Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp
vô trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min ở nồi hấp (6.6). Bảo quản ở tủ lạnh
(6.2).
A.1.5 Nước muối sinh lý 0,9 % được pha theo công thức sau:
Natri clorua (NaCl)
9 g
Nước
cất
1000 ml
Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch
HCl 1N, Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min ở nồi hấp (6.6). Bảo
quản ở tủ lạnh (6.2).
A.2 Chuẩn bị kháng nguyên
A.2.1 Ria cấy 0,01 ml vi khuẩn Riemerella
anatipestifer cường độc (5.4) vào môi trường thạch BAB (A.1.1), ủ ở tủ ấm
(6.1) trong 24 h.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.3 Láng 4 ml canh trùng (A.2.2) lên 2 đĩa thạch
BAB (A.1.1) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h.
A.2.4 Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch
BAB (A.2.3) bằng cách dùng 5ml PBS (A.1.4) rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn
dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm.
A.2.5 Nhỏ 0,01 ml dung dịch Formaldehyde 37 % (A. 1.3)
vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h, sau đó
đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn bằng cách ria trên thạch BAB (A.1.1),
ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h.
A.2.6 Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt chỉ tiêu vô
trùng (không có vi khuẩn mọc trên đĩa thạch) sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm
(6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4°C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng PBS
(A.1.4).
A.2.7 Kiểm tra kháng nguyên (A.2.6) xem có tự ngưng
kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết, kháng
nguyên lắng tròn nhỏ đáy giếng.
A.3 Chuẩn bị huyết thanh
A.3.1 Huyết thanh thí nghiệm
Lấy máu động vật (7.6.2.1), chắt lấy huyết thanh, sau đó khử bổ thể bằng
cách đun ở nồi cách thủy (6.8) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.
A.3.2 Huyết thanh tối miễn dịch
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.2.2 Tiêm 2 ml canh trùng (A.3.2.1) vào dưới da cho
thỏ (5.4).
A.3.2.3 Sau 7 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.2) 0.2 ml
canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
A.3.2.4 Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ
(A.3.2.3) 0.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
A.3.2.5 Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ
(A.3.2.4) 1 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
A.3.2.6 Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ
(A.3.2.5) 1.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
A.3.2.7 Sau 3 ngày đến 4 ngày
tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.6) 2 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
A.3.2.8 Sau 3 ngày 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.7) 2.5 ml
canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
A.3.2.9 Sau 3 ngày 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.8)
3 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
A.3.2.10 Sau 3 ngày 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.9)
3.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.2.12 Sau 1 tuần tiêm mũi cuối cùng tiến hành lấy máu
thỏ thu hoạch huyết thanh tối miễn dịch.
A.3.3 Cách pha canh trùng 2 tỷ
A.3.3.1 Sử dụng 7 ống nghiệm vô trùng (6.11), đánh số
từ 1 đến 7, cho vào mỗi ống 9 ml nước muối sinh lý vô trùng (A.1.5).
A.3.3.2 Cho 1 ml canh trùng đếm số vào ống thứ 1 trộn đều
chuyển 1ml sang ống thứ 2 cứ như vậy đến ống thứ 7 (pha loãng 1/10).
A.3.3.3 Hút 0,01 ml ở ống thứ 7 nhỏ lên đĩa thạch BAB
(A.1.1) rồi ria đều (mỗi nồng độ 2 đĩa), để ở tủ ấm (6.1).
A.3.3.4 Hút 0,01 ml ở ống thứ 6 nhỏ lên đĩa thạch BAB (A.1.1) rồi ria đều
(mỗi nồng độ 2 đĩa), để ở tủ ấm (6.1)
A.3.3.5 Sau 18 h đến 20 h, đọc kết quả: đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi
đĩa.
Cách tính kết quả
Số lượng vi khuẩn (N) trong 1 ml được tính theo công thức sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong đó: C: Là số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa có nồng độ liền nhau.
V: Thể tích cấy ở mỗi đĩa
n1: Số đĩa của độ pha loãng ban đầu 10-7 (2 đĩa)
n2: Số đĩa của độ pha loãng tiếp theo 10-6 (2 đĩa)
d: Độ pha loãng ban đầu (nhân nghịch đảo): 106
Pha canh trùng 2 tỷ:
Canh trùng 2x 109 CFU/ ml = 1 ml canh trùng (A.2.4) + (N/2x109
- 1) ml NaCl (5.3)
A.4 Cách tiến hành
Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm thực hiện trên đĩa nhựa 96 giếng
đáy chữ U (6.12).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ Giếng thí nghiệm: A1 đến H8.
+ Giếng đối chứng âm: A9 đến H10.
+ Giếng đối chứng dương: A11 đến H12.
Bảng A.1 - Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm
- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên.
- Đối với các giếng thí nghiệm:
+ Cho 50 μl dung dịch PBS (A.1.4) vào mỗi giếng thí nghiệm (A1đến H8).
+ Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết thanh (A.3.1) và pha loãng theo
cơ số 2 bằng cách trộn đều rồi
chuyển 50 μl sang giếng thứ 2, cứ
như vậy đến giếng số 8 trộn đều rồi hút bỏ đi 50 μl.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Đối với các giếng đối chứng:
+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS (A.1.4) + 50 μl kháng nguyên
(A.2.7).
+ Đối chứng dương: 50 μl huyết thanh tối miễn dịch (A.3.2.12) + 50 μl
kháng nguyên (A.2.7).
- Lắc nhẹ cho đều rồi đậy nắp để ở tủ ấm (6.1) qua đêm.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng âm tính: kháng nguyên lắng tròn đáy giếng.
+ Phản ứng dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng
kết thành cụm lấm tấm đều dưới đáy giếng.
+ Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha
loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(Quy định)
Phương pháp nhuộm Gram
B.1 Chuẩn bị môi trường hóa chất
B.1.1 Dung dịch tím genxian
B.1.2 Dung dịch lugol
B1.3 Dung dịch axeton
B1.4 Dung dịch fucsin
B.2 Chuẩn bị tiêu bản
Nhỏ một giọt vắc xin lên phiến kính (6.16) rồi dàn mỏng sau
đó để tự khô ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.3.1 Nhỏ dung dịch tím genxian (B1.1) lên tiêu bản
1- 2 min
B.3.2 Rửa nước nhanh, vẩy khô nước
B.3.3 Nhỏ dung dịch lugol (B.1.2) để 1 min
B.3.4 Lặp lại bước 2
B.3.5 Nhỏ cồn axeton (B.1.3) từ đầu phiến kính,
nghiêng phiến kính cho cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn.
B.3.6 Lặp lại bước 2
B.3.7 Nhỏ dung dịch fucsin (B.1.4) để 1 min
B.3.8 Lặp lại bước 2
B.3.9 Thấm khô - Xem dưới kính hiển vi (6.17).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] ASEAN Standards for Animal Vaccine : Asean standard Requirements
for Riemerella anatipestifer Bacterin.
[2] HSSX vắc xin Biofors RA Gel (30-31,81-85,61-62,108-112).
[3] The Riemerella anatipestifer AS 87-01735 gene encodes
nicotinamidase PncA, an important virulence factor.