Tiêu chuẩn TCVN 13636:2023 về Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Phát hiện Candida albicans

• Số hiệu: TCVN13636:2023
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2023

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13636:2023

ISO 18416:2015

WITH AMENDMENT 1:2022

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - PHÁT HIỆN CANDIDA ALBICANS

Cosmetics - Microbiology - Detection of Candida albicans

Lời nói đầu

TCVN 13636:2023 hoàn toàn tương đương với ISO 18416:2015 và sửa đổi 1:2022.

TCVN 13636:2023 do Viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

...

...

...

Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh cho sản phẩm mỹ phẩm được thực hiện tùy theo mức độ phân tích rủi ro vi sinh nhằm đảm bảo chất lượng và an toàn cho người tiêu dùng.

Phân tích rủi ro vi sinh phụ thuộc vào một số đặc điểm như:

- Độ ổn định của các sản phẩm mỹ phẩm;

- Khả năng gây bệnh của vi sinh vật;

- Vị trí sử dụng sản phẩm mỹ phẩm (tóc, da, mắt, niêm mạc);

- Độ tuổi người sử dùng (người lớn, trẻ em dưới 3 tuổi).

Đối với mỹ phẩm và các sản phẩm sử dụng tại chỗ khác, phát hiện các mầm bệnh trên da như Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans là cần thiết, vì những vi sinh vật này có thể gây bệnh nhiễm khuẩn da hoặc mắt. Ngoài ra, việc phát hiện các loại vi sinh vật khác cũng được quan tâm vì sự xuất hiện của những vi sinh vật này như Escherichia coli cho thấy sự không đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất.

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - PHÁT HIỆN CANDIDA ALBICANS

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung để phát hiện và định danh Candida albicans trong các sản phẩm mỹ phẩm. Các vi sinh vật được chỉ định trong tiêu chuẩn này có thể khác tùy theo thực tế và quy định riêng của mỗi quốc gia.

Để đảm bảo chất lượng sản phẩm và sự an toàn cho người tiêu dùng, cần thực hiện phân tích rủi ro vi sinh thích hợp để xác định loại sản phẩm mỹ phẩm áp dụng tiêu chuẩn này. Các sản phẩm được coi là có rủi ro vi sinh thấp, dựa trên đánh giá rủi ro được mô tả trong TCVN 13641:2023 (ISO 29621) như các sản phẩm có hoạt độ nước thấp, sản phẩm chứa cồn hoặc giá trị pH cực đoan, v.v.

Phương pháp được mô tả trong tiêu chuẩn này dựa trên việc phát hiện Candida albicans trong môi trường lỏng không chọn lọc (môi trường tăng sinh), tiếp đó là phân lập trên môi trường thạch chọn lọc. Các phương pháp khác có thể thích hợp phụ thuộc vào giới hạn phát hiện.

CHÚ THÍCH: Đối với việc phát hiện Candida albicans, có thể cấy truyền trên môi trường nuôi cấy không chọn lọc, sau đó thực hiện các bước định danh thích hợp (ví dụ sử dụng Kit định danh).

Do có rất nhiều dạng sản phẩm mỹ phẩm nên trong phạm vi áp dụng, phương pháp này có thể không phù hợp với một số sản phẩm cụ thể (ví dụ như các sản phẩm không thấm nước). Các tiêu chuẩn quốc tế khác (TCVN 13635 (ISO 18415)) có thể phù hợp. Các phương pháp khác (ví dụ như phương pháp tự động) có thể thay thế cho các thử nghiệm sinh hóa trình bày ở đây với điều kiện phương pháp đó được chứng minh là tương đương hoặc phù hợp.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 13637, Mỹ phẩm - Vi sinh - Hướng dẫn chung về kiểm tra mức độ nhiễm vi sinh vật ( ISO 21148:2017, Cosmetics - Microbiology - General instructions for microbiological examination)

...

...

...

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Sản phẩm (product)

Phần sản phẩm mỹ phẩm xác định nhận được trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm.

3.2

Mẫu (sample)

Một phần của sản phẩm (ít nhất 1 g hoặc 1 ml) được dùng để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu.

3.3

...

...

...

Hỗn dịch hay dung dịch của mẫu thử trong thể tích nhất định của môi trường tăng sinh lỏng phù hợp.

3.4

Mẫu pha loãng (sample dilution)

Mẫu được pha loãng từ hỗn dịch mẫu ban đầu.

3.5

Vi sinh vật chỉ định (specified microorganism)

Vi khuẩn ưa nhiệt hiếu khí hoặc nấm men không được có trong một sản phẩm mỹ phẩm và được công nhận là một loài gây bệnh trên da có thể gây hại cho sức khoẻ con người hoặc là loài vi sinh chỉ thị cho việc không đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất.

3.6

Candida albicans

...

...

...

CHÚ THÍCH 1: Đặc điểm chính để định danh là việc tạo ra mầm giá đậu và / hoặc pseudomycelium (giả sợi nấm) và chlamydospore (bào tử vách dày) khi thử nghiệm được thực hiện theo phương pháp được đề cập trong tiêu chuẩn này.

3.7

Môi trường tăng sinh lỏng (enrichment broth)

Môi trường lỏng không chọn lọc chứa các chất trung hòa và / hoặc các chất phân tán thích hợp và được chứng minh là phù hợp cho thử nghiệm.

4  Nguyên tắc

Bước đầu tiên của quy trình là làm tăng số lượng vi sinh vật trong môi trường lỏng không chọn lọc và đảm bảo vi sinh vật này không bị ức chế bởi các tác nhân chọn lọc có trong môi trường chọn lọc / phân biệt.

Bước thứ hai của thử nghiệm (phân lập) được thực hiện trên môi trường chọn lọc và sau đó là các thử nghiệm định danh.

Phải trung hòa khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật của mẫu thử để cho phép phát hiện các vi sinh vật còn sống. Trong mọi trường hợp và bất kể phương pháp nào, phải kiểm tra và chứng minh sự trung hòa các đặc tính kháng khuẩn của sản phẩm (Điều 11).

5  Dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

...

...

...

Quy định chung được đề cập trong TCVN 13637 (ISO 21148). Nước đề cập trong tiêu chuẩn này là nước cất hoặc nước tinh khiết được đề cập trong TCVN 13637 (ISO 21148).

Môi trường tăng sinh lỏng được sử dụng để phân tán mẫu thử và tăng số lượng vi sinh vật ban đầu. Môi trường có chứa chất trung hòa nếu mẫu được kiểm tra có chứa chất kháng khuẩn. Hiệu lực của chất trung hòa cần được chứng minh (Điều 11). Thông tin về chất trung hòa phù hợp được đưa ra trong Phụ lục B.

Theo tiêu chuẩn này, môi trường tăng sinh lỏng (5.3.3.1) hay bất kì môi trường nào được liệt kê trong Phụ lục A đều phù hợp để kiểm tra sự có mặt của Candida albicans. Những môi trường này đã được chứng minh là phù hợp trong Điều 11.

Những dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy khác cũng có thể được sử dụng nếu được chứng minh là phù hợp.

5.2  Dung dịch pha loãng cho hỗn dịch nấm men (dung dịch trypton natri clorid)

5.2.1  Quy định chung

Dung dịch pha loãng được sử dụng để chuẩn bị hỗn dịch nấm men cũng được dùng cho kiểm tra tính phù hợp của quy trình thử nghiệm (Điều 11).

5.2.2  Thành phần

Tryptone, casein thủy phân bởi pancreatin

...

...

...

Natri clorid

8,5 g

Nước

1 000 ml

5.2.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối vào bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

5.3  Môi trường nuôi cấy

5.3.1  Quy định chung

Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị theo mô tả sau đây hoặc từ môi trường khô theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cần tuân thủ các hướng dẫn từ nhà sản xuất môi trường.

...

...

...

5.3.2  Môi trường thạch để kiểm tra tính phù hợp (Điều 11)

5.3.2.1  Thạch Sabouraud dextrose (SDA)

5.3.2.1.1  Thành phần

Dextrose

40,0 g

Pepton từ mô động vật

5,0 g

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

...

...

...

15,0 g

Nước

1 000 ml

5.3.2.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần riêng rẽ trong môi trường hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

5.3.2.2  Các môi trường nuôi cấy khác để kiểm tra tính phù hợp

Có thể sử dụng các môi trường nuôi cấy khác để kiểm tra tính phù hợp (xem Phụ lục A).

5.3.3  Môi trường tăng sinh lỏng

5.3.3.1  Môi trường Eugon LT 100 lỏng

...

...

...

Môi trường này có chứa chất để trung hòa các chất ức chế có trong mẫu: lecithin và polysorbate 80 và tác nhân phân tán octoxynol 9. Môi trường Eugon LT lỏng cải tiến có thể được chọn sử dụng thay thế.

5.3.3.1.2  Thành phần

Casein thủy phân bởi pancreatin

15,0 g

Bột đậu tương thủy phân bởi papain

5,0 g

L-cystein

0,7 g

Natri clorid

...

...

...

Natri sulfit

0,2 g

Glucose

5,5 g

Lecithin

1,0 g

Polysorbate 80

5,0 g

Octoxynol 9

...

...

...

Nước

1 000 ml

5.3.3.1.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần polysorbate 80, octoxynol 9 và lecithin trong nước nóng để hòa tan hoàn toàn. Thêm các thành phần còn lại vào bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng.

5.3.3.2  Môi trường Eugon LT lỏng cải tiến

5.3.3.2.1  Thành phần

Casein thủy phân bởi prancreatin

15,0 g

Bột đậu tương thủy phân bởi papain

...

...

...

L-cystine

0,7 g

Natri clorid

4,0 g

Natri sulfit

0,2 g

Glucose

5,5 g

Lecithin từ trứng

...

...

...

Polysorbat 80

5,0 g

Natri lauryl eter sulphate

1,56 g

Nước

1 000 ml

5.3.3.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan lần lượt từng thành phần polysorbate 80, lecithin từ trứng trong nước sôi để tan hoàn toàn. Thêm các thành phần còn lại vào bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng khoảng 7,0 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

5.3.3.3  Các môi trường tăng sinh lỏng khác

...

...

...

5.3.4  Môi trường chọn lọc để phân lập Candida albicans

5.3.4.1  Môi trường thạch Sabouraud dextrose chloramphenicol

5.3.4.1.1  Thành phần

Dextrose

40,0 g

Pepton từ mô động vật

5,0 g

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

...

...

...

0,05 g

Thạch

15,0 g

Nước

1 000 ml

5.3.4.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan hoàn toàn các thành phần (bao gồm chloramphenicol) hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng.

5.3.4.2  Các môi trường chọn lọc khác

Có thể sử dụng các môi trường tăng sinh lỏng khác nếu phù hợp (xem Phụ lục A)

...

...

...

5.3.5.1  Thành phần

Dịch chiết từ bột ngô

50,0 g

Thạch

15 g

Polysorbate 80

10,0 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 6,0 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng.

6  Dụng cụ

Sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm và dụng cụ theo mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148).

7  Chủng vi sinh vật

Để xác nhận tính phù hợp của điều kiện thử nghiệm, chủng nấm men sau đây được sử dụng:

Candida albicans ATCC1) 10231 (tương đương với chủng IP2) 48.72, NCPF3) 3179 hoặc NBRC4) 1594, KCTC5) 17205 hoặc các chủng tương đương trong bộ sưu tập chủng giống quốc gia khác).

Các chủng trên cần được hoàn nguyên theo hướng dẫn của nhà cung cấp.

Các chủng có thể được lưu giữ trong phòng thí nghiệm theo (EN 12353).

8  Xử lý sản phẩm mỹ phẩm và mẫu thử phòng thí nghiệm

...

...

...

Quá trình lấy mẫu thử nghiệm từ các sản phẩm mỹ phẩm để phân tích cần được tiến hành như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148). Phân tích mẫu như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148) và theo quy trình đưa ra trong Điều 9.

9  Cách tiến hành

9.1  Khuyến cáo chung

Sử dụng vật liệu vô khuẩn, thiết bị và kỹ thuật vô khuẩn để chuẩn bị mẫu thử nghiệm, pha hỗn dịch mẫu ban đầu và mẫu pha loãng. Khi chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu, sử dụng dung dịch pha loãng hợp lý, khoảng thời gian từ lúc hoàn tất việc chuẩn bị đến lúc hỗn dịch mẫu ban đầu và / hoặc mẫu pha loãng bắt đầu tiếp xúc với môi trường tăng sinh không nên quá 45 min, trừ khi có yêu cầu đặc biệt khác trong quy trình hoặc tài liệu đã thiết lập.

