Tiêu chuẩn TCVN 8685-29:2019 về Quy trình kiểm nghiệm Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà

• Số hiệu: TCVN8685-29:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu tính an toàn và tính hiệu lực được đánh giá trên các động vật thí nghiệm.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Gà 2 tuần tuổi đến 3 tuần tuổi, gà khỏe, không có kháng thể kháng vi rút IB

5.2  Nước muối sinh lý, đã được hấp tiệt trùng, nồng độ 0,9 %

5.3  Gà trống khỏe, đã trưởng thành (trên 12 tuần tuổi), không có kháng thể kháng vi rút cúm, vi rút Newcastle và vi rút IB

5.4  Kit ELISA phát hiện kháng thể IBV

5.5  Dung dịch natri citrat 5 %

5.6  Kháng nguyên IB

...

...

...

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Micropipet đơn kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl

6.2  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl

6.3  Đĩa nhựa 96 giếng đáy hình chữ U và/hoặc V

6.4  Máy ly tâm, có thể quay với tốc độ từ 1000 rpm đến 3000 rpm

6.5  Ống ly tâm vô trùng

6.6  Bơm tiêm 1 lần, dung tích 1 ml, 3 ml, 5 ml, 10 ml

6.7  Cốc có mỏ vô trùng

...

...

...

6.9  Tủ ấm duy trì nhiệt độ 37 °C

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu cảm quan khi hỗn dịch đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

Theo 4.1, 4.2 TCVN 8684 : 2011, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra vô trùng khi không có bất cứ tạp khuẩn hay nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

7.3  Kiểm tra thuần khiết

7.3.1  Tiêm vào xoang niệu mô của 10 trứng gà (5.7), mỗi trứng tiêm 0,2 ml vắc xin.

7.3.2  Ấp các trứng đã được tiêm (7.3.1) ở tủ ấm (6,9) trong 5 ngày, hàng ngày soi trứng và loại bỏ trứng chết phôi trước 24 h.

...

...

...

7.3.4  Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt chỉ tiêu Kiểm tra thuần khiết khi nước trứng cho kết quả âm tính trong phản ứng ngưng kết hồng cầu.

7.4  Kiểm tra vô hoạt

7.4.1  Tiêm vào xoang niệu mô của 10 trứng gà (5.7), mỗi trứng tiêm 0,2 ml vắc xin.

7.4.2  Ấp các trứng đã được tiêm (7.4.1) ở tủ ấm (6.9) trong 7 ngày, hàng ngày soi trứng và loại bỏ trứng chết phôi trước 24 h.

7.4.3  Sau 7 ngày theo dõi, trứng được mồ và kiểm tra bệnh tích đặc trưng của phôi trứng do vi rút IB gây ra (phôi chậm phát triển, cuộn tròn cùng với chứng suy nhược các bắp cơ và lắng đọng urate trong thận, nước xoang niệu mô trong).

7.4.4  Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt chỉ tiêu vô hoạt khi 100 % phôi trứng (7.4.3) khỏe mạnh, không có bệnh tích đặc trưng của phôi trứng do vi rút IB gây ra.

7.5  Kiểm tra tính an toàn

7.5.1  Tiêm cho 10 gà (5.1), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường dưới da cổ.

7.5.2  Theo dõi toàn bộ gà thí nghiệm trong 21 ngày.

...

...

...

7.6  Kiểm tra hiệu lực

7.6.1  Cách tiến hành

- Sử dụng 30 gà (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 20 gà, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn, theo đường dưới da cổ;

+ Nhóm 2: gồm 10 gà làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.2) theo đường dưới da cổ với liều lượng như gà nhóm 1.

- Sau khi tiêm vắc xin từ 21 ngày đến 28 ngày, tất cả gà nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu, thu huyết thanh để làm phản ứng huyết thanh học (phương pháp HI hoặc phương pháp ELISA) (xem phụ lục A, B, C).

7.6.2  Đánh giá kết quả

- Phương pháp HI: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi hiệu giá HI trung bình của gà nhóm 1 ≥ 5 log₂; trong khi đó gà nhóm 2 âm tính (xem phụ lục A, B).

- Phương pháp ELISA: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 1 dương tính; trong khi đó ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 2 âm tính (tham khảo phụ lục C).

...

...

...

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, vô trùng, thuần khiết, vô hoạt, an toàn và hiệu lực như đã nêu ở mục 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 và 7.6.

Phụ lục A

(Quy định)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)

A.1  Chuẩn bị hồng cầu gà 1 %

A.1.1  Dùng bơm tiêm 1 lần (6.6) để hút 1 ml dung dịch natri citrat (5.5) cho vào ống ly tâm (6.5), thêm 9 ml máu lấy từ gà trống (5.3).

A.1.2  Ly tâm ống (A.1.1) bằng máy ly tâm (6.4) với tốc độ từ 1000 rpm đến 1500 rpm trong 15 min, gạn bỏ phần dung dịch nổi bên trên, thêm 10 ml nước muối sinh lý (5.2) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm lặp lại từ 3 lần đến 4 lần để rửa hồng cầu, dùng micropipet (6.1) hút bỏ dung dịch ở trên sau lần ly tâm cuối.

A.1.3  Chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 1 % bằng cách dùng micropipet (6.1) chuyển 1 ml hồng cầu (A.1.2) vào cốc có mỏ (6.7) có chứa 99 ml nước muối sinh lý (5.2).

...

...

...

A.2  Cách tiến hành

A.2.1  Dùng micropipet (6.2) nhỏ 25 μl nước muối sinh lý (5.2) vào đĩa nhựa 96 giếng (6.3) đáy chữ U, từ giếng thứ 1 đến giếng 12.

A.2.2  Dùng micropipet (6.1) nhỏ 25 μl kháng nguyên IB (5.6) vào giếng 1.

A.2.3  Dùng micropipet (6.2) trộn đều kháng nguyên với nước muối sinh lý (5.2) ở giếng 1, hút 25 μl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 μl chuyển sang giếng 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 rồi bỏ đi 25 μl.

A.2.4  Giếng 12 làm đối chứng hồng cầu: cho 25 μl nước muối sinh lý (5.2) và 25 μl hồng cầu gà 1 % (A.1.3).

A.2.5  Dùng micropipet (6.2) nhỏ 25 μl hồng cầu gà 1 % (A.1.3) vào các giếng của đĩa phản ứng.

A.2.6  Lắc nhẹ bằng tay và ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 min, ngay sau đó đọc kết quả.

A.3  Đọc kết quả

- Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn giữa đáy giếng.

...

...

...

- Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

Bảng A.1 - Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)

Các bước

Nguyên liệu

Giếng

1

2

3

4

...

...

...

6

7

8

9

10

11

12

Pha loãng kháng nguyên

PBS, μl

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

Kháng nguyên kiểm tra, μl

25

Trộn đều, chuyển 25 μl lần lượt từ giếng 1 đến giếng 11 rồi hút bỏ 25 μl

0

Cho hồng cầu gà

Hồng cầu gà 1 %, μl

25

25

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

...

...

...

-

Phụ lục B

(Quy định)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)

B.1  Chuẩn độ kháng nguyên 4 đơn vị HA

B1.1  Kháng nguyên được pha 4 đơn vị HA cần phải chuẩn để phản ứng HI cho kết quả chính xác. Ví dụ: HA bằng 1/256, 4 HA bằng 1/64 (Pha 4 HA: gồm 1 phần kháng nguyên IB (5.6) và 63 phần nước muối sinh lý (5.2)).

B1.2  Kiểm tra kháng nguyên 4 HA đã pha: tiến hành phản ứng HA (xem phụ lục A), nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên là kháng nguyên pha loãng thì phải điều chỉnh lại bằng cách cho thêm nước sinh lý hoặc kháng nguyên.

...

...

...

B.2.1  Dùng micropipet (6.2) nhỏ 25 μl nước muối sinh lý (5.2) vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12 của đĩa nhựa 96 giếng (6.3) có đáy chữ U.

B.2.2  Dùng micropipet (6.1) nhỏ 25 μl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1.

B.2.3  Pha loãng huyết thanh: dùng micropipet (6.2) trộn đều huyết thanh với nước muối sinh lý ở giếng 1, rồi hút 25 μl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 μl chuyển sang giếng 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 rồi bỏ đi 25 μl.

B.2.4  Dùng micropipet (6.2) nhỏ 25 μl dung dịch kháng nguyên 4 HA vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 11. Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng.

B.2.5  Dùng micropipet (6.2) nhỏ 25 μl hồng cầu gà 1 % (A.1.3) vào các giếng của đĩa phản ứng.

B.2.6  Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. Ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng trong thời gian khoảng 30 min, ngay sau đó đọc kết quả.

B.3  Đọc kết quả

- Phản ứng âm tính (không có kháng thể kháng vi rút IB): xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm đều dưới đáy giếng.

- Phản ứng dương tính (có kháng thể kháng vi rút IB): hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn giữa đáy giếng.

...

...

...

Bảng B.1 - Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)

Các bước

Nguyên liệu

Giếng

1

2

3

4

5

...

...

...

7

8

9

10

11

12

Pha loãng huyết thanh

PBS, μl

25

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

Huyết thanh Kiểm tra

25

Chuyển 25 μl từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều, chuyển tiếp tục đến giếng 11 rồi hút bỏ 25 μl

0

Cho kháng nguyên

Kháng nguyên 4 HA, μl

25

25

25

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

0

Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng

...

...

...

Hồng cầu gà 1 %, μl

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

25

25

Độ pha loãng kháng thể

...

...

...

-

Phụ lục C

(Tham khảo)

...

...

...

C.1  Vật liệu thử

- Huyết thanh gà cần kiểm tra

- Kit ELISA phát hiện kháng thể IB

VÍ DỤ: Dùng Kit ELISA của hãng IDEXX (Infectious Bronchitis Virus Antibody Test Kit - Cat. No. JL 181)[1].

C.2  Cách tiến hành

C.2.1  Pha loãng huyết thanh bằng dung dịch sample diluent theo tỷ lệ 1/500.

C.2.2  Dùng micropipet (6.1) nhỏ 100 µl Negative control IBV vào giếng A1 và A2 của đĩa có phủ kháng nguyên IB.

C.2.3  Dùng micropipet (6.1) nhỏ 100 μl Positive control IBV vào giếng B1 và B2 của đĩa có phủ kháng nguyên IB.

C.2.4  Dùng micropipet (6.2) nhỏ huyết thanh đã pha loãng (C.2.1) vào các giếng còn lại (trừ giếng A1, A2, B1, B2) của đĩa có phủ kháng nguyên IB.

...

...

...

C.2.6  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của đĩa bằng nước cất 2 lần, mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

C.2.7  Dùng micropipet (6.2) nhỏ Goat Anti-Chicken Horseradish Peroxidase Conjugate Solution vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

C.2.8  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của đĩa bằng nước cất 2 lần, mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

C.2.9  Dùng micropipet (6.2) nhỏ Tetramethylbenzidine substrate vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

C.2.10  Dùng micropipet (6.2) nhỏ dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 µl, sau đó đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.8) ở bước sóng 650 nm để ra các giá trị Optical Density (OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

Bảng C.1 - Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA

1

2

...

...

...

4

5

6

7

8

9

10

11

12

...

...

...

NC

NC

S7

S7

S15

S15

S23

S23

S31

...

...

...

S39

S39

B

PC

PC

S8

S8

S16

S16

...

...

...

S24

S32

S32

S40

S40

C

S1

S1

S9

...

...

...

S17

S17

S25

S25

S33

S33

S41

S41

D

...

...

...

S2

S10

S10

S18

S18

S26

S26

S34

S34

...

...

...

S42

E

S3

S3

S11

S11

S19

S19

S27

...

...

...

S35

S35

S43

S43

F

S4

S4

S12

S12

...

...

...

S20

S28

S28

S36

S36

S44

S44

G

S5

...

...

...

S13

S13

S21

S21

S29

S29

S37

S37

S45

...

...

...

H

S6

S6

S14

S14

S22

S22

S30

S30

...

...

...

S38

S46

S46

CHÚ THÍCH:

NC: negative control (đối chứng âm)

PC: positive control (đối chứng dương)

S: sample (mẫu)

C.3  Công thức tính kết quả

- Đối chứng dương trung bình (PCx) =

...

...

...

- Giá trị S/P =

- Hiệu giá S/P (ở độ pha loãng 1 : 500): log₁₀ Titer = 1,09 (log₁₀S/P) + 3,36

C.4  Điều kiện kết quả

Giá trị OD của đối chứng đạt điều kiện như sau thì phản ứng đạt

- OD đối chứng dương - OD đối chứng âm > 0,075 (PCx - NCx > 0,075)

- OD đối chứng âm < 0,150 (NCx ≤ 0,150)

C.5  Diễn giải kết quả

- Giá trị S/P ≤ 0,20 mẫu kiểm tra âm tính (S/P ≤ 0,20 : N)

- Giá trị S/P > 0,20 mẫu kiểm tra dương tính (S/P > 0,20 : P)

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Asean Standard requirements for Infectious Bronchitis Vaccine, Inactivated: 20-21

[2] OIE Terrestrial Manual 2012 - Chapter 2.3.2 Avian Infectious Bronchitis: 1-15

[3] 10 VR - 10KN1 - Quy trình Kiểm nghiệm vắc xin Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) vô hoạt

[1] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.