Tiêu chuẩn TCVN 14110:2024 về Xác định hàm lượng vitamin nhóm K bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

• Số hiệu: TCVN14110:2024
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2024

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14110:2024

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN NHÓM K BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Fertilizers - Determination of vitamin K group content by high performance liquid chromatography (HPLC)

Lời nói đầu

TCVN 14110:2024 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN NHÓM K BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Fertilizers - Determination of vitamin K group content by high performance liquid chromatography (HPLC)

...

...

...

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin nhóm K (bao gồm các vitamin K₁, K₂, K₃, K₄) trong phân bón bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đối với mẫu thử có hàm lượng từng loại vitamin nhóm K từ 20 mg/kg trở lên.

Đối với vitamin K₂ chỉ xác định ở dạng MK4.

Thông tin giới thiệu hoạt chất vitamin nhóm K xem Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là cần thiết để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 9846:2018, Phân bón - Lấy mẫu.

TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991), Phân bón rắn - Phương pháp chuẩn bị mẫu để xác định các chỉ tiêu hóa học và vật lý.

TCVN 12105:2018, Phân bón vi sinh vật - Lấy mẫu.

...

...

...

Mẫu thử được xử lý bằng enzym, sau đó được chiết bằng dung môi hữu cơ. Hàm lượng các vitamin K được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng cột sắc ký pha đảo C18 với detector tử ngoại (UV) ở bước sóng 235 nm (đối với vitamin K₃ và K₄) và 246 nm (đối với vitamin K₁ và K₂). Kết quả định lượng được xác định dựa vào phương pháp đường chuẩn.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, nước dùng trong quá trình phân tích đạt loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc có độ tinh khiết tương đương trừ khi có quy định khác.

4.1  Chất chuẩn vitamin K₁ (phytonadione) (C₃₁H₄₆O₂), được chứng nhận hàm lượng.

4.2  Chất chuẩn vitamin K₂ (menatetrenone) (C₃₁H₄₀O₂), được chứng nhận hàm lượng.

4.3  Chất chuẩn vitamin K₃ (menadione) (C₁₁H₈O₂), được chứng nhận hàm lượng.

4.4  Chất chuẩn vitamin K₄ (acetomenaphthone) (C₁₅H₁₄O₄), được chứng nhận hàm lượng.

4.5  n-Hexan (C₆H₁₄).

4.6  Etanol (C₂H₆O).

...

...

...

4.8  Metanol (CH₄O), dùng cho sắc ký lỏng.

4.9  Axit axetic (C₂H₄O₂), ≥ 99%.

4.10  Tetrahydrofuran (C₄H₈O).

4.11  Dietyl ete (C₄H₁₀O).

4.12  Kali dihydro photphat (KH₂PO₄).

4.13  Kali hydroxit (KOH).

4.14  Kali cacbonat (K₂CO₃).

4.15  Lipaza loại VII

Ví dụ, sản phẩm từ Candida rugosa, có hoạt độ 1000 U/mg hoặc loại thay thế khác phù hợp, các nguồn enzym khác từ các loài Pseudomoonas và Rhizopus nhưng cần xem xét đến hoạt độ của enzym.

...

...

...

Dùng cân kỹ thuật (5.14) cân khoảng 5,6 g kali hydroxit (4.13) vào cốc thủy tinh dung tích 100 ml (5.1), thêm 50 ml nước để hòa tan, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức dung tích 100 ml (5.2), định mức đến vạch bằng nước.

4.17  Dung dịch đệm photphat, pH từ 7,9 đến 8,0.

Dùng cân kỹ thuật (5.14) cân khoảng 54,0 g kali dihydro photphat (4.12) hòa tan vào 350 ml nước trong cốc thủy tinh dung tích 500 ml (5.1). Điều chỉnh pH đến giá trị từ 7,9 đến 8,0 bằng dung dịch kali hydroxit (4.16) và pha loãng đến 500 ml bằng nước.

4.18  Thuốc thử ancol

Dùng ống đong (5.9) thêm lần lượt 950 ml etanol (4.6) và 50 ml metanol (4.8) vào cốc thủy tinh dung tích 1000 ml (5.1), khuấy đều.

4.19  Dung dịch pha động

Dùng ống đong (5.9) thêm lần lượt 750 ml axetonitril (4.7), 250 ml metanol (4.8) và 50ml tetrahydrofuran (4.10) vào cốc thủy tinh dung tích 2000 ml (5.1). Dùng pipet (5.3) thêm 0,4 ml axit axetic (4.9) vào dung dịch, khuấy đều, siêu âm khử bọt khí trước khi sử dụng.

4.20  Dung dịch chuẩn gốc

4.20.1  Dung dịch chuẩn gốc vitamin K₁, nồng độ 1000 mg/l

...

...

...

Dung dịch chuẩn được lưu giữ trong bình tối màu và bảo quản ở nhiệt độ -20 °C và cần được kiểm tra trước khi sử dụng.

4.20.2  Dung dịch chuẩn gốc vitamin K₂, nồng độ 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g chất chuẩn K₂ (4.2), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức dung tích 10 ml (5.2), hoà tan và định mức đến vạch bằng etanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

Dung dịch chuẩn được lưu giữ trong bình tối màu và bảo quản ở nhiệt độ -20 °C và cần được kiểm tra trước khi sử dụng.

4.20.3  Dung dịch chuẩn gốc vitamin K₃, nồng độ 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g chất chuẩn K₃ (4.3), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức dung tích 10 ml (5.2), hoà tan và định mức đến vạch bằng etanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

Dung dịch chuẩn được lưu giữ trong bình tối màu và bảo quản ở nhiệt độ -20 °C và cần được kiểm tra trước khi sử dụng.

4.20.4  Dung dịch chuẩn gốc vitamin K₄, nồng độ 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g chất chuẩn K₄ (4.4), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức dung tích 10 ml (5.2), hoà tan và định mức đến vạch bằng etanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

...

...

...

4.21  Dung dịch chuẩn trung gian vitamin K₁, K₂, K₃, K₄

4.21.1  Dung dịch chuẩn trung gian vitamin K₁ và K₂, nồng độ 100 mg/l

Dùng pipet (5.3) hút lần lượt 1 ml dung dịch chuẩn gốc vitamin K₁ (4.20.1) và 1 ml dung dịch chuẩn gốc vitamin K₂ (4.20.2) vào bình định mức dung tích 10 ml (5.2), định mức đến vạch bằng etanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn này trong ngày sử dụng.

4.21.2  Dung dịch chuẩn trung gian vitamin K₃ và K₄, nồng độ 100 mg/l.

Dùng pipet (5.3) hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc vitamin K₃ (4.20.3) và vitamin K₄ (4.20.4) vào bình định mức dung tích 10 ml (5.2), định mức đến vạch bằng etanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn này trong ngày sử dụng.

4.22  Dãy dung dịch chuẩn làm việc

4.22.1  Dung dịch chuẩn làm việc vitamin K₁, K₂, nồng độ 1 mg/l; 2 mg/l; 5 mg/l; 10 mg/l; 20 mg/l.

...

...

...

Chuẩn bị dung dịch chuẩn này trong ngày sử dụng.

4.22.2  Dung dịch chuẩn làm việc vitamin K₃ và K₄, nồng độ 1 mg/l; 2 mg/l; 5 mg/l; 10 mg/l; 20 mg/l.

Dùng pipet (5.3) hút chính xác lần lượt 0,1 ml; 0,2 ml; 0,5 ml; 1 ml; 2 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.21.2) vào lần lượt 5 bình định mức dung tích 10 ml (5.2), định mức đến vạch bằng etanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn này trong ngày sử dụng.

5  Dụng cụ, thiết bị

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

5.1  Cốc thủy tinh, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml; 2000 ml.

5.2  Bình định mức, dung tích 10 ml; 20 ml; 100 ml.

5.3  Pipet, pipet thủy tinh chia vạch dung tích 1 ml; 5 ml; 10 ml; 20 ml và micropipet thể tích 100-1000 μl.

...

...

...

5.5  Đầu lọc, có kích thước lỗ 0,45 μm.

5.6  Bể siêu âm.

5.7  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,00001 g.

5.8  Xyranh, dung tích 1 ml.

5.9  Ống đong, dung tích 50 ml; 1000 ml.

5.10  Phễu chiết, dung tích 50 ml.

5.11  Phễu lọc, đường kính từ 6 cm đến 10 cm.

5.12  Giấy lọc chậm, giấy lọc băng xanh, giấy lọc Whatman số 42 hoặc tương đương.

5.13  Bình tam giác, dung tích 50 ml; 100 ml có nút nhám.

...

...

...

5.15  Bể ổn nhiệt, có khả năng ổn định nhiệt độ ở 37 °C ± 2 °C.

5.16  Máy đo pH, có độ nhạy tối thiểu là 0,1 đơn vị pH.

5.17  Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, được trang bị như sau:

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại (UV)

- Máy tích phân hoặc máy vi tính

- Cột pha đảo C18, có chiều dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, cỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương.

- Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng tay.

6  Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1  Lấy mẫu

...

...

...

6.2  Chuẩn bị mẫu

6.2.1  Mẫu dạng rắn

Mẫu dạng rắn được chuẩn bị theo TCVN 10683 : 2015.

6.2.2  Mẫu dạng lỏng, dạng huyền phù

Mẫu dạng lỏng, dạng huyền phù thì phải lắc đồng nhất trước khi cân.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

7.1.1  Xử lý mẫu thử

Dùng cân phân tích (5.7) cân ít nhất 4 phần mẫu thử mỗi phần khoảng 2 g, chính xác đến 0,0001 g vào bình tam giác dung tích 100 ml (5.13), sau đó dùng pipet (5.3) thêm 15 ml nước ở 40 °C, đặt vào bể siêu âm (5.6) trong 10 min. Dùng pipet (5.3) thêm 5 ml đệm photphat có pH 7,9 đến 8,0 (4.17), lắc đều. Thêm 1,0 g lipaza (4.15), lắc đều, để phân tán trong khoảng từ 2 min đến 3 min. Ủ hỗn hợp trong bể ổn nhiệt (5.15) ở nhiệt độ 37 °C ± 2 °C trong 2h, cứ sau 20 min thì lắc mạnh hỗn hợp -Hỗn hợp A.

...

...

...

Để nguội hỗn hợp A đến nhiệt độ phòng, chuyển toàn bộ hỗn hợp A vào phễu chiết (5.10), dùng pipet (5.3) thêm 10 ml thuốc thử ancol (4.18), 1,0 g kali cacbonat (4.14) và lắc đều. Sau đó thêm chính xác 20 ml n-hexan (4.5) và lắc mạnh. Để yên cho tách pha ở nơi tối. Thu toàn bộ pha n-hexan vào bình định mức dung tích 20 ml (5.2), định mức đến vạch bằng n-hexan (4.5). Dùng pipet (5.3) lấy chính xác 10 ml của pha n-hexan đưa vào ống nghiệm, đem loại bỏ dung môi dưới dòng nitơ đến gần khô, thêm 5 etanol (4.6) để hòa tan, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức dung tích 10 ml, tráng rửa ống nghiệm bằng etanol (4.6) và định mức tới vạch bằng etanol (4.6). Đây là dung dịch mẫu thử cuối cùng được dùng để phân tích HPLC, lọc qua đầu lọc (5.5) bằng xyranh (5.8) trước khi bơm vào thiết bị nếu cần.

7.1.3  Chiết mẫu để xác định hàm lượng vitamin K₃ và K₄

Để nguội hỗn hợp A đến nhiệt độ phòng, chuyển toàn bộ hỗn hợp A vào phễu chiết (5.10), dùng pipet (5.3) thêm 10 ml thuốc thử ancol (4.18), 1,0 g kali cacbonat (4.14) và lắc đều. Sau đó thêm chính xác 20 ml hỗn hợp n-hexan (4.5) và dietyl ete (4.11) với tỷ lệ thể tích 1 : 1 và lắc mạnh. Để yên cho tách pha ở nơi tối. Thu toàn bộ pha n-hexan : dietyl ete vào bình định mức dung tích 20 ml (5.2), định mức đến vạch bằng n-hexan (4.5). Dùng pipet (5.3) lấy chính xác 10 ml của pha n-hexan : dietyl ete đưa vào ống nghiệm, đem loại bỏ dung môi dưới dòng nitơ đến gần khô, thêm 5 etanol (4.6) để hòa tan, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức dung tích 10 ml, tráng rửa ống nghiệm bằng etanol (4.6) và định mức tới vạch bằng etanol (4.6). Đây là dung dịch mẫu thử cuối cùng được dùng để phân tích HPLC, lọc qua đầu lọc (5.5) bằng xyranh (5.8) trước khi bơm vào thiết bị nếu cần.

7.2  Điều kiện phân tích

7.2.1  Điều kiện phân tích vitamin K₁ và K₂

Pha động: theo 4.19

Bước sóng: 246 nm

Tốc độ dòng: 1,2ml/min

Thể tích bơm mẫu: 20 μl

...

...

...

7.2.2  Điều kiện phân tích vitamin K₃ và K₄

Pha động: dung dịch pha động (4.19) : nước = 60 : 40 (theo thể tích)

Bước sóng: 235 nm

Tốc độ dòng: 1,2ml/min

Thể tích bơm mẫu: 20 μl

Nhiệt độ buồng cột: 45 °C

CHÚ THÍCH: Tỷ lệ thành phần pha động có thể thay đổi tùy theo nền mẫu và phải được đánh giá sự thay đổi này trước khi áp dụng.

7.3  Dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn (tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn) của các vitamin nhóm K tại 5 điểm có nồng độ tương ứng với dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.22).

...

...

...

Dùng xyranh (5.4) bơm dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 1 mg/ml (4.22) cho đến khi số đo diện tích của pic mẫu chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 %. Sau đó, bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc (4.22) nồng độ từ thấp đến cao và dung dịch mẫu thử (7.1). Nếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử bằng etanol (4.6).

8  Tính kết quả

Hàm lượng của từng loại vitamin K trong mẫu, X_i, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức 1:

(1)

Hàm lượng vitamin K tổng số (bao gồm các vitamin K₁, K₂, K₃, K₄) trong mẫu, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức 2:

X = ∑X_i    (2)

Trong đó:

X_0i là nồng độ của vitamin K_i trong mẫu tính theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lit (mg/l);

...

...

...

V_A là thể tích của dịch chiết được đem đi loại bỏ dung môi, tính bằng mililit (ml);

V_B là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

h là hệ số pha loãng của mẫu thử trong trường hợp phải pha loãng nếu nồng độ mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn (7.4);

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

P_i là độ tinh khiết của chất chuẩn.

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song, lấy 2 chữ số có nghĩa sau dấu phẩy. Nếu sai lệch giữa các lần thử lớn hơn 5% giá trị tương đối thì phải tiến hành làm lại.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

...

...

...

c) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

d) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin về hoạt chất vitamin K

A.1  Giới thiệu hoạt chất vitamin K₁

- Công thức cấu tạo:

...

...

...

Phytomenadione

- Tên hoá học:

2-methyl-3-[(E,7R,11 R)-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-enyl]naphthalene-1,4-dione

- Công thức phân tử:

C₃₁H₄₆O₂

- Khối lượng phân tử:

450,7 g/mol

- Nhiệt độ nóng chảy:

-20 °C

...

