.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.