TIÊU
CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
13263-1:2020
PHÂN
BÓN - PHẦN 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO
Fertilizers
- Part 1: Determination of vitamin A content by high performance liquid chromatographic
method
Lời nói đầu
TCVN 13263-1 : 2020 do Cục Bảo vệ
thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục
Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
PHÂN BÓN - PHẦN
1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG
CAO
Fertilizers
- Part 1: Determination of vitamin A content by high performance liquid chromatographic
method
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp
xác định hàm lượng vitamin A tổng số trong phân bón bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao
(HPLC).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần
thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm
công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm
công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để
phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử
TCVN 10683 : 2015, Phân bón rắn -
Phương pháp chuẩn bị mẫu để xác định các chỉ tiêu hóa học và vật lý
3 Nguyên tắc
Vitamin A trong phân bón được xà phòng
hóa bằng dung dịch kali hidroxit
trong etanol hoặc trong metanol để chuyển về dạng retinol. Retinol được chiết bằng
n-hexan. Sau đó được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với
detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,... hoặc tương đương), cột pha đảo. Các chất
được nhận biết dựa vào thời gian lưu và được xác định bằng
phương pháp đường chuẩn.
4 Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết
phân tích, nước dùng trong quá trình phân tích đạt loại 3 của TCVN 4851 (ISO
3696) hoặc có độ tinh khiết tương đương, sau đây gọi là nước.
4.1 Metanol, (CH3OH)
dùng cho sắc ký lỏng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.3 Chuẩn retinol, (C20H30O)= 286,5
g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90 %.
4.4 Etanol, (C2H5OH)
nồng độ cồn 96 %.
4.5 Natri sulfat khan, (Na2SO4) tinh khiết
phân tích.
4.6 Kali
hidroxit,
(KOH) tinh khiết phân tích.
4.7 Hydrotoluen
đã butyl hóa
(butylated hydrotoluen- BHT), tinh khiết phân tích.
4.8 Dung dịch
kali hidroxit, nồng độ khoảng 3%
Dùng cân kỹ thuật (5.8) cân khoảng 3 g
KOH (4.6) chính xác đến 0,001 g vào cốc dung tích 250 ml (5.1) có chứa sẵn 97
ml hỗn hợp etanol/nước (1+9) theo thể tích. Đặt vào bể siêu âm, siêu âm 20 min,
để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.9 Dung dịch
hydrotoluen đã butyl hóa (butylated hydrotoluen- BHT), nồng độ khoảng
20%
Dùng cân kỹ thuật (5.8) cân khoảng 2 g
BHT (4.7) chính xác đến 0,001 g vào bình định mức dung tích 20 ml (5.2), hòa
tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.1).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.11 Dung dịch chuẩn
gốc retinol,
nồng độ khoảng 1000 ppm
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng
0,01 g chất chuẩn retinol (4.3) chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức dung
tích 10 ml (5.2), dùng pipet (5.3) thêm 1 ml dung dịch hydrotoluen đã butyl hóa
(4.9), hòa tan và định
mức đến vạch bằng metanol (4.1), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ
phòng.
CHÚ THÍCH 1:
1) Có thể sử dụng các chuẩn dạng este
hoặc muối của vitamin, khi đó phải chuyển đổi hàm lượng các dạng muối hoặc este
về
retinol.
2) Dung dịch chuẩn được lưu giữ trong
bình tối màu và bảo quản mát từ 2 °C
đến 4 °C
3) Dung dịch chuẩn gốc nên sử dụng
trong vòng một tháng kể từ khi pha, dung dịch chuẩn làm việc nên dùng ngay sau
khi pha loãng
4) Phải kiểm tra đánh giá chuẩn trước
khi sử dụng
5) Nếu sử dụng cân có độ chính xác
0,0001 gam thì lượng cân của chuẩn và mẫu phải tăng lên 10 lần
4.12 Dung dịch chuẩn
trung gian,
nồng độ khoảng 20 ppm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.13 Dãy dung dịch
chuẩn làm việc, nồng độ khoảng
1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 8 ppm, 16 ppm
Dùng pipet (5.3) lấy chính xác 0,5; 1;
2; 4; 8 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.12) vào lần lượt bình định mức dung
tích 10 ml (5.2), định mức đến vạch bằng metanol (4.1), siêu âm trong 5 min, để
nguội đến nhiệt độ phòng và .
5 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông
thường của phòng thử nghiệm cụ thể như sau:
5.1 Cốc thủy
tinh,
dung tích 250ml; 1000 ml.
5.2 Bình định mức, dung tích 10
ml; 20 ml; 50 ml; 100 ml.
5.3 Pipet chia vạch, dung tích
0,5 ml; 1 ml; 2 ml; 5 ml; 10 ml.
5.4 Xyranh bơm mẫu, dung tích 50 μl, chia vạch
đến 1 μl. hoặc bơm mẫu
tự động
5.5 Màng lọc
xyranh PTFE,
có đường kính lỗ 0,45 μm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.7 Cân phân
tích,
có độ chính xác đến 0,0001 g và 0,00001 g.
