TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 13917-4:2024
PHÁT
HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT
BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR PHẦN 4: SỰ KIỆN NGÔ CHUYỂN GEN MON
87427
Detection and quatification of
genetically modified plants and products derived from genetically modified
plants by real-time PCR. Part 4: Maize event MON87427
Lời nói đầu
TCVN 13917-4:2024 do Viện Di truyền Nông nghiệp biên
soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường
Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 13917:2023-2024 Phát hiện và định lượng thực
vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen bằng phương
pháp real-time PCR gồm có các phần sau đây:
-TCVN 13917-1:2023, Phần 1. Yêu cầu chung;
- TCVN 13917-2:2023, Phần 2; Sự kiện ngô chuyển gen MIR 604;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- TCVN 13917-4:2024, Phần 4: Sự kiện ngô chuyển gen MON
87427;
- TCVN 13917-5:2024, Phần 5: Sự kiện ngô chuyển gen
MON 87460.
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG THỰC
VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP REAL-TIME PCR PHẦN 4: SỰ KIỆN NGÔ CHUYỂN GEN MON 87427
Detection and quatification of
genetically modified plants and products derived from genetically modified
plants by real-time PCR. Part 4: Maize event MON 87427
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp real-time PCR (phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực) để phát hiện và định
lượng sự kiện MON 87427 trong ngô (Zea mays L.) và sản phẩm có nguồn gốc
từ ngô.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp
dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản
được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản
mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu
có).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
TCVN 7606 (ISO 21571) Thực phẩm - Phương
pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Tách
chiết axit nucleic.
TCVN 7608 (ISO 24276) Thực phẩm - Phương
pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến
đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa.
TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016), Phân tích dấu ấn
sinh học phân tử - Thuật ngữ và định nghĩa
TCVN 13917-1 Phát hiện và định lượng thực vật biến
đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen bằng phương pháp real-time PCR - Phần 1: Yêu cầu chung.
3 Thuật ngữ và chữ viết tắt
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và chữ viết
tắt sau đây:
3.1
ADN (Axit deoxyribonucleic)
Polymer của các deoxyribonucleotide dạng sợi đổi hoặc sợi đơn là chất mang thông tin
di truyền, được mã hóa theo chuỗi các base (các
hợp chất vòng nitơ có trong purin hoặc pyrimidin) và có trong nhiễm sắc thể và vật liệu nhiễm sắc thể của các
bào quan.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.2
DNAse (Deoxyribonuclease)
Emzym xúc tác thủy phân axit deoxyribonucleic.
[NGUỒN: 3.36 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]
3.3
Sự kiện (Event)
Cấu trúc trao đổi gen và vị trí duy nhất chèn vào bộ
gen.
[NGUỒN: 3.9 của TCVN 13917-1]
3.4
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Quy trình enzyme kết hợp khuếch đại in vitro
các đoạn ADN đặc
hiệu với việc phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình khuếch đại.
[NGUỒN: 3.11 của TCVN 13917-1]
3.5
dNTP (deoxyribonucleotide triphosphat)
Thuật ngữ di truyền liên quan đến deoxyribonucleotide
gồm deoxyadenosine nucleotide
triphosphate (dATP),
deoxycytidine nucleotide
triphosphate (dCTP),
deoxyguanosine nucleotide
triphosphate (dGTP),
deoxythymidine nucleotide
triphosphate (dTTP)
và deoxyuridine nucleotide
triphosphate (dUTP).
[NGUỒN: 3.39 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]
3.6
UNG (Uracil N-glycosylate)
Enzym loại uracil
ra khỏi các
trình tự axit nucleic có chứa deoxyuridine của ADN
sợi đơn hoặc sợi đôi, để lại các vị trí apyrimidinic.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.7
Mẫu chuẩn (Reference material - RM)
Vật liệu hoặc chất có một hay nhiều giá trị, về tính
chất của nó được xác định đủ đồng nhất để sử dụng trong đánh giá phương pháp đo
hoặc để ẩn định các giá trị của vật liệu.
[NGUỒN: 3.12 của TCVN 13917-1]
3.8
Mẫu chuẩn chứng nhận (Certified reference-material - CRM)
Mẫu chuẩn có kèm theo giấy chứng nhận, trong đó một
hay nhiều giá trị về tính chất của nó được chứng nhận theo một thủ tục có hiệu
lực, được xác nhận bởi giấy chứng nhận hoặc bởi các tài liệu khác do cơ quan chứng nhận cấp.
[NGUỒN: 3.13 của TCVN 13917-1]
3.9
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Điểm của đường khuếch đại mà tại
đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên trên đường nền hoặc vượt qua ngưỡng cài đặt đã
xác định trước.
[NGUỒN: 3.16 của TCVN 13917-1]
3.10
Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection - LOD)
Lượng tối thiểu hay nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có
thể phát hiện được nhưng không cần thiết phải định lượng, như đã được chứng
minh bằng thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác.
[NGUỒN: 3.17 của TCVN 13917-1]
3.11
Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification - LOQ)
Nồng độ nhỏ nhất hay lượng chất phân tích nhỏ nhất
trong mẫu thử có thể được định lượng với mức chấp nhận về độ chụm và độ chính
xác.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.12
Độ không đảm bảo đo (umeas) (Uncertainty of measurement - umeas)
Thông số không âm đặc trưng cho sự phân tán của các
giá trị đại lượng được quy cho đại lượng đo, trên cơ sở thông tin đã sử dụng.
[NGUỒN: 3.106 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]
4 Nguyên tắc
Phân tích ADN gồm hai phần:
a) Phát hiện đoạn ADN đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen
MON 87427 kích thước 95 bp bằng real-time PCR.
b) Định lượng hàm lượng ADN sự kiện ngô chuyển gen MON
87427, sử dụng đồng thời với các mồi và đoạn dò đặc hiệu taxon để khuếch đại đoạn 79 bp của gen hmg A trong các vật liệu ngô chuẩn và mẫu
thử nghiệm.
Các sản phẩm PCR tích lũy được đo ở mỗi chu trình (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu
trình tự đích được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang FAM và TAMRA.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5 Thuốc thử
5.1 Yêu cầu chung
Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem 6.6
trong TCVN 7608 (ISO 24276).
Thuốc thử phân tích phải là loại thuốc thử tinh khiết
thích hợp dùng cho sinh học phân tử, không chứa ADN và DNAse, sử dụng thuốc thử phải tuân theo hướng
dẫn của nhà sản xuất.
5.2 Nước, nước cất hai lần, nước đã khử ion hoặc nước có chất lượng
tương đương.
5.3 Đệm phản ứng, có chứa chuẩn thụ động ROX, 2x
5.4 Dung dịch magie clorua (MgCI2), c = 25 mmol/L.
5.5 Dung
dịch deoxyribonucleosit triphosphat (dNTP) chứa dATP, dCTP, dGTP, dUTP, c = 2,5
mmol/ L (mỗi loại).
5.6 Các oligonucleotid
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng 1 - Các oligonucleotid
Tên
Trình tự oligonucleotid
Nồng độ cuối trong PCR
Trình tự mồi cho gen đích taxon hmg
Zm hmg-F
5’-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3’
300 nmol/L
Zm hmg-R
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
300 nmol/L
Đoạn dò hmg
5’-FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-TAMRA-3' a
160 nmol/L
Trình tự mồi cho gen đích MON 87427
MON87427-F
5’- ACGGAAACGGTCGGGTCAAATG -3'
450 nmol/L
MON87427-R
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
450 nmol/L
Đoạn dò MON87427
5-FAM- TCGGGACAATATGGAGAAAAAGAAAGAG -TAMRA-3’a
200 nmol/L
a FAM: 6-carboxylfluorecein (thuốc nhuộm reporter); TAMRA: 6 arboxytetramethylrhodamine
(thuốc nhuộm quencher)
Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu gen hmg là 79
bp; kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 là 95 bp.
Có thể sử dụng thuốc nhuộm reporter
và/hoặc thuốc
nhuộm quencher tương tự nếu cho các kết quả
tương đương hoặc tốt hơn.
5.7 Enzym
ADN polymerase chịu nhiệt
5.8 Uracil
N-glycosylase
(UNG), tùy
chọn, để giảm thiểu nhiễm chéo PCR.
6 Thiết bị, dụng cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phù hợp cho các thử nghiệm
sinh học phân tử trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.
6.2 Máy ly tâm
Sử dụng các loại máy ly tâm có tốc độ quay tối đa từ
6.800 rpm đến 18.000 rpm, lực ly tâm tối đa từ RCF 2680 xg đến 27.070 xg.
6.3 Máy chu trình nhiệt real-time
Thiết bị khuếch đại ADN in vitro và thực hiện các chu trình nhiệt độ-thời
gian cần thiết cho PCR. Ngoài ra, thiết bị phải có khả năng kích thích các phân
tử huỳnh quang ở các bước sóng quy định và
phát hiện đù ánh sáng huỳnh quang phát xạ của chất đánh dấu huỳnh quang được
dùng để thực hiện các phân tích định dạng TaqMan.
6.4 Ống phản ứng, phù hợp với mỗi máy chu trình
nhiệt real-time.
6.5 Pipetman, có các dung tích phù hợp
7 Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Đối
với hạt ngô và sản phẩm từ ngô, nên lấy
mẫu theo TCVN 9027 (ISO 24333) Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu. Đối
với các sản phẩm khác, lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể có liên quan. Nếu chưa có
tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì
các bên có
liên quan nên thoả thuận với nhau về vấn đề này.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện, mẫu
không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
- Chuẩn bị phần mẫu thử theo 5.1 của TCVN 7606 (ISO
21571)
- Tách chiết/tinh sạch theo 5.2 của TCVN 7606 (ISO
21571). Nên tiến hành tách chiết/tinh sạch ADN theo các phương pháp nêu trong
phụ lục A của TCVN 7606 (ISO 21571).
- Định lượng ADN đã tách chiết/tinh sạch theo 5.3 của
TCVN 7606 (ISO 21571). Nên tiến hành định lượng ADN đã tách chiết/tinh sạch
theo các phương pháp nêu trong phụ lục B của TCVN 7606 (ISO 21571).
ADN đã tách chiết/tinh sạch được đánh giá độ tinh sạch
theo Điều 6.3 của TCVN 13917-1.
9 Cách tiến hành
9.1 Thiết lập real-time PCR [2]
Chuẩn bị hỗn hợp real-time PCR cho trình tự đích đặc hiệu taxon hmg và trình tự đích đặc hiệu MON 87427 phải được thực hiện
trong các ống riêng biệt.
Phương pháp này sử dụng tổng thể tích hỗn hợp phản ứng
là 25 μL cho mỗi phản ứng real-ltime
PCR, với các thành phần thuốc thử như trong Bảng 2a, 2b. Thuốc thử phải được rã
đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. Mỗi loại thuốc thử phải được trộn cần thận và
ly tâm (trong thời gian 20 - 30 giây ở
tốc độ từ 6000 rpm trở lên) trước khi lấy bằng pipet.
Hỗn hợp thuốc thử PCR được chuẩn bị có chứa tất cả các thành phần trừ ADN mẫu thử. Tổng lượng hỗn hợp thuốc thử
PCR cần được chuẩn bị phụ thuộc vào số phản ứng cần thực hiện, bao gồm ít nhất
một lượng dư được lấy bằng pipet để dự phòng cho phản ứng bổ sung, số lượng mẫu
thử và các phép kiểm chứng lặp lại theo Điều 7.2 của TCVN 13917-1:2023. Thành
phần hỗn hợp phản ứng real-time
được nêu trong Bảng
2a và 2b.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tên thành phần
Nồng độ cuối cùng trong PCR
Nồng độ gốc
Thể tích trên mẫu
μL
Tổng thể tích phản ứng
25
Khuôn mẫu ADN (tối đa 200 ng)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5
Enzym ADN polymerase
chịu nhiệt
Master Mixc
(ví dụ TaqMan Universal PCR Master Mix 2x)
2x
12,5
Uracil N-glycosylase
Đệm phản ứng (chứa chuẩn nội thụ động ROX)b
Hỗn hợp dNTP
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Zm hmg-F
300 nmol/L
10 mmol/L
0,75
Zm hmg-R ,
300 nmol/L
10 mmol/L
0,75
Đoạn dò hmg
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10 mmol/L
0,4
Nước
Thêm đến 25
b ROX: carboxyl-X-rhodamine
c Dung dịch Master
Mix 2x phù hợp