...

...

140 °C

- Độ tan:

tan dễ dàng trong chloroform, n-hexan; tan trong các dung môi hữu cơ như etanol, dimethyl sulfoxide và dimethyl formanmide khoảng 25 mg/ml và không tan trong nước.

- Dạng bên ngoài:

chất lỏng màu vàng trong suốt

A.2  Giới thiệu hoạt chất vitamin K₂

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất:

...

...

...

- Tên hoá học:

2-methyl-3-[(2E,6E,10E)-3,7,11,15-tetramethylhexadeca-2,6,10,14-tetraenyl]naphthalene-1,4-dione

- Công thức phân tử:

C₃₁H₄₀O₂

- Khối lượng phân tử:

444,6 g/mol

- Độ tan:

tan dễ dàng trong n-hexane, tan trong etanol, tan ít trong metanol và không tan trong nước

- Dạng bên ngoài:

...

...

...

A.3  Giới thiệu hoạt chất vitamin K₃

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất:

menadione

- Tên hoá học:

2-methylnaphthalene-1,4-dione

- Công thức phân tử:

C₁₁H₈O₂

...

...

...

172,18 g/mol

- Độ tan:

không tan trong nước, tan dễ dàng trong n-hexane tan trong etanol (1g/60ml), benzene (1g/10ml)

- Dạng bên ngoài:

tinh thể màu vàng

A.4  Giới thiệu hoạt chất vitamin K₄

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất:

...

...

...

- Tên hoá học:

(4-acetyloxy-3-methylnaphthalen-1-yl) acetate

- Công thức phân tử:

C₁₅H₁₄O₄

- Khối lượng phân tử:

258,27 g/mol

- Nhiệt độ nóng chảy:

113 °C

- Nhiệt độ sôi:

...

...

...

- Độ tan:

tan dễ dàng trong n-hexane, tan trong dimethyl sulfoxide (48,9 mg/ml), etanol (22,7 mg/ml) và không tan trong nước

- Dạng bên ngoài:

tinh thể màu trắng

Phụ lục B

(Tham khảo)

Thông tin về sắc ký đồ điển hình, hiệu suất thu hồi và giới hạn định lượng của hoạt chất vitamin K

B.1  Sắc ký đồ của hoạt chất vitamin K

...

...

...

Hình B1 - Sắc ký đồ của chất chuẩn vitamin K₁ và K₂ MK4 nồng độ khoảng 5 mg/l

Hình B2 - Sắc ký đồ mẫu thử vitamin K₁ và K₂ MK4

Hình B3 - Sắc ký đồ của chất chuẩn vitamin K₃ và K₄ nồng độ khoảng 20 mg/l

Hình B4 - Sắc ký đồ của mẫu thử vitamin K₃ và K₄

B.2  Hiệu suất thu hồi và giới hạn định lượng

- Hiệu suất thu hồi vitamin K₁ ở mức nồng độ 20 mg/kg: từ 94,8% đến 98,0%

...

...

...

- Hiệu suất thu hồi vitamin K₃ ở mức nồng độ 20 mg/kg: từ 89,9% đến 99,9%

- Hiệu suất thu hồi vitamin K₄ ở mức nồng độ 20 mg/kg: từ 97,6% đến 104,7%

- Giới hạn định lượng của phương pháp với từng loại vitamin nhóm K: 20 mg/kg.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Siji Joseph, “Analysis of fat-soluble vitamins from food matrix for nutrition lebeling”, Agilent Application Note, publication number: 5990-8668EN.

[2] TCVN 8974:2011 (EN 14148:2003) về Thực phẩm - Xác định vitamin K₁ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

[3] AOAC Official Method 999.15 Vitamin K in Milk and Infant Formulas Liquid Chromatographic Method, 1999.