Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-40:2016 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 40

• Số hiệu: TCVN8400-40:2016
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2016

Bệnh	Biểu hiện
Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra	Mắc ở mọi lứa tuổi. Thường chết đột ngột khi chưa có triệu chứng. Triệu chứng có thể thấy là sốt cao, bỏ ăn, thở khó, lười vận động. Tiêu chảy phân trắng có thể kèm theo nhớt. Bệnh tích đặc trưng: Gan có các điểm hoại tử nhỏ li ti bằng đầu đinh ghim, có màu trắng xám hoặc vàng nhạt; Phổi, gan, lách ruột xuất huyết; Bao tim tích nước vàng; Cơ tim và lớp mỡ vành tim xuất huyết.
Bệnh do vi khuẩn E.coli gây ra	Mắc chủ yếu ở 2 tuần đến 12 tuần. Biểu hiện không rõ, lúc đầu sốt, sau giảm dần. Khi bị nặng, thủy cầm tiêu chảy, phân màu vàng, xanh lẫn nhiều bọt khí. Thủy cầm đẻ: giảm đẻ, gầy ốm và thường kèm theo chứng sưng khớp. Bệnh tích đặc trưng: Viêm màng bao tim, viêm màng bụng, viêm màng quanh gan. Ngoài ra, còn thấy viêm đường ruột, viêm túi khí. Thủy cầm đẻ còn thấy viêm, hoại tử buồng trứng.
Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra	Mắc chủ yếu dưới 3 tuần tuổi. Tiêu chảy phân trắng, dính bết vào lỗ huyệt. Có thể có viêm khớp. Bệnh tích đặc trưng: Không tiêu lòng đỏ. Viêm bao tim. Xoang bao tim tích nước nhày, màu vàng. Viêm xoang bụng, có thể dính với các cơ quan khác.
Bệnh viêm gan vịt	Mắc ở vịt dưới 6 tuần tuổi, chủ yếu từ 1 đến 3 tuần tuổi. Vịt có triệu chứng thần kinh, đi liêu siêu hoặc bị ngã, khi nằm thì hai chân co giật. Bệnh tích đặc trưng: Vịt chết: hai chân duỗi thẳng như bơi chèo, đầu ngửa hết về phía sau. Gan sưng, nhũn, dễ nát khi ấn nhẹ. Bề mặt gan có nhiều điểm xuất huyết lan rộng không ranh giới. Viêm màng bao tim, cơ tim nhạt màu.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu

Bệnh phẩm là não, máu tim, gan, lách, phổi.

Cách lấy mẫu:

- Lấy mẫu máu tim: dùng xi lanh (4.16) có chất chống đông máu (3.12) đâm vào tim để hút lấy máu, khoảng 0,5 ml đến 1 ml, ghi ký hiệu mẫu.

- Lấy mẫu gan, lách, phổi: dùng panh, kéo (4.8) lấy khoảng 10 g đến 50 g, cho vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu.

- Lấy mẫu là não: dùng panh, kéo (4.8) bộc lộ hộp sọ thủy cầm, rồi lấy khoảng 5 g đến 10 g não cho vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu.

Mẫu bệnh phẩm nên được nuôi cấy trên môi trường càng nhanh càng tốt. Trong trường hợp phải vận chuyển đến phòng thí nghiệm thì mẫu bệnh phẩm phải được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu.

Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.

...

...

...

6.2.1  Xử lý mẫu

- Dùng panh kéo (4.8) cắt nhỏ và nghiền mẫu bệnh phẩm với nước muối sinh lý (3.11) theo tỷ lệ 1 : 9 (phần thể tích) bằng cối chày sứ (4.11).

- Dùng pipet hút huyễn dịch vừa nghiền chuyển sang 2 ống 1,5 ml. Một ống dùng để tách ADN tiến hành phản ứng PCR; ống còn lại dùng làm mẫu lưu, bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

6.2.2  Tách chiết ADN

Tách chiết ADN bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.2.3  Tiến hành

Xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong bảng 2 và bảng D.2 (xem Phụ lục D).

Bảng 2 - Cặp mồi xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer ^[3]

Gen đích

...

...

...

