• Số hiệu: TCVN7535:2005
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: Bộ Khoa học và Công nghệ
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: 17/02/2006

CFA	là nồng độ dung dịch formalđehyt gốc, tính theo mg/10 ml;
V0	là thể tích dung dịch thiosulphat dùng để chuẩn dung dịch trắng, tính theo ml;
V1	là thể tích dung dịch thiosulphat dùng để chuẩn mẫu thử, tính theo ml;
MFA	là khối lượng phân tử của formalđehyt, 30,08 g/mol;
c1	là nồng độ của dung dịch thiosulphat, M.

4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC)

4.1. Nguyên tắc

Quá trình này có tính chọn lọc. Formalđehyt được tách ra và định lượng như một dẫn xuất của các anđehyt và xeton khác bằng phương pháp sắc ký lỏng. Chất được phát hiện là formalđehyt tự do và formalđehyt bị thủy phân trong quá trình tinh chiết để tạo ra formalđehyt tự do.

Mẫu thử được rửa bằng nước ở 40 ^oC. Nước rửa giải được trộn với 2,4 đinitrophenyldrazin, khi đó alđehyt và xeton sẽ phản ứng để tạo ra hydrazin tương ứng. Các hydrazin được tách bằng phương pháp HPLC đảo pha, được phát hiện ở bước sóng 350 nm và định lượng.

4.2. Hóa chất

Trừ khi có yêu cầu khác, chỉ sử dụng hóa chất có cấp độ phân tích. Nước phải được khử khoáng và là nước loại 3 theo TCVN 4851-89 (ISO 3696 : 1987). Tất cả các dung dịch là dung dịch nước.

4.2.1. Natri dodecylsulphonat 0,1 % (chất tẩy rửa), 1 g trong 1 000 ml nước;

4.2.2. DNPH 0,3 % (2,4 đinitrophenylhydrazin) trong axit o-phosphoric đặc (85 %). (DNPH được kết tinh lại từ axetonitril 25 % trong nước).

4.2.3. Axetonitril

...

...

...

4.3.1. Phễu lọc có màng lọc sợi thủy tinh, GF8 (hoặc phễu lọc thủy tinh G 3, đường kính từ 70 mm - 100 mm);

4.3.2. Bếp cách thủy, được ổn định nhiệt độ ở 40 ^oC ± 0,5 ^oC, phù hợp với thiết bị lắc hoặc khuấy;

4.3.3. Nhiệt kế, chia độ đến 0,1 ^oC trong khoảng từ 20 ^oC đến 50 ^oC;

4.3.4. Hệ thống HPLC với đầu dò UV, ở bước sóng 350 nm;

4.3.5. Màng lọc polyamid, 0,45 mm;

4.3.6. Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.4. Quá trình xác định formalđehyt có trong da

4.4.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

Nếu có thể lấy mẫu thử phù hợp với TCVