Tiêu chuẩn TCVN 14113:2024 về Định lượng Bacillus subtilis bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và PCR

• Số hiệu: TCVN14113:2024
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2024

Trình tự mồi của gen đặc hiệu được chứng minh là trình tự phù hợp để phân biệt Bacillus subtilis với các loài trong chi Bacillus và đặc biệt với các loài trong nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. velezensis, B. siamensis, B. atrophareus [3],

5.7  Hóa chất nhuộm Gram

Bộ thuốc nhuộm Gram cho vi khuẩn của các hãng được cung cấp trên thị trường. Tùy thuộc vào điều kiện thực tế để lựa chọn hóa chất phù hợp và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoặc làm theo mô tả trong TCVN 13637:2023 (ISO 21148:2017).

5.8  Hóa chất chạy điện di

Hóa chất chạy điện di bao gồm dung dịch TAE 1X, agarose và dung dịch nhuộm ADN (ví dụ Redsafe-lntron hoặc ethidium bromide). Dung dịch TAE 1X có thể sử dụng sản phẩm thương mại hoặc tự chuẩn bị theo các thành phần 40 mM Tris, 20 mM Acetate và 1 mM EDTA (pH 8.6). Agarose và chất nhuộm ADN sử dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Thang ADN chuẩn kích thước 100 bp sử dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

Chuẩn bị bản gel agarose 1,5 % với thể tích 100 mL thực hiện như sau:

1. Cân 1,5 g agarose và đưa vào bình thủy tinh có nắp vặn thể tích 250 mL.

2. Bổ sung 100 mL dung dịch TAE 1X và vặn lỏng nắp bình.

3. Đun nóng bình bằng lò vi sóng trong 2-3 min đến khi agarose tan hoàn toàn, dung dịch trong và đồng nhất. Lưu ý; nên dừng lò vi sóng sau mỗi 1 phút tránh hiện tượng trào dung dịch khỏi bình.

...

...

...

5. Chuẩn bị khuôn lược của khay điện di để trên mặt phẳng.

6. Đổ dung dịch nhẹ nhàng vào khuôn, tránh tạo bọt khí.

7. Sau 20-30 min khay gel đông đặc có thể được sử dụng ngay hoặc bảo quản cùng dung dịch TAE 1X trong điều kiện 4°C được dùng trong vòng 7 ngày.

6  Thiết bị, dụng cụ

Có thể sử dụng các dụng cụ dùng một lần thay cho các dụng cụ sử dụng nhiều lần nếu các thông số kỹ thuật tương tự.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 with amendment 1:2013)] và cụ thể như sau:

6.1  Thiết bị

6.1.1  Tủ cấy vô trùng, tủ cấy vi sinh, luồng không khí thổi theo chiều dọc.

6.1.2  Nồi hấp áp lực, có nhiệt độ hơi nước bão hòa trong buồng có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C ± 3 °C tương ứng áp suất tối thiểu 101,3 kPa.

...

...

...

6.1.4  Tủ ấm, thông gió đối lưu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 40 °C, độ chính xác đến 1

°C.

6.1.5  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,001 g.

6.1.6  Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh tự động về nhiệt độ, độ chính xác đến 1 °C.

6.1.7  Máy trộn Vortex, tốc độ lắc đạt 1000 vòng/min, lắc tròn.

6.1.8  Kính hiển vi quang học, có độ phóng đại đến 1000X.

6.1.9  Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

6.1.10  Máy PCR nguyên lý hoạt động dựa trên việc điều chỉnh nhiệt độ của các giếng trong máy từ 4-115 °C, quá trình gia nhiệt có thể lặp đi lặp lại 30-40 lần, có thể gia nhiệt ở nắp máy lên đến 115 °C.

6.1.11  Hệ thống máy điện di ngang ADN có thể điều chỉnh cường độ dòng điện và thời gian.

...

...

...

6.2  Dụng cụ

6.2.1  Bình thủy tinh có nắp vặn, có dung tích thích hợp (100 ml, 250 ml, 500 ml và 1000 ml).

6.2.2  Cốc thủy tinh, có dung tích thích hợp.

6.2.3  Ống đong nhựa có vạch chia thể tích 1 L, 500 mL

6.2.4  Ống falcon có nắp vặn, vô trùng và có dung tích 50 mL.

6.2.5  Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo hoặc bằng thép.

6.2.6  Micropipet, có dung tích 10 mL, 1 mL, 0,1 mL; sử dụng đầu tip vô trùng.

6.2.7  Ống phản ứng PCR có thể tích 200 μL vô trùng, không chứa Dnase hoặc Rnase, không bị biến dạng khi hấp khử trùng ở 121 °C.

6.2.8  Đĩa Petri, đường kính 90 mm.

...

...

...

6.2.10  Lamen, bằng thủy tinh.

7  Cách tiến hành

7.1  Nguyên tắc lấy mẫu

- Phân bón được lấy mẫu theo quy định (TCVN 12105:2018) về cách lấy mẫu, số lượng mẫu và bảo quản mẫu trước khi đưa đến phòng thử nghiệm.

- Mẫu sau khi được tiếp nhận ở phòng thử nghiệm được bảo quản theo khuyến cáo của nhà sản xuất nhằm đảm bảo sức sống của các tế bào vi khuẩn trong phân bón.

7.2  Các bước tiến hành

7.2.1.  Pha loãng mẫu thử nghiệm từ mẫu phân bón

Đối với mẫu phân bón dạng lỏng, lắc đều và dùng pipet (6.2.6) hút 10 ml, chính xác đến 10 μl vào bình thủy tinh có nắp vặn vô trùng thể tích 250 mL (6.2.1). Đối với mẫu phân bón dạng rắn, cân 10 gram vào vào bình thủy tinh có nắp vặn vô trùng thể tích 250 mL (6.2.1) bằng cân phân tích (6.1.5). Bổ sung 90 ml dung dịch pha loãng NaCl 0,85% vô trùng để thu được độ pha loãng 10^-^1. Vortex 5-10 phút (nếu mẫu chưa đồng nhất, tiếp tục ủ mẫu khoảng 5-10 phút rồi vortex).

Mẫu sau đó được đun nóng ở 80°C trong bể ổn nhiệt (6.1.6) trong 10 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật khác. Lưu ý: (1) đối với một số mẫu phân bón có chất mang là tinh bột hoặc dạng lỏng không chứa bào tử thì bỏ qua bước đun nóng ở 80°C. (2) Nếu mẫu phân bón có chứa thành phần là phân vô cơ thì mẫu ban đầu nên được pha loãng theo khuyến cáo của nhà sản xuất hoặc pha loãng trực tiếp thành 10^-2 tránh vi sinh vật bị phân bón vô cơ làm ảnh hưởng sức sống.

...

...

...

Mẫu phân bón được tiếp tục pha loãng từ 10^-^2-10^-8 trong dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % với thể tích của mỗi nồng độ pha loãng là 10 ml đựng trong ống falcon vô trùng (6.2.4) hoặc bình thủy tinh thể tích phù hợp (6.2.1).

Các mẫu pha loãng sẽ được sử dụng ngay để cấy trải trên môi trường dinh dưỡng không chọn lọc Nutrient agar.

7.2.2  Cấy trải mẫu pha loãng trên đĩa thạch và xác định mật độ ban đầu của mẫu thử nghiệm

Sử dụng 100 μl (0,1 ml) dịch đồng nhất của các mẫu pha loãng và cấy trải bằng que cấy thủy tinh (6.2.5) trên môi trường dinh dưỡng Nutrient agar, ở mỗi một nồng độ pha loãng, dịch khuẩn được cấy trải trên 3 đĩa. Sau khi cấy, đĩa được ủ ở điều kiện 35 °C trong 16-24h ở tủ nuôi (6.1.4). Sau thời gian ủ ấm, các khuẩn lạc phát triển trên bề mặt đĩa thạch. Phân nhóm khuẩn lạc dựa trên hình thái bề mặt khuẩn lạc và nhuộm gram. Lựa chọn các nhóm khuẩn là vi khuẩn gram dương (+), có hình thái của chi Bacillus sp. là khuẩn lạc màu trắng đục hoặc trắng sữa, bề mặt gồ ghề, có vân hoặc không vân. Các nhóm khuẩn lạc này được gọi là nhóm khuẩn lạc Bacillus subtilis giả định và sẽ được tiếp tục sử dụng để đánh giá ở các bước sau. Đếm số khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch của mỗi nhóm.

LƯU Ý:

- Quá trình nuôi ủ có thể kéo dài đến 48h để kiểm tra lại số khuẩn lạc của mỗi nhóm có thay đổi trên đĩa nuôi cấy hay không.

- Sau bước nuôi cấy trên, đĩa petri nồng độ thấp có thể giữ ở điều kiện 25 °C từ 20 h đến 24 h để các vân trên bề mặt khuẩn lạc phát triển rõ ràng của từng nhóm.

Nhuộm Gram. Tiến hành nhuộm gram theo mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148). Hiển thị kết quả dưới kính hiển vi quang học (6.1.8). Vi khuẩn Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) sẽ bắt màu tím hoặc xanh.

Dựa trên số lượng khuẩn lạc thu được của mỗi nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis giả định để tính mật độ của vi khuẩn của mỗi nhóm (giá trị A) [1],

...

...

...

A =

N

0,1 x (n₁ + 0,1 x n₂) x d

Trong đó:

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1g hay 1ml mẫu, được tính bằng đơn vị CFU/g (/mL))

N: tổng số khuẩn lạc giả định là Bacillus subtilis đếm được trên tất cả các đĩa Petri được giữ lại ở hai độ pha loãng liên tiếp;

0,1  thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa Petri, tính bằng mililit (mL);

n₁  số đĩa Petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

...

...

...

d  độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất được giữ lại

Làm tròn kết quả tính được đến một chữ số sau dấu phẩy. Biểu thị kết quả bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10^x, trong đó x là số mũ của 10.

Biểu thị kết quả trong trường hợp số đếm thấp hoặc trường hợp đặc biệt theo quy định trong TCVN 6404: 2016.

Lưu ý: Một mẫu thử nghiệm có thể có hơn một nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis giả định. Tất cả các nhóm Bacillus subtilis giả định sẽ được tiếp tục đánh giá ở bước sau.

7.2.3  Xác định sự có mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp phân tích gen đặc hiệu

Lựa chọn các khuẩn lạc đơn ngẫu nhiên từ các nhóm khuẩn lạc Bacillus subtilis giả định (từ đĩa của mẫu pha loãng để có nồng độ thấp). Mỗi nhóm khuẩn lạc Bacillus subtilis giả định lựa chọn 05 khuẩn lạc.

- Chuẩn bị mẫu ADN khuẩn lạc: Bổ sung 20 μl nước cất 2 lần vô trùng (nước sử dụng cho PCR) vào ống PCR vô trùng (6.2.7). Sử dụng micropipet (6.2.6) với đầu tip 10 pl để chấm vào khuẩn lạc và đưa đầu tip này hút lên hút xuống 3-5 lần trong ống. ống PCR chứa tế bào khuẩn lạc này sẽ được gia nhiệt trong máy PCR (6.1.10) với quy trình 2 bước: (1) 95 °C trong 5 phút và (2) 25 °C trong 5 phút. Sau quá trình này, mẫu được sử dụng làm ADN khuôn cho phản ứng PCR nhân gen đặc hiệu. Lưu ý, không nên sử dụng khuẩn lạc nuôi trên môi trường nuôi cấy lớn hơn 72h để tách ADN khuẩn lạc; ADN của khuẩn lạc có thể được tách chiết sử dụng các kỹ thuật tách chiết khác mà vẫn đảm bảo thu được ADN đạt chất lượng sử dụng trong phản ứng PCR (nếu phù hợp).

- Tiến hành chạy PCR với 01 cặp mồi đặc hiệu hoặc tiến hành chạy 2 mồi lần lượt trong trường hợp có sự nghi ngờ về kích thước sản phẩm đặc hiệu hoặc có sự không tương thích giữa các khuẩn lạc có cùng hình thái nhưng có kết quả khác nhau về sự có mặt của gen đặc hiệu:

+ Cặp mồi aroE-F và aroE-R, kích thước sản phẩm 278 bp hoặc

...

...

...

-Thành phần phản ứng:

Thành phần

Thể tích (μL)

H₂O

7

Mồi xuôi F (10 pmol/uL)

1

Mồi ngược R (10 pmol/uL)

1

...

...

...

10

ADN khuẩn lạc

1

Tổng thể tích

20

- Chu trình PCR áp dụng cho cả hai gen đặc hiệu cài đặt cho máy PCR (6.1.10)

Bước

Nhiệt độ

Thời gian

...

...

...

1

95 °C

3 min

1

2

94 °C

45 s

2-35

60 °C

...

...

...

72 °C

50 s

3

72 °C

5 min

36

4

25 °C

Giữ ∞

...

...

...

- Hiển thị kết quả: Chạy điện di trên gel agarose 1.5% với dòng điện có hiệu điện thế 90V trong 40 phút bằng hệ thống máy điện di ngang (6.1.11). Kích thước của sản phẩm PCR được so sánh với thang ADN chuẩn kích thước 100 bp (DNA ladder). Sau chạy điện di, gel agarose được đặt dưới tia uv của máy soi gel (6.1.12). Nếu mẫu phản ứng cho sản phẩm đặc hiệu đúng kích thước của gen đặc hiệu (aroE = 278 bp và pycA = 233 bp) thì khẳng định mẫu khuẩn lạc đó là vi khuẩn Bacillus subtilis. Nếu mẫu phản ứng không có sản phẩm đặc hiệu thì khẳng định mẫu khuẩn lạc đó không phải là Bacillus subtilis.

- Xác định tỷ lệ khuẩn lạc có sản phẩm PCR của trình tự gen đặc hiệu (B) .

B =

b

5

trong đó: B: tỷ lệ khuẩn lạc có sản phẩm PCR của trình tự gen đặc hiệu của Bacillus subtilis.

b  là số khuẩn lạc đã được khẳng định là Bacillus subtilis.

8  Tính và biểu thị kết quả

...

...

...

M = A x B

Trong đó:

M: số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis của mỗi nhóm Bacillus subtilis giả định trong một đơn vị kiểm tra, được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gam hay mililit (CFU/g (/mL)

A: số lượng vi khuẩn của một nhóm Bacillus subtilis giả định trong một đơn vị kiểm tra, được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gam hay mililit (CFU/g (/mL) (7.2.2)

B: tỷ lệ khuẩn lạc có sản phẩm phản ứng PCR của gen đặc hiệu cho Bacillus subtilis (7.2.3)

- Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis trong mẫu thử nghiệm bằng tổng số lượng vi khuẩn của các nhóm Bacillus subtilis được khẳng định.

∑M = M1 +...+ Mi (đơn vị CFU/g (/mL)

trong đó

∑M: tổng số lượng vi khuẩn của các nhóm Bacillus subtilis khẳng định được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gam hay mililit (CFU/g (/mL)

...

...

...

- Làm tròn kết quả được tính đến một chữ số sau dấu phẩy. Biểu thị kết quả bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10^x, trong đó x là số mũ của 10.

- Biểu thị kết quả trong trường hợp số đếm thấp hoặc trường hợp đặc biệt theo quy định trong TCVN 6404:2016.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) Tất cả thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết)

c) Phương pháp thử nghiệm đã dùng hoặc viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) Các kết quả thử nghiệm thu được ở các bước định tính và định lượng.

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào và sản phẩm PCR của gen đặc hiệu

A.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis

Hình A1. Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường Nutrient agar, nuôi cấy ở 35°C trong 24 giờ

A.2  Đặc điểm hỉnh thái tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis khi nhuộm gram

Hình A2. Hình ảnh nhuộm gram của vi khuẩn Bacillus subtilis

...

...

...

A.3  Đặc điểm sản phẩm PCR của gen đặc hiệu của vi khuẩn Bacillus subtilis

Hình A3. Kết quả chạy điện di trên gel agarose 1,5% sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu của gen aroE (278 bp) trên 05 khuẩn lạc giả định (K1-K5).

Trình tự mồi của gen đặc hiệu được chứng minh là trình tự phù hợp để phân biệt các loài trong nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm Bacillus subtills, B. amyloliquefaciens, B. velezensis, B. siamensis, B. atrophareus [3].

Hình A4. Kết quả chạy diện di trên gel agarose 1,5% sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu của gen pycA (233 bp) trên chủng chuẩn Bacillus subtilis

Trình tự mồi của gen đặc hiệu được chứng minh là trình tự phù hợp để phân biệt các loài trong nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. velezensis, B. siamensis, B. atrophareus [3].

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] UK Standards for Microbiology Investigations: Identification of Bacillus species (2018). Bacteriology - Identification | ID 9 | Issue no: 3.1.

[3] Lee, G., Heo, S., Kim, T., Na, H.-E., Park, J., Lee, E., Lee, J.-H. and Jeong, D.-W. (2022). Discrimination of Bacillus subtilis from other Bacillus Species Using Specific Oligonucleotide Primers for the Pyruvate Carboxylase and Shikimate Dehydrogenase Genes. Journal of Microbiology and Biotechnology 32(8): 1011-1016.