Trình tự từ đầu 5’ tới 3’

Kích thước sản phẩm (bp)

16S rRNA

669AF

TTA CCG ACT GAT TGC CTT CTA G

546

669AR

AGA GGA AGA CCGA GGA CAT C

- Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được quy định tại Phụ lục D

...

...

...

6.3.1  Xử lý mẫu và nuôi cấy vi khuẩn Riemerella anatipestifer

- Với mẫu máu tim được hút bằng xi lanh vô trùng: nuôi cấy vào môi trường nước thịt (3.1), môi trường thạch máu (3.2), môi trường thạch sô-cô-la (3.3), môi trường thạch MacConkey (3.8).

- Với mẫu lá gan, lách, phổi, não: sát trùng bề mặt ngoài bằng bông cồn (4.15), rồi dùng kéo (4.8) cắt sâu vào tổ chức bên trong lấy một mẫu nhỏ hoặc dùng que cấy (4.14) lấy tổ chức bên trong nuôi cấy vào môi trường nước thịt (3.1), môi trường thạch máu (3.2), môi trường thạch sô-cô-la (3.3), môi trường thạch MacConkey (3.8).

- Sau đó nuôi cấy vi khuẩn trong tủ ấm (4.1). Sau từ 24 h đến 48 h, kiểm tra kết quả nuôi cấy.

6.3.2  Phân lập vi khuẩn Riemerella anatipestifer

Sau từ 24 h đến 48 h, kiểm tra kết quả nuôi cấy:

- Môi trường nước thịt: vi khuẩn mọc yếu, không có cặn ở đáy, lắc ống nghiệm có vẩn nhẹ;

- Trên thạch máu: khuẩn lạc Riemerella anatipestifer không gây dung huyết, rìa gọn, có kích thước từ 1 mm đến 2mm, màu trắng hơi xám, nhầy, hơi ướt.

- Trên thạch Sô-cô-la: khuẩn lạc Riemerella anatipestifer mọc tốt hơn (so với trên thạch máu), không gây dung huyết, rìa gọn, có kích thước từ 1 mm đến 2mm, màu trắng hơi xám, nhầy, hơi ướt.

...

...

...

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường nước thịt (3.1) hoặc thạch máu (3.2) hoặc thạch Sô-cô-la, nuôi trong tủ ấm (4.1) để xác định hình thái vi khuẩn, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn, xác định vi khuẩn bằng phản ứng PCR.

6.4  Xác định hình thái vi khuẩn Riemerella anatipestifer

Từ canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi là vi khuẩn Riemerella anatipestifer (xem 6.3.2) tiến hành làm tiêu bản:

- Từ khuẩn lạc: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (3.11) lên phiến kính (4.17), dùng que cấy (4.14) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước muối sinh lý.

- Từ canh khuẩn (nước thịt đã nuôi cấy vi khuẩn): dùng que cấy (4.14) lấy một vòng canh khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính (4.17).

Tiêu bản được để khô và cố định trên ngọn lửa đèn cồn (4.18);

Tiêu bản được nhuộm bằng phương pháp Gram (xem Phụ lục A);

Vi khuẩn Riemerella anatipestifer bắt màu hồng (Gram âm), đa hình thái (hình cầu, hình cầu trực khuẩn, hình trực khuẩn ngắn), thường đứng riêng lẻ hay thành cặp.

6.5  Xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer bằng phản ứng sinh hóa

...

...

...

Môi trường xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Riemerella anatipestifer và cách tiến hành các phản ứng được nêu trong Phụ lục C.

Bảng 3 - Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn Riemerella anatipestifer

Tính chất

Riemerella an atipestifer

Sinh indol

±

Lên men glucose

-

Lên men lactose

...

...

...

Lên men sucrose

-

Sinh H₂S

-

Lên men mannitol

-

Khả năng di động

-

Sử dụng urê

...

...

...

Sử dụng Cimon citrat

Không mọc

Phản ứng catalase

+

Phản ứng oxidase

+

6.6  Xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer bằng phương pháp PCR

- Xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong bảng 2 và chu trình nhiệt được nêu trong bảng 5.

- Chuẩn bị mẫu và các bước tiến hành phản ứng PCR được quy định tại Phụ lục D.

...

...

...

Thủy cầm được kết luận mắc bệnh nhiễm trùng huyết khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và phân lập, xác định vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hoá hoặc phương pháp PCR dương tính với vi khuẩn Riemerella anatipestifer.

Phụ lục A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

A.1  Thuốc thử

A.1.1  Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C₂₅H₃₀N₃Cl)

2,0 g

...

...

...

20,0 ml

Amoni oxalat [(NH₄)2C₂O₄.2H₂O]

0,8 g

Nước cất

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2  Dung dịch fuchsin đậm đặc

Fuchsin basic (C₂₀H₂₀ClN₃)

1g

...

...

...

10 ml

Phenol (C₆H₆O)

5g

Nước cất

100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích)

A.1.3  Dung dịch lugol

Kali iodua (KI)

2 g

...

...

...

1 g

Nước cất

200 ml

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4  Cồn axeton

Etanol 95 % (thể tích)

3 phần

Axeton (C₂H₆O)

1 phần

...

...

...

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô.

A.3  Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (4.2).

Phụ lục B

(Quy định)

...

...

...

B.1  Môi trường nước thịt

B.1.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Môi trường nước thịt ^(*)

3,7 g

Huyết thanh (xem 3.4)

5 ml

Cao nấm men 25 % (xem 3.5)

5 ml

...

...

...

1 ml

Nước cất vừa đủ

100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: dùng môi trường BHI (Brain Heart infusion) của hãng Merck (Cat. No. 110493) 1), thành phần cho môi trường nước thịt được nêu ở mục B.1.1.

B.1.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường nước thịt ^(1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường nước thịt ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 4.3).

...

...

...

Lắc đều và chia ra ống nghiệm (4.12) khoảng 5 ml / ống.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện (xem 4.21).

B.2  Môi trường thạch máu

B.2.1  Nguyên liệu

Môi trường thạch máu: sử dụng môi trường thương mại, pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886) 2), thành phần cho môi trường thạch máu bổ sung được nêu ở mục B.2.1.

B.2.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường thạch máu cơ bản ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 4.3).

...

...

...

Lắc đều và chia ra đĩa petri (4.13) khoảng 20 ml / đĩa.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện (xem 4.21).

B.3  Môi trường thạch Sô-cô-la

Thành phần môi trường thạch Sô-cô-la:

Môi trường thạch máu cơ bản ^(**)

4g

Máu (xem 3.7)

5 ml

Huyết thanh (xem 3.4)

...

...

...

Cao nấm men 25 % (xem 3.5)

5 ml

NADH 1 % (xem 3.6)

1 ml

Nước cất vừa đủ

100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản ^(**) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Sau đó để môi trường nguội xuống khoảng 40 °C bổ sung huyết thanh, cao nấm men và NAHD.

Lắc đều và chia ra đĩa petri (4.13) khoảng 20 ml / đĩa.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện (xem 4.21).

B.4   Môi trường thạch MacConkey

B.4.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Môi trường thạch MacConkey

5 g

Nước cất vừa đủ

...

...

...

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: dùng môi trường thạch MacConkey (MacConkey agar) của hãng Merck (Cat. No. 105465) 3), thành phần cho môi trường thạch MacConkey được nêu ở mục B.4.1.

B.1.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch MacConkey (***) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường thạch MacConkey ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 4.3).

Lắc đều và chia ra đĩa petri (4.13) khoảng 20 ml / đĩa.

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện 4 °C (xem 4.21).

...

...

...

(Quy định)

Xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Riemerella anatipestifer

C.1  Môi trường và thuốc thử

C.1.1  Môi trường nước pepton

Chuẩn bị môi trường nước pepton theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.1.2  Thuốc thử Kovac’s

C.1.2.1  Thành phần

Paradimetyl aminobenzaldehyt

5g

...

...

...

75 ml

Axit clohydric đặc

25 ml

C.1.2.2  Chuẩn bị

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amyl cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 °C. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml axit clohydric đặc, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó tiếp tục bổ sung axit clohydric.

Bảo quản thuốc thử trong lọ tối màu, ở 4 °C.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử Kovac’s thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.1.3  Thuốc thử H₂O₂, 3 % (thể tích)

C.1.4  Thuốc thử Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride, 1 % (thể tích).

...

...

...

C.1.5.1  Thành phần

- Nước pepton.

- Dung dịch chỉ thị màu bromocrezol: cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % (thể tích) và lắc cho tan hết.

- Dung dịch đường: glucose, sucrose, lactose, mannitol.

Pha glucose (hoặc sucrose, lactose, mannitol) thành dung dịch 10 % (thể tích) trong nước, hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp (4.3) ở 110 °C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

C.1.5.2  Chuẩn bị

Cho 1 ml chỉ thị màu bromocrezol vào 100 ml môi trường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Vô trùng môi trường ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 4.3). Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2.

Thêm 0,4 ml dung dịch glucose 10 % (thể tích) hoặc sucrose 10 % (thể tích) hoặc lactose 10 % (thể tích) hoặc mannitol 10 % (thể tích) vào ống chứa 4 ml môi trường pepton đã có chất chỉ thị.

C.1.6  Môi trường thạch urê

...

...

...

C.1.7  Môi trường thạch lỏng kiểm tra khả năng di động

C.1.7.1  Thành phần

Pepton

10 g

Chất chiết thịt

3 g

Natri clorua (NaCl)

5 g

Thạch

...

...

...

Gelatin

80 g

Nước cất

1000 ml

C.1.7.2  Chuẩn bị

Hòa gelatin vào nước để 30 min, bổ sung các thành phần khác, đun cho tan hoàn toàn.

Chia ra các ống nghiệm (4.7), khoảng 6 ml cho mỗi ống nghiệm.

Vô trùng môi trường ở 115 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 4.3).

C.1.8  Môi trường thạch sắt ba đường -TSI (Trip-sugar Iron agar)

...

...

...

Môi trường sau khi đồng nhất bằng cách đun sôi được chia ra các ống, 6 ml môi trường cho mỗi ống.

Vô trùng môi trường ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 4.3).

Môi trường sau khi tiệt trùng được để nghiêng khoảng 30° để tạo được một phần thạch đứng và một phần thạch nghiêng.

C.2  Cách tiến hành

C.2.1  Phản ứng sinh indol

Dùng que cấy (4.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 6.3.2) cấy vào môi trường nước pepton (C.1.1). Nuôi trong tủ ấm (4.1). Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s (C.1.2) vào môi trường, lắc nhẹ.

Đọc kết quả:

- Phản ứng dương tính (sinh indol): xuất hiện vòng màu đỏ phía trên môi trường.

- Phản ứng âm tính (không sinh indol): không xuất hiện vòng màu đỏ.

...

...

...

Nhỏ một giọt dung dịch H₂O₂ (C.1.3) lên phiến kính (4.17).

Dùng que cấy (4.14) lấy khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 6.3.2) cho vào giọt dung dịch H₂O₂.

Đọc kết quả sau 5 s:

- Phản ứng dương tính: có hiện tượng sủi bọt;

- Phản ứng âm tính: không có hiện tượng sủi bọt.

C.2.3  Phản ứng oxidase

Tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride.

Dùng que cấy (4.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 6.3.2) phết lên mặt giấy đã thấm thuốc thử.

Đọc kết quả sau 30 s:

...

...

...

- Âm tính: không xuất hiện màu tím.

C.2.4  Kiểm tra đặc tính lên men đường

Dùng que cấy (4.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 6.3.2) cấy vào ống môi trường nước pepton có đường glucose (hoặc sucrose, lactose, mannitol) (xem C.1.5).

Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu vàng;

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

C.2.5  Kiểm tra khả năng phân giải urê

Dùng que cấy (4.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 6.3.2) cấy vào môi trường thạch urê (C.1.6). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng;

...

...

...

C.2.6  Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn bằng môi trường thạch lỏng

Dùng que cấy (4.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 6.3.2) cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch lỏng (C.1.7). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính (có khả năng di động): môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu;

- Phản ứng âm tính: môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu.

C.2.7  Kiểm tra khả năng lên men đường, sinh H2S trên môi trường thạch TSI

Dùng que cấy (4.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 6.3.2) cấy vào môi trường thạch TSI. Nuôi trong tủ ấm (4.1), sau 24 h đọc kết quả.

