|
Mồi
|
Trình tự
nucleotit
|
Kích thước
sản phẩm, bp
|
|
SVC F1
|
5’-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR*-R*TC-3’
|
714
|
|
SVC R2
|
5’-AGA-TGG-TAT-GGA-CCC-CAA-TAC-ATH*-ACN*-CAY*-3’
|
|
SVC F1
|
5’-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR*-R*TC-3’
|
606
|
|
SVC R4
|
5’-CTG-GGG-TTT-CCN*-CCT-CAA-AGY*-TGY*-3’
|
CHÚ THÍCH: (*) sử dụng theo bảng mã
IUB;
R là G hoặc A;
H là A hoặc T hoặc C;
N là G hoặc A hoặc T hoặc C;
Y là T hoặc C.
E.2 Thực hiện phản ứng RT- nested PCR
Bước 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR sử
dụng cặp mồi SVC F1 /SVC R2
Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng
kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng E.2)
và chu trình nhiệt (xem Bảng E.3)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng E. 2 -
Thành phần của phản ứng RT- PCR và chu trình nhiệt
Thành phần
Nồng độ
Thể tích
cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/ ADN
7,5
2X Reaction Mix
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi SVC F1
20 µM
0,5
Mồi SVC R2
20 µM
0,5
Enzyme Taq Mix
1,0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
22
Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống
phản ứng:
- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 3 µl mẫu
ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng SVC chuẩn;
- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 3 µl nước
tinh khiết không có nuclease;
- Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu ARN kiểm tra
vào ống phản ứng;
- Tiến hành phản ứng RT PCR bằng máy
nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng E.3).
Bảng E. 3 -
Chu trình nhiệt của phản ứng RT PCR
Nhiệt độ
(°C)
Thời gian
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
50
30 min
1
94
2 min
94
15 s
40
55
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
68
1 min
68
5 min
1
Bước 2: Thực hiện phản ứng nested PCR
sử dụng cặp mồi SVC F1/ SVC R4:
- Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng
kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất;
- Lấy sản phẩm bước 1 để chuẩn bị cho
phản ứng bước 2 - Nested PCR;
- Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng
E.4) và chu trình nhiệt (xem Bảng E.5).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng E. 4 -
Thành phần của phản ứng nested PCR
Thành phần
Nồng độ gốc
Thể tích
cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/ADN
9
PCR Master Mix (2X)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SVC F1
20 µM
0,5
SVC R4
20 µM
0,5
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện
phản ứng
22,5
Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi
ống phản ứng sau đó cho thêm:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước
tinh khiết không có nuclease;
- Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu sản phẩm từ
bước 1.
Tiến hành phản ứng nested PCR bằng máy
nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng E.5)
Bảng E.5 -
Chu trình nhiệt của phản ứng nested PCR
Nhiệt độ
(°C)
Thời gian
Số chu kỳ
95
2 min
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
30 s
30
55
30 s
72
60 s
72
10 m
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giữ ở 4 °C
đến khi tắt máy
Phụ
lục F
(Quy
định)
Phát hiện vi rút gây bệnh xuất huyết mùa xuân
bằng phương realtime RT-PCR
F.1 Trình tự đoạn mồi (primers) và đoạn
dò (probe) cho phản ứng realtime RT-PCR
Bảng F.1 -
Trình tự đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) cho phản ứng realtime RT-PCR[10]
Cặp mồi/ Đoạn
dò
Tên mồi
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kích thước
sản phẩm, bp
Xuôi
SVC-F
TGC TGT GTT
GCT TGC ACT TAT YT
81
Ngược
SVC-R
TCA AAC KAA
RGA CCG CAT TTC G
Dò
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
FAM-ATG AAG
ARG AGT AAA CKG CCT GCA ACA GA-TAMRA
Thực hiện phản ứng realtime RT-PCR
Phương pháp realtime RT-PCR khuếch đại
đoạn gen đặc hiệu của SVCV, sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.12) và kít
nhân gen (3.2.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng
F.2) và chu trình nhiệt (xem Bảng F.3)
VÍ DỤ: Superscript III Platinum®
one step qRT-PCR System, Cat.No: 11732-020[4])
Bảng F.2 -
Thành phần phản ứng realtime RT PCR
Thành phần
Nồng độ gốc
Thể tích cho
1 phản ứng (µl)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5,5
Dung dịch 2X Reaction Mix
12,5
Mồi SVCV-F
10 µM
0,5
Mồi SVCV-R
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5
Đoạn dò SVCV-p
5 µM
0,5
Enzyme
0,5
Mẫu RNA
5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
25
Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống
phản ứng:
- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 5 µl mẫu
RNA đã được giám định hoặc sử dụng các chủng SVC chuẩn.
- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 5 µl nước
tinh khiết không có nuclease.
- Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu RNA kiểm tra
vào ống phản ứng.
Tiến hành phản ứng real-time RT-PCR bằng
máy nhân gen (4.2.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng F.3)
Bảng F.3 -
Chu kỳ luân nhiệt đối real-time RT-PCR
Nhiệt độ
(°C)
Thời gian
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
50
15 min
01
95
2 min
01
95
15 s
40
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
30 s
(Ghi nhận
tín hiệu quang ở bước này)
CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời
gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500
Thư mục tài
liệu tham khảo
[1] Alikin Y.S., Shchelkunov I.S.,
Shchelkunova T.I., Kupinskaya O.A., Masycheva V.I., Klimenko V.P. & Fadina
VA. 1996. Prophylactic treatment of viral diseases in fish using native RNA
linked to soluble and corpuscular carriers. J. Fish Biol., 49, 195-205.
[2] Aquatic Animal Diseases
significant to Australia: Identification Field Guide 4th Edition
[3] BÉKÉSI L. & CSONTOS L. (1985).
Isolation of spring viraemia of carp virus from asymptomatic broodstock carp,
Cyprinus carpio L. J. Fish Dis., 8, 471-472
[4] Bùi Quang Tề và cộng sự. 2008., Bệnh
học thủy sản.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[6] OIE - Manual of Diagnostic Test
for Aquatic Animals, 2017, chương 2.3.9 - Spring viraemia of
carp (SVC).
[7] Stone D.M., AhneW., Denham K.D.,
Dixon P.F., LIU C.T.Y., Sheppard A.M., Taylor G.R. & Way K. 2003.
Nucleotide sequence analysis of the glycoprotein gene of putative spring
viraemia of carp virus and pike fry rhabdovirus isolates reveals four genogroups. Dis. Aquat.
Org., 53,
203-210.
[8] TCVN 8710 -7: 2012 Quy trình chẩn
đoán bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép.
[9] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn
- Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.
[10] ZhlqinYue và cs, 2008.
Development of a sensitive and quantitative assay for spring viremia of carp
virus based on real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods.
[1]) Sản phẩm do
hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người
sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản
phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
[2]) Sản phẩm do
hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người
sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản
phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
[3]) Thông tin
này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định
sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu
cho các kết quả tương đương.
[4]) Thông tin
này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định
sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu
cho các kết quả tương đương.