với từng loại máy chu trình nhiệt real-time
Bảng 2b - Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time cho trình tự đích đặc hiệu
MON 87427
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nồng độ cuối cùng trong PCR
Nồng độ gốc
Thể tích trên mẫu
μL
Tổng thể tích phản ứng
25
Khuôn mẫu ADN (tối đa 200 ng)
40 ng/µl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Enzym ADN polymerase
chịu nhiệt
Master Mixc
(ví dụ TaqMan Universal PCR Master Mix 2x)
2x
12,5
Uracil N-glycosylase
Đệm phản ứng (chứa chuẩn nội thụ động ROX)b
Hỗn hợp dNTP
MgCI2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
450 nmol/L
10 mmol/L
1,125
MON87427-R
450 nmol/L
10 mmol/L
1,125
Đoạn dò MON87427
200 nmol/L
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5
Nước
Thêm đến 25
b
ROX: carboxyl-X-rhodamine
c
Dung dịch Master Mix 2x phù hợp với từng loại máy chu trình
nhiệt real-time
Chuẩn bị các ống phản ứng như sau:
a) trộn hỗn hợp thuốc thử PCR, ly tâm trong thời gian
30 giây đến 1 phút ở tốc độ thấp nhất là 6000 rpm và dùng pipet lấy 20 pL
cho vào mỗi ống phản ứng;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
c) trộn và ly tâm trong thời gian 30 giây đến 1 phút ở 6000 rpm;
d) chuyển các ống phản ứng đã chuẩn bị vào máy chu
trình nhiệt. Bật chương trình thời gian và nhiệt độ như trong Bảng 3.
9.2 Các mẫu kiểm chứng PCR
Có thể sử dụng các mẫu chuẩn đã được chứng nhận (CRM)
MON 87427 (CRM chứa từ 0 % đến 100 % sự kiện ngô chuyển gen MON 87427) hoặc các
mẫu chuẩn (RM) tương đương làm mẫu đối chứng dương, vật liệu chuẩn so sánh và vật
liệu xây dựng các điểm của đường chuẩn trong phân
tích định lượng.
Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được
quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).
9.3 Cài đặt chương trình nhiệt
độ và thời gian
Cài đặt chương trình nhiệt độ và thời gian như trong Bảng
3. Việc sử dụng các điều kiện phản ứng và máy chu trình nhiệt real-time khác có thể yêu cầu sự điều chỉnh phù
hợp cụ thể và cần được kiểm tra xác nhận. Nhiệt độ và thời gian yêu cầu để hoạt
hóa enzym phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.
Bảng 3 - Chương trình nhiệt độ
và thời gian
Thông số
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
°C
Thời gian
Đo huỳnh quang
Số chu kỳ
Tiền PCR: Khử nhiễm (UNG)a
50
120 s
Không
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
10 min
Không
1
Khuếch đại
Biến tính
95
15 s
Không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Gắn mồi và kéo dài
60
60 s
Có
a Khử nhiễm (UNG) tùy chọn
9.4 Dựng đường chuẩn
Sử dụng ADN mẫu chuẩn (RM) hoặc mẫu chuẩn chứng nhận
(CRM) có nồng độ phần trăm sự kiện ngô chuyển
gen MON 87427 đã biết để dựng đường chuẩn[4]. Đường chuẩn phải nằm trong phạm vi dài động, bao gồm các
giá trị tương ứng với mục đích sử dụng dự kiến, thể hiện dưới dạng phần trăm sự
kiện ngô chuyển gen MON 87427[3]. Pha loãng ADN chuẩn (CRM/RM) về nồng
độ xấp xỉ 40 ng/μL và sử dụng 200 ng ADN là điểm
chuẫn số một. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách pha loãng theo tỷ lệ nhất định
(ví dụ 1:2; 1:4; 1:5; 1:10), để tạo thành 4 đến 5 điểm chuẩn tương ứng. Mỗi điểm
chuẩn lặp lại ít nhất 2 lần đối với cả gen đặc hiệu taxon hmg và gen đặc hiệu sự kiện ngô chuyển
gen MON 87427. Các mẫu thử nghiệm được thực hiện đồng thời với
đường chuẩn trong cùng một lượt chạy phản
ứng real-time[4].
Đối với mỗi điểm chuẩn, sự khác biệt đối với mỗi giá
trị gen đích sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 và gen đích taxon hmg được tính toán (đỏ là ΔCt). Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ
thị các giá trị ΔCt của các điểm chuẩn theo
logarit số phần trăm gen đích sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 và gen đích taxon hmg. Độ đốc (a) và giao điểm (b) của đường
chuẩn (y = ax + b) sau đó được sử dụng để tính hàm lượng phần trăm (%) sự kiện
ngô chuyển gen MON 87427 trung bình của
các mẫu chưa biết. Giá trị này có thể được tính bằng Excel hoặc trên tùy chọn sẵn
có của phần mềm hệ thống real-time
PCR chuyên biệt.
Tiêu chí chấp nhận của đường chuẩn: Giá trị trung bình
của độ dốc của đường chuẩn phải nằm trong khoảng từ -3,6 đến -3,1; tương ứng với
hiệu suất khuếch đại từ 90 % đến 110 %[4].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10.1 Phát hiện sự kiện ngô chuyển gen MON 87427
Trình tự đích sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 trong mẫu
thử nghiệm X, được xem là phát hiện nếu:
- các mồi đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON87427-F và MON87427-R và đoạn dò MON87427 tạo
thành đường cong khuếch đại hình chữ S và có thể tính được giá trị Ct[2];
- các phản ứng kiểm chứng PCR không bổ sung ADN (kiểm
chứng thuốc thử PCR, kiểm chứng chiết
mẫu trắng) không tạo ra sự khuếch đại [2);
- các kiểm chứng khuếch đại (kiểm chứng dương ADN
đích, kiểm chứng chất ức chế PCR) tạo ra sự khuếch đại và giá trị ct dự kiến[2].
Việc biểu thị kết quả được nêu trong Điều 7.2 của TCVN
13917-1.
10.2 Định lượng sự kiện ngô chuyển gen MON87427
Hàm lượng sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 đơn bội, w,
biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (1):
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong đó:
w là hàm lượng sự kiện ngô chuyển
gen MON 87427 đơn bội (%) trong mẫu thử nghiệm X;
NMON87427 là
hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 87427, tính bằng
phần trăm khối lượng (%);
Ntaxon là hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu taxon hmg, tính bằng phần trăm khối lượng (%).
Tùy theo từng loại máy chu trình nhiệt real-time, hàm lượng sự kiện ngô chuyển gen MON
87427 có thể được phần mềm của máy tính toán đưa ra kết quả.
11 Yêu cầu đảm bảo chất lượng
Xem Điều 8.2.3 của TCVN 13917-1:2023.
12 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin
sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn
này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn
này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới
kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được. Ngoài ra, tùy từng trường
hợp cụ thể kết quả phải ghi:
- Kết
quả mẫu âm tính: "Đối với mẫu X, không phát hiện được sự kiện ngô chuyển
gen MON 87427" (10.1) (có thể
kèm theo LOD của phương pháp).
- Kết
quả mẫu dương tính: "Đối với mẫu X, phát hiện được sự kiện ngô chuyển gen
MON 87427” (10.1).
Kết quả định lượng: "Đối với mẫu X, hàm lượng ADN
có nguồn gốc từ sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 là w ± umeas %”, trong đó umeas là độ không đảm bảo đo (có thể kèm
theo LOQ của phương pháp). (10.2).
Thư mục tài liệu tham khảo
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[2] TCVN 13842-2:2023 (ISO/TS 20224-3), Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc
từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 3: Phương pháp
phát hiện ADN của lợn
[3] Definition
of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing,
(2015) JRC Technical Report. European Network of GMO Laboratories
(ENGL). European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EURL-GMFF).
24 pages.
[4] HO.UG.S L, GATTO F, GOERLICH O, GROHMANN L, LIESKE K,
MAZZARA M, NARENDJA F, OVESNA J, PAPAZOVA N, SCHOLTENS I, ZEL J. Verification
of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory
validated methods. JRC technical report. Version 2. 2017. EUR29015 EN.
30 pages.
[5] TCVN 12613:2019 (ISO 21570:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện
sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định
lượng axit nucleic.
[6] TCVN 9027 (ISO 24333), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ
cốc - Lấy mẫu.