Lên men đường glucose:

- Phản ứng dương tính: phần đứng của môi trường thạch chuyển sang màu vàng;

- Phản ứng âm tính: phần đứng của môi trường thạch không chuyển màu.

...

...

...

- Phản ứng dương tính: phần nghiêng của môi trường thạch chuyển sang màu vàng;

- Phản ứng âm tính: phần nghiêng của môi trường thạch không chuyển màu.

Khả năng sinh H₂S:

- Phản ứng dương tính: đáy ống nghiệm có màu đen;

- Phản ứng âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen.

Phụ lục D

(Quy định)

Xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer bằng phương pháp PCR

...

...

...

D. 1.1  Taq PCR Master Mix Kit;

D.1.2  Cặp mồi (primers): mồi xuôi (669AF) và mồi ngược (669AR) (Bảng 2);

D.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

D.1.4  Dung dịch đệm điện di: có thể dùng dung dịch đệm TAE (Tris - Borate - Ethylenediaminetetraacetic acid) hoặc TBE (Tris - Acetate - Ethylenediaminetetraacetic acid)

D.1.5  Chất nhuộm màu ADN;

VÍ DỤ: Chất nhuộm màu SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen; hoặc chất nhuộm màu Gel Red của hãng Biotium.

KHUYẾN CÁO: Chất nhuộm màu Ethidi bromua có thể gây ung thư nên khuyến cáo không sử dụng.

D.1.6  Loading dye (Đệm tải mẫu);

D.1.7  ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker), thang 100 bp;

...

...

...

D.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi là vi khuẩn Riemerella anatipestifer (xem 6.3.2).

Mẫu đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được xác định là Riemerella anatipestifer hoặc sử dụng các chủng Riemerella anatipestifer chuẩn.

Tách chiết ADN

Tách chiết ADN bằng các kít thương mại đối với mẫu kiểm tra là huyễn dịch bệnh phẩm hoặc vi khuẩn thì các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Đối với vi khuẩn còn có thể tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt.

Phương pháp sốc nhiệt tách chiết ADN: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (4.5) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

D.3  Chuẩn bị mồi

Mồi được chuẩn bị như sau:

...

...

...

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM / μl: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (B.1.3).

VÍ DỤ: lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μl và thêm 80 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μM / μl

D.4  Tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem B.3). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen Taq PCR Mastermix kit Qiagen (Cat. No. 201443) 4), thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 5.

Bảng D.1 - Thành phần của phản ứng PCR xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer

Thành phần

Thể tích (μl)

...

...

...

12,5

Nước không có nuclease

6,5

Mồi xuôi 20 μM

0,5

Mồi ngược 20 μM

0,5

Tổng thể tích

20,0

...

...

...

- Mẫu đối chứng dương: cho 5 μl mẫu ADN của vi khuẩn Riemerella anatipestiter vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm.

- Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.6) với chu trình nhiệt như nêu trong bảng 5.

Bảng D.2 - Chu trình nhiệt xác định vi khuẩn Riemerella anatipestifer^[4]

Nhiệt độ

...

...

...

Số chu kỳ

94 °C

2 min

1 vòng

94 °C

30 s

35 vòng

54 °C

30 s

...

...

...

30 s

72 °C

10 min

1 vòng

GHI CHÚ: [4] Theo tài liệu tham khảo “Evaluation of different diagnostic tools for the detection and identification of Riemerella anatipestifef”)

CHÚ Ý: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

D.5  Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE có bổ sung chất nhuộm màu (D.1.5). Cách pha chế thạch agarose và bổ sung chất nhuộm màu, sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

...

...

...

D.6  Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương.

...

...

...

Phụ lục E

(Tham khảo)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Tirath S. Sandhu, 2008. Diseases of poultry, Chapter 19: Pasteurella and Other Respiratory Bacterial Infections - Riemerella anatipestifer infection. 12th Edition, Blackwell Publishing, p. 758 -764.

[2] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Chapter 74: Anatipestifer infection. Third edition, p.171-172.

[3] G. Kardos et al, 2007. Development of a novel PCR assay specific for Riemerella anatipestifer. Letters in Applied Microbiology, 44, p. 145 - 148.

...

...

...

[5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2011. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y, trang 439 - 443.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

4) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.