5.8 Cân kỹ thuật, có độ chính
xác đến 0,001 g.
5.9 Thiết bị cô
quay chân không
- Bình cô quay, dung tích 250 ml;
- Khoảng tốc độ từ 20 r/min đến 280
r/min;
- Khoảng gia nhiệt từ 20 °C đến 180 °C.
5.10 Thiết bị lọc
Dùng được cho màng lọc dung môi đường
kính 13 mm, đường kính lỗ 0,45 μm để lọc pha động của HPLC
CHÚ THÍCH 2: Lọc pha động qua màng lọc
trước khi dùng để kéo dài thời
gian sử dụng của cột.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.12 Phễu chiết, dung tích
250 ml, có nắp polytetratluoetylen
5.13 Nồi đun cách
thủy
5.14 Cối nghiền mẫu, bằng sứ hoặc
vật liệu tương đương
5.15 Xyranh lọc mẫu, dung tích 1
ml dùng cho màng lọc xyranh PTFE (5.5)
5.16 Thiết bị sắc
ký lỏng hiệu năng cao, được trang bị như sau:
- Detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,...
hoặc tương đương);
- Hệ thống bơm cao áp;
- Buồng điều nhiệt cột tách;
- Máy tích phân hoặc máy vi tính;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng
tay.
6 Lấy mẫu và chuẩn bị
mẫu
6.1 Lấy mẫu
Đối với mẫu phân bón thường, lấy mẫu
theo TCVN 9486 : 2018. Đối với mẫu phân bón vi sinh, lấy mẫu theo TCVN 12105 :
2018
6.2 Chuẩn bị mẫu
Đồng hóa mẫu thử:
- Nghiền mẫu bằng cối sứ hoặc vật liệu tương
đương và trộn lại. Cần thực hiện
các biện pháp như làm lạnh sơ bộ trước khi nghiền mẫu để tránh mẫu bị tiếp xúc
với nhiệt độ cao trong thời gian dài.
- Chuẩn bị mẫu trong điều kiện tránh trực tiếp
ánh sáng mặt trời
6.2.1 Mẫu dạng rắn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.2.2 Mẫu dạng lỏng, huyền phù
Mẫu dạng lỏng, dạng huyền phù thì phải
lắc, trộn đều, đồng nhất trước khi cân.
7 Cách tiến hành
7.1 Xà phòng hóa
mẫu
7.1.1 Dùng cân phân
tích (5.7) cân 2 phần mẫu thử mỗi phần khoảng 2 g, chính xác đến 0,0001 g đã được
chuẩn bị theo mục (6.2) cho vào bình xà phòng hóa (5.11), thêm 20 ml dung dịch
KOH (4.8) để xà phòng hóa,1 ml dung dịch hydroxytoluen đã butyl hóa (4.9) và 50
ml etanol (4.4) lắc đều.
7.1.2 Chưng cất hồi
lưu 60 min trên nồi cách thủy và thỉnh thoảng xoay bình. Làm nguội nhanh dưới
nước vòi đang chảy.
7.2 Chiết mẫu
7.2.1 Chuyển dung dịch
lỏng sang phễu chiết (5.12) thứ nhất, tráng bình 2 lần, mỗi lần dùng 30 ml nước,
10 ml etanol (4.4) và 40 ml n-hexan (4.10). Lắc mạnh trong 30 s và để yên cho đến
khi hai pha được tách riêng biệt.
Chuyển pha nước (phía dưới) sang phễu
chiết (5.12) thứ hai, pha hữu cơ để yên trong phễu chiết thứ nhất.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chuyển pha nước sang phễu chiết (5.12)
thứ ba và pha hữu cơ sang phễu chiết thứ nhất.
7.2.3 Thêm vào phễu
chiết (5.12) thứ 3 hỗn hợp 10 ml etanol (4.4) và 40 ml n-hexan (4.10), lắc mạnh
trong 1 min để cho tách pha.
Chuyển pha hữu cơ sang phễu chiết thứ
nhất.
7.2.4 Rửa dịch chiết
pha hữu cơ ba lần, mỗi lần dùng 40 ml nước, lắc mạnh. Sau đó, rửa tiếp mỗi lần
dùng 40 ml nước cho đến khi nước rửa cuối cùng không còn màu hồng với
phenolphtalein. Loại bỏ hết nước bằng cách thêm khoảng 1 g natri sulfate khan
(4.5), nếu chưa hết thêm tiếp natri sulfate khan (4.5).
CHÚ THÍCH 3:
Trong quá trình chiết, nếu
dung dịch bị tạo nhũ thì thêm 1 ml dung dịch kali hydroxide (4.8) để phá nhũ
7.3 Làm bay hơi
Chuyển dịch chiết hữu cơ đã được loại
nước (7.2.4) sang bình cô quay, lắp vào thiết bị cô quay, sau đó cô quay cách
thủy ở nhiệt độ 50 °C
cho đến khi không còn chất lỏng trong bình cô quay để loại hết dung môi
n-hexan.
7.4. Pha loãng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.5 Điều kiện
phân tích
Các điều kiện vận hành sắc ký sau đây
được cho là thích hợp:
Tỷ lệ pha động: Axetonitril (4.2) :
Metanol (4.1) = 50 : 50 theo thể tích
Bước sóng: 325 nm
Tốc độ dòng: 1 ml/min
Thể tích bơm mẫu: 20 μl
Nhiệt độ buồng cột: 25 °C
7.6 Dựng đường
chuẩn
Dựng đường chuẩn (tương quan giữa diện
tích píc và nồng độ chất chuẩn) của vitamin A tại 5 điểm có nồng độ
tương ứng dung dịch chuẩn làm việc (4.13).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dùng xyranh (5.4) bơm 1 dung dịch chuẩn
có nồng độ thấp nhất trong dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.13) cho đến
khi số đo diện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 %. Sau đó, bơm lần
lượt các dung dịch chuẩn làm việc (4.13) nồng độ từ thấp đến cao và dung dịch mẫu
thử (7.4). Nếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng
cách pha loãng dung dịch mẫu thử bằng metanol (4.1).
8 Tính kết quả
Hàm lượng của vitamin A (retinol)
trong mẫu, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công
thức (1):
Trong đó:
X0 là nồng độ của
retinol trong mẫu tính theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lit
(mg/l);
V là thể tích dung môi
pha loãng mẫu mililit (ml);
m là khối lượng mẫu thử,
tính bằng gam (g);
P là độ tinh khiết của
chất chuẩn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Y = X x h (2)
Trong đó: h là hệ số chuyển đổi
- h=1,147 với retinyl acetate
- h=1,832 với retinyl palmitate
- h=1,196 với retinyl propionate
Kết quả thử nghiệm thu được, lấy hai
chữ số sau dấu phẩy.
9 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy
đủ mẫu thử;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện
dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định
trong tiêu chuẩn này, hoặc những
điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
Phụ
lục A
(Tham
khảo)
Thông tin về hoạt chất vitamin A
A.1 Giới thiệu
hoạt chất retinyl acetate
- Công thức cấu tạo:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Công thức phân tử: C22H32O2
- Khối lượng phân tử: 328,5 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 57 °C đến 58 °C
- Nhiệt độ sôi: 406,22 °C
- Độ hòa tan: Tan trong dầu ăn, clorofom, dietyl
ete;
Không tan trong nước
A.2 Giới thiệu hoạt
chất retinyl palmitate
- Công thức cấu tạo:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Công thức phân tử: C36H60O2
- Khối lượng phân tử: 524,9 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 28 °C đến 29 °C
- Nhiệt độ sôi: 546,21 °C
- Độ hòa tan: Tan trong dầu ăn, clorotom,
dietyl ete;
Không tan trong nước
A.3 Giới thiệu
hoạt chất retinol
- Công thức cấu tạo:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Công thức phân tử: C20H30O
- Khối lượng phân tử: 286,45 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 62 °C đến
64 °C
- Nhiệt độ sôi: 137 °C đến 138 °C
- Độ hòa tan: Tan trong dầu ăn, clorofom, dietyl
ete;
Không tan trong nước
A.4 Giới thiệu hoạt
chất retinyl propionate
- Công thức cấu tạo:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Công thức phân tử: C23H34O2
- Khối lượng phân tử: 342,5 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 28 °C đến 29 °C
- Nhiệt độ sôi: 453,7 °C
- Độ hòa tan: Tan trong dầu ăn và chất
béo, alcohols, hydrocarbons, clorofom, dietyl ete;
Không tan trong nước
A.5 Hiệu suất thu
hồi và giới hạn định lượng
- Hiệu suất thu hồi của phương pháp: từ
80 % đến 110 %.
- Giới hạn định lượng của phương pháp
(LOQ):
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Độ lặp lại của phương pháp, CV ≤ 5%.
Phụ
lục B
(Tham
khảo)
Thông tin về sắc ký đồ điển hình của vitamin
A
Hình 1: sắc
ký đồ của chất chuẩn vitamin A 5 ppm
Hình 2: sắc
ký đồ vitamin A trong nền phân bón
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thư mục tài
liệu tham khảo
[1] TCVN 9486 :
2018, Phân bón- Lấy mẫu
[2] TCVN 12105 :
2018, Phân bón vi sinh vật- Lấy mẫu
[3] TCVN 11668:
2016, Xác định vitamin A và vitamin E bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao pha thường
[4] TCVN 8972-2:
2011 Thực phẩm - Xác định vitamin A bằng sắc ký hiệu năng cao - Phần 1 Xác định
13-cis-retinol và tất cả
các đồng phân trans-retinol
[5] TCVN 7081-2:
2010, Sữa bột gầy - Xác định vitamin
hàm lượng vitamin A- Phần 2: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao