Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-16:2017 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin – Phần 16: phòng bệnh viêm teo mũi

• Số hiệu: TCVN8685-16:2017
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2017

Hiệu lực của vắc xin	=	Số nghịch đảo 50% ở độ pha loãng cuối cùng của vắc xin kiểm tra	≥ 0.5
		Số nghịch đảo 50% ở độ pha loãng cuối cùng của vắc xin tham chiếu

7.4.2.2  Phương pháp tính trên liều LD₅₀ trên chuột nhắt trắng

Chuột được chia làm 2 nhóm:

- Nhóm 1: Tiêm vào phúc xoang 50 chuột nhắt trắng (4.4) mỗi con tiêm 0,2 ml vắc xin cần kiểm tra.

- Nhóm 2: Tiêm nước sinh lý vô trùng vào phúc xoang 50 chuột nhắt trắng (4.4) với liều lượng như tiêm vắc xin cần kiểm tra.

- 21 ngày sau, chuột của cả 2 nhóm được thử thách với vi khuẩn cường độc Bordetella bronchiseptica (4.5) .

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5) được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt. Lấy 0,2 ml canh trùng cường độc được pha loãng với PBS theo cơ số 10 để được các nồng độ từ 10^-^1 đến nồng độ 10^-^10.

- Ở mỗi nồng độ tiêm vào phúc xoang cho 5 chuột với liều 0.1 ml/con.

- Theo dõi trong 7 ngày, vắc xin được coi là đạt nếu LD₅₀ của nhóm 1 lớn hơn nhóm 2 ít nhất 10 ^2.0.

- Liều LD₅₀ của cả 2 nhóm chuột được tính toán tính theo công thức Reed - Muench:

...

...

...

Trong đó:

X: Khoảng cách tỷ lệ

A: Độ pha loãng vi khuẩn gây chết chuột nhắt trắng cận trên 50%

A': Tỷ lệ % chuột nhắt trắng chết cận trên 50%

B': Tỷ lệ % chuột nhắt trắng chết cận dưới 50%

f: Hệ số pha loãng vi khuẩn

7.4.3  Phương pháp huyết thanh học

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

...

...

...

- Tiêm bắp ít nhất 05 lợn (4.1), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ lợn được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, lợn được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ELISA.

- Tiêm bắp ít nhất 05 thỏ (4.3), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ thỏ được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, thỏ được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ELISA.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn khi ít nhất 75 % mẫu huyết thanh đạt giá trị dương tính.

7.4.3.2. Đánh giá hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết

- Tiêm bắp ít nhất 05 lợn (4.1), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ lợn được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, lợn được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục).

- Vắc xin được coi là đạt nếu hiệu giá kháng thể của ít nhất 75 % mẫu huyết thanh miễn dịch cho kết quả ≥ 1:16.

Phụ lục A

(Quy định)

...

...

...

A.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

- Đĩa thạch chocolate bổ sung Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 5 %

- Đĩa thạch máu đường kính 8-10 cm

- Canh thang Brain heart infusion (BHI) đóng ống 4 ml

- Acid Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 1N

- Formaldehyde solution min 37 % (HCHO)

- Dung dịch PBS: 1000ml được pha theo công thức sau:

Natri clorua (NaCl)

8 g

...

...

...

2 g

Natri hiđro photphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

Mono kali photphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước

1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 1 h. Bảo quản ở nhiệt độ 4°C.

A.2  Chuẩn bị kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen - KN xử lý acid EDTA)

...

...

...

A.2.2  Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch chocolate (A.2.1) cấy vào môi trường canh thang BHI (A.1) bổ sung NAD 5 %, rồi ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h

A.2.3  Láng 4 ml canh trùng (A.2.2) lên 2 đĩa thạch chocolate (A.1) rồi ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h

A.2.4  Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch chocolate (A.2.3) bằng cách dùng 5ml PBS rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm

A.2.5  Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37 % (A.1) vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn

A.2.6  Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt chỉ tiêu vô trùng sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 20 ml EDTA 1 %, lắc đều rồi ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h

A.2.7  Sau đó tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.6) bằng máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS có bổ sung 0,3 % Formaldehyde solution min 37 % (A.1), lặp lại 2 lần.

A.2.8  Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.7) bằng máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS để thu hoạch kháng nguyên

A.2.9  Kiểm tra kháng nguyên (A.2.8) xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết.

A.3. Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra

...

...

...

A.4  Cách tiến hành

Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên O (kháng nguyên Somatic) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U

Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên

- Đối với các giếng thí nghiệm:

+ Cho dung dịch PBS vào các dãy giếng thí nghiệm trên đĩa 96 đáy chữ U (50 μl/giếng)

+ Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết thanh và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2

+ Nhỏ vào các giếng 50 μl kháng nguyên

...

...

...

+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl kháng nguyên

+ Đối chứng dương: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl huyết thanh tối miễn dịch và pha loãng theo cơ số 2

+ 50 μl kháng nguyên

- Lắc nhẹ cho đều rồi dính băng dính để ở tủ ấm 37°C (5.1) qua đêm

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Kháng nguyên lắng tròn đáy giếng

+ Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng

+ Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

...

...

...

[1] ASEAN Standards for Aniamal Vaccines (Second Edition): Requirements for Bordetella bronchiseptica Bacterin.