9.2  Chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu trong môi trường tăng sinh lỏng

9.2.1  Quy định chung

Phân tán ít nhất 1 g hoặc 1 ml mẫu (3.2) đã được trộn đều trong ít nhất 9 ml môi trường tăng sinh lỏng để tăng sinh mẫu thử.

CHÚ THÍCH: S, khối lượng hay thể tích chính xác của mẫu thử nghiệm.

Phương pháp thử nghiệm nên được kiểm tra để chắc rằng các thành phần (chất trung hòa được thêm vào) và thể tích của môi trường lỏng là phù hợp cho thử nghiệm (11.3).

...

...

...

9.2.2  Các sản phẩm trộn lẫn được trong nước

Chuyển lượng mẫu, S, của sản phẩm vào trong một bình chứa một lượng thích hợp môi trường tăng sinh lỏng.

9.2.3  Các sản phẩm không trộn lẫn được trong nước

Chuyển lượng mẫu, S, của sản phẩm vào trong một bình chứa một lượng thích hợp tác nhân phân tán (ví dụ Polysorbate 80).

Phân tán mẫu thử trong tác nhân phân tán và thêm một lượng thích hợp môi trường tăng sinh lỏng.

9.2.4  Các sản phẩm có thể lọc được

Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc không quá 0,45 μm.

Chuyển lượng mẫu, S, lên màng lọc của bộ lọc (TCVN 13637 (ISO 21148)). Lọc nhanh và rửa màng lọc bằng một lượng nước và / hoặc dung dịch pha loãng xác định. Chuyển màng lọc và nhúng ngập màng lọc vào ống hoặc bình có chứa một lượng thích hợp môi trường tăng sinh lỏng.

9.3  Ủ dịch hỗn dịch ban đầu trong môi trường tăng sinh lỏng

...

...

...

9.4  Phát hiện và định danh Candida albicans

9.4.1  Phân lập

Sử dụng que cấy vô khuẩn, lấy một vòng que cấy dịch ở môi trường tăng sinh lỏng cấy ria lên bề mặt môi trường thạch Sabouraud dextrose chloramphenicol để thu được khuẩn lạc riêng rẽ.

Lật ngược đĩa petri và ủ ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 24 h đến 48 h.

Kiểm tra đặc điểm khuẩn lạc (xem Bảng 1).

Bảng 1 - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Candida albicans trên môi trường thạch chọn lọc

Môi trường chọn lọc

Đặc điểm khuẩn lạc Candida albican

Môi trường thạch

...

...

...

Lồi, mịn, màu trắng tới trắng ngà

9.4.2  Định danh Candida albicans

9.4.2.1  Quy định chung

Candida albicans có thể xuất hiện dạng dị hình lưỡng tính và có thể sản sinh dạng sợi giả, một vài loại sản sinh dạng sợi thật. Candida albicans không những nảy chồi tạo ra các cụm bào tử tròn mà còn tạo ra các bào tử vách dày. Khi nhiệt độ môi trường thấp, có thể hình thành hệ sợi giả, tuy nhiên có thể chuyển thành dạng đơn bào khi ở nhiệt độ cao hơn.

Tiến hành các thử nghiệm sau đây trên các khuẩn lạc nghi ngờ đã được phân lập trên môi trường thạch Sabouraud dextrose cloramphenicol. Sự hiện diện của Candida albicans có thể được khẳng định bằng các môi trường và các phản ứng sinh hóa thích hợp khác.

9.4.2.2  Nhuộm Gram

Phép thử được mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148).

Quan sát trên kính hiển vi tế bào nấm có màu tím, hình trứng ngắn, thỉnh thoảng có một số tế bào nảy chồi.

9.4.2.3  Sự hình thành mầm giá đậu (germ tube)

...

...

...

9.4.2.3.2  Tán đều một lượng nhỏ tế bào nấm men nghi ngờ vào huyết thanh.

9.4.2.3.3  Ủ ở bể ổn nhiệt ở 37 °C ± 1 °C trong 1,5 h đến 2 h hoặc ủ ở tủ ấm 37 °C ± 2 °C trong 3 h.

9.4.2.3.4  Nhỏ một giọt huyết tương sau khi ủ lên làm kính và kiểm tra sự hình thành mầm giá đậu.

Mầm giá đậu xuất hiện dạng sợi nhỏ hình thành từ bào tử nảy chồi, không có bất cứ điểm thắt eo ở điểm bắt đầu và không thấy vị trí phồng lên dọc theo sợi mầm.

Sự hình thành mầm giá đậu là đặc điểm chứng tỏ sự có mặt của Candida albicans.

Nếu không hình thành mầm giá đậu, khuẩn lạc nghi ngờ cần được kiểm tra sự hình thành sợi nấm, sợi nấm giả và bào tử vách dày theo mục 9.4.2.4.

9.4.2.4  Nuôi cấy trên môi trường thạch bột ngô bổ sung 1% polysorbate 80

9.4.2.4.1  Lấy một phần nhỏ khuẩn lạc nấm men bằng que cấy vòng và ria lên bề mặt môi trường thạch. Đặt một tấm kính mỏng (la men) vô khuẩn lên bề mặt vết cấy.

9.4.2.4.2  Ủ ở 32,5 °C ± 2,5 °C tới 3 ngày.

...

...

...

Candida albicans tạo ra bào tử chlamydospore lớn, vách dày dày, độ khúc xạ cao, ở đầu hoặc trên các nhánh bên ngắn.

10  Biểu thị kết quả (phát hiện Candida albicans)

Nếu kết quả định danh xác định được sự có mặt của loài nấm men này thì kết quả được ghi như sau:

- “Phát hiện Candida albicans trong mẫu thử S”.

Nếu không thấy có sự phát triển trên môi trường tăng sinh và / hoặc kết quả định danh khuẩn lạc không xác định được sự có mặt của loài nấm men này thì kết quả được ghi như sau:

- “Không phát hiện Candida albicans trong mẫu thử S”.

11  Trung hòa thuộc tính kháng vi sinh vật của sản phẩm

11.1  Quy định chung

Các thử nghiệm khác được mô tả sau đây dùng để chứng minh các chủng vi sinh vật có thể phát triển được trong điều kiện phân tích.

...

...

...

Trước khi tiến hành thử nghiệm, cấy chủng Candida albicans lên trên bề mặt thạch casein đậu tương (SCDA) hoặc môi trường thích hợp khác (môi trường không chọn lọc, không chứa chất trung hòa), ủ ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 18 h đến 24 h.

Để thu hoạch chủng vi sinh vật đã nuôi cấy, sử dụng que cấy vòng vô khuẩn, lấy khuẩn lạc trên bề mặt môi trường và trộn lại trong dung dịch pha loãng để được hỗn dịch chủng và điều chỉnh hỗn dịch này để thu được hỗn dịch chủng hiệu chỉnh chứa khoảng 1 x 10^8 CFU/ml ((ví dụ có thể sử dụng máy đo quang phổ để xác định nồng độ tương đối trong TCVN 13637 (ISO 21148), phụ lục C)).

Sử dụng hỗn dịch chủng hiệu chỉnh và các hỗn dịch chủng pha loãng trong vòng 2 h.

11.3  Tính phù hợp của phương pháp phát hiện

11.3.1  Cách tiến hành

11.3.1.1  Pha loãng hỗn dịch chủng ban đầu trong các ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng để được nồng độ chủng cuối cùng chứa khoảng 100 CFU/ml đến 500 CFU/ml. Để đếm nồng độ cuối cùng của vi sinh vật sống lại được trong dung dịch pha loãng, chuyển 1 ml hỗn dịch chủng vào đĩa Petri và đổ 15 ml đến 20 ml môi trường thạch tan chảy được giữ ấm trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ không quá 48 °C. Ủ đĩa ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 20 h đến 24 h.

11.3.1.2  Chuẩn bị hai ống hoặc hai bình hỗn dịch mẫu ban đầu theo điều kiện đã được lựa chọn cho thử nghiệm (chứa ít nhất 1 g hoặc 1 ml sản phẩm trong một thể tích xác định môi trường tăng sinh lỏng). Khi sử dụng phương pháp màng lọc, lọc ít nhất 1 ml sản phẩm từ 2 ống / bình như trên và chuyển mỗi màng lọc vào một ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường tăng sinh lỏng trong điều kiện đã được lựa chọn cho thử nghiệm.

11.3.1.3  Chuyển 0,1 ml hỗn dịch chủng được pha loãng từ hỗn dịch chủng ban đầu đã biết số lượng vi sinh vật (11.3.1.1) vào một ống nghiệm hoặc bình (thử nghiệm tính phù hợp). Trộn đều, sau đó ủ các ống nghiệm / bình (thử nghiệm tính phù hợp và mẫu kiểm tra không chứa vi sinh vật) ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 20 h đến 24 h.

11.3.1.4  Phân lập vi sinh vật từ mỗi ống nghiệm / bình (trong thử nghiệm tính phù hợp và mẫu kiểm tra không chứa vi sinh vật). Sử dụng que cấy vòng vô khuẩn lấy một vòng hỗn dịch đã được ủ cấy lên bề mặt đĩa Petri (đường kính 85 đến 100 mm) chứa khoảng 15 ml đến 20 ml môi trường thạch Sabouraud dextrose cloramphenicol. Ủ đĩa ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 24 h đến 48 h.

...

...

...

Kiểm tra số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch chủng sau khi pha loãng (11.3.1.1) phải chứa khoảng từ 100 CFU/ml đến 500 CFU/ml.

Nếu Candida albicans phát triển đặc trưng trên đĩa thử tính phù hợp và không có sự phát triển nào trên đĩa kiểm tra thì phương pháp trung hòa có hiệu quả và và phương pháp phát hiện là phù hợp.

Khi trên đĩa kiểm tra có vi sinh vật phát triển (sản phẩm tạp nhiễm), phương pháp trung hòa có hiệu quả và phương pháp phát hiện là phù hợp nếu Candida albicans được phục hồi trên đĩa thử tính phù hợp.

Khi không thấy sự phát triển của vi sinh vật ở các đĩa thử tính phù hợp thì chứng tỏ hoạt tính kháng khuẩn vẫn còn và cần phải điều chỉnh các điều kiện của phương pháp bằng việc tăng thể tích môi trường dinh dưỡng lỏng mà vẫn giữ nguyên lượng mẫu, hoặc bằng cách kết hợp một lượng đủ tác nhân khử hoạt tính trong môi trường tăng sinh lỏng hoặc sự kết hợp các biện pháp điều chỉnh để Candida albicans phát triển được.

Mặc dù có sự kết hợp của các tác nhân khử hoạt tính kháng khuẩn thích hợp và sự gia tăng đáng kể thể tích của môi trường lỏng nhưng vi sinh vật không sống lại được như mô tả ở trên thì kết luận rằng mẫu thử không nhiễm Candida albicans.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm bao gồm:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này, nghĩa là TCVN 13636 (ISO 18416:2015); Amendment 1:2022;

b) Tất cả các thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ của sản phẩm;

...

...

...

d) Các kết quả đã thu được;

e) Chi tiết các bước tiến hành chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu;

f) Mô tả phương pháp với chất trung hòa và môi trường đã sử dụng;

g) Chứng minh tính phù hợp của phương pháp, ngay cả khi thử nghiệm đã được thực hiện riêng rẽ;

h) Bất kỳ điểm nào không được nêu trong tài liệu này, hoặc được coi là tùy chọn (không bắt buộc), cùng với các chi tiết về bất kỳ sự cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các môi trường nuôi cấy khác

...

...

...

A.1.1  Môi trường lỏng casein thủy phân từ đậu tương

A.1.1.1  Thành phần

Casein thủy phân bởi pancreatin

17,0 g

Bột đậu tương thủy phân bởi papain

3,0 g

Natri clorid

5,0 g

Kali hydrogen phosphate

...

...

...

Dextrose

2,5 g

Nước

1 000 ml

A.1.1.2  Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc từ môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích chứa phù hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH sẽ phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

A.1.2  Môi trường letheen lỏng cải tiến

A.1.2.1  Thành phần

Pepton từ thịt

...

...

...

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

Cao thịt bò

5,0 g

Cao nấm men

2,0 g

Lecithin

0,7 g

Polysorbate 80

...

...

...

Natri clorid

5,0 g

Natri bisulfit

0,1 g

Nước

1 000 ml

A.1.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan hoàn toàn lần lượt polysorbate 80 và lecithin trong nước sôi. Hòa tan các thành phần còn lại vào bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Trộn nhẹ nhàng tránh tạo bọt. Phân phối vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và làm nguội, pH sẽ phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

A.1.3  Môi trường lecithin-polysorbate 80 bổ sung Glucose và peptone (GPLP 80 broth)

...

...

...

Glucose

20,0 g

Cao nấm men

2,0 g

Magnesium sulfate

0,5 g g

Peptone

5,0 g

Potassium hydrogen phosphate

...

...

...

Lecithin

7,0 g

Nước

1 000 ml

A.1.3.2  Chuẩn bị

Hoà tan hoàn toàn các thành phần hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH sẽ phải đạt khoảng 5,7 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

A.1.4  Dung dịch trung hòa D/E (Dung dịch trung hòa Dey / Engley)

A.1.4.1  Thành phần

Glucose

...

...

...

Lecithin đậu tương

7,0 g

Natri thiosulfate pentahydrate

6,0 g

Polysorbate 80

5,0 g

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

Natri bisulfite

...

...

...

Cao nấm men

2,5 g

Natri thioglycolate

1,0 g

Tím Bromocresol

0,02 g

Nước

1 000 ml

A.1.4.2  Chuẩn bị

...

...

...

A.1.5  Môi trường đậu tương - casein thủy phân - lecithin-polysorbate 80 (Môi trường SCDLP 80 lỏng)

A.1.5.1  Thành phần

Pepton từ casein

17,0 g

Pepton từ đậu tương

3,0 g

Natri chlorid

5,0 g

Kali hydrogen phosphat

...

...

...

Glucose

2,5 g

Lecithin

1,0 g

Polysorbate 80

7,0 g

Nước

1 000 ml

A.1.5.2  Chuẩn bị

...

...

...

A.2  Môi trường thạch khác để thử nghiệm tính phù hợp

A.2.1  Môi trường Thạch khoa tây dextrose (PDA)

A.2.1.1  Thành phần

Dịch chiết khoai tây

4,0 g

Dextrose

20,0 g

Thạch

15,0 g

...

...

...

1 000 ml

A.2.1.2.  Chuẩn bị

Hoà tan hoàn toàn tất cả các thành phần này hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

A.2.2  Soybean-casein digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA)

A.2.2.1  Thành phần

Casein thủy phân bởi pancreatin

15,0g

Bột đậu tương thủy phân bởi papaic

5,0 g

...

...

...

5,0 g

Thạch

15,0 g

Nước

1 000 ml

A.2.2.2.  Chuẩn bị

Hoà tan hoàn toàn tất cả các thành phần này hoặc môi trường chỉnh khô trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

A.3  Môi trường thạch chọn lọc khác - Môi trường thạch khoai tây dextrose bổ sung kháng sinh

A.3.1  Thành phần

...

...

...

4,0 g

Dextrose

20,0 g

Agar

15,0 g

Chloramphenicol

0,05 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hoà tan hoàn toàn tất cả các thành phần trên trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và làm nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

Có thể thay thế Cloramphenicol bằng 0,10 g kali benzylpenicillin và 0,10 g tetracycline cho 1 lít môi trường, được thêm vào môi trường dưới dạng dung dịch vô khuẩn ngay trước khi sử dụng.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các chất trung hòa hoạt tính kháng vi sinh vật của chất bảo quản và các dung dịch rửa / lọc

Chất bảo quản

Hợp chất hóa học có thể trung hòa hoạt tính kháng khuẩn của chất bảo quản

Ví dụ về thành phần chất trung hòa thích hợp và các dung dịch rửa

...

...

...

Các hợp chất phenol:

Các paraben, phenoxyethanol,

Phenylethanol, v.v...

Các anilin

Lecithin,

Polysorbat 80,

Ethylen oxid ngưng tụ của cồn béo (fatty alcohol)

Chất hoạt động bề mặt không ion

30 g/l Polysorbat 80 + 3 g/l lecithin

...

...

...

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: 1 g/l trypton, + 9 g/l NaCl; 5 g/l polysorbat 80

Các hợp chất amoni bậc bốn

Các chất hoạt động bề mặt cation

Lecithin, saponin, polysorbat 80, natri dodecyl sulphat

Ethylen oxid ngưng tụ của cồn béo (fatty alcohol)

30 g/l Polysorbat 80 + 4 g/l natri dodecyl sulphat + 3 g/l lecithin

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

...

...

...

Các andehit

Các chất giải phóng formaldehyd

Glycin, histidin

3 g/l Lecithin + 30 g/l polysorbat 80 + 1 g/l L-histidin

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 1 g/l L- histidin + 1 g/l L-cystein

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: 3 g/l polysorbat 80 + 0,5 g/l L- histidin

Các hợp chất oxy hóa

Natri thiosulfat

...

...

...

Dung dịch rửa: 3 g/l Natri thiosulfat

Các isothiazolinon, imidazol

Lecithin, saponin

Các amin, sulfat, mercaptan, natri bisulfit, natri thioglycolat

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin

Dung dịch rửa: 1 g/l trypton + 9 g/l NaCl; 5 g/l polysorbat 80

Các biguanide

Lecithin, saponin, polysorbat 80

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin

...

...

...

Các muối kim loại (Cu, Zn, Hg)

Các muối thủy ngân hữu cơ

Natri bisulfat, L-cystein

Các hợp chất sulfhydryl, axit thioglycolic

0,5 g/l hay 5 g/l Natri thioglycolat

0,8 g/l hay 1,5 g/l L-cystein

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: 0,5 g/l Natri thioglycolat

GHI CHÚ: xem tài liệu tham khảo số 8 và 11

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, published by the European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association

[2] CTFA, Microbiology Guidelines, published by the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Associa tion ISBN 1-882621-32-8, 2007

[3] EP, Microbiological Examination_of non-sterile products, 4th edition, published by the European Pharmacopoeia, 2002

[4] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, published by the U.S. Food and Drug Administration, 1995, http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23.html.

[5] JP 14, General Tests - Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001

[6] USP 28, Microbial Limit test (61), published by the u.s. Pharmacopoeia, 2005.

[7] ATLAS R.M., Handbook of Microbiological Media, CRC Press, 1993

...

...

...

[9] ISO 21149, Cosmetics - Microbiology - Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria

[10] ISO 18415, Cosmetics - Microbiology - Detection of specified and non-specified microorganisms

[11] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics - Basic bactericidal activity Testmethod and requirements (phase 1)

[12] KELLY J.P. & FUNIGIELLO F., Candida albicans: A study of media designed to promote chlamydospore production, J. Lab. Clin. Med, 1959, 53, pp.807-809.

[13] GORDON M.A., & LITTLE G.N., Effective dehydrated media with surfactants for identification of Candida albicans, J. of Int. Soc. for Human and Animal Mycol, 1963, 2 pp.171-175

[14] ISO 16212, Cosmetics -Microbiolo9y - Enumeration of yeast and mould

[15] EVANS E.G.V..& RICHARD M.D., Medical mycology: a practical approach, Oxford University

[16] ISO 29621, Cosmetics - Microbiology - Guidelinesfor the risk assessment and identification of microbiologically low-risk products

...

...

...

Lời nói đầu

Lời giới thiệu

1  Phạm vi áp dụng

2  Tài liệu viện dẫn

3  Thuật ngữ và định nghĩa

3.1  Sản phẩm (product)

3.2  Mẫu (sample)

3.3  Hỗn dịch ban đầu (initial suspension)

3.4  Mẫu pha loãng (sample dilution)

...

...

...

3.6  Candida albicans

3.7  Môi trường tăng sinh lỏng (enrichment broth)

4  Nguyên tắc

5  Dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

5.1  Quy định chung

5.2  Dung dịch pha loãng cho hỗn dịch nấm men (dung dịch trypton natri clorid)

5.3  Môi trường nuôi cấy

6  Dụng cụ

7  Chủng vi sinh vật

...

...

...

9  Cách tiến hành

9.1  Khuyến cáo chung

9.2  Chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu trong môi trường tăng sinh lỏng

9.3  Ủ dịch hỗn dịch ban đầu trong môi trường tăng sinh lỏng

9.4  Phát hiện và định danh Candida albicans

10  Biểu thị kết quả (phát hiện Candida albicans)

11  Trung hòa thuộc tính kháng vi sinh vật của sản phẩm

11.1  Quy định chung

11.2  Chuẩn bị chủng cấy

...

...

...

12  Báo cáo thử nghiệm

Phụ lục A (Tham khảo) Các môi trường nuôi cấy khác

Phụ lục B (Tham khảo) Các chất trung hòa hoạt tính kháng vi sinh vật của chất bảo quản và các dung dịch rửa / lọc

Thư mục tài liệu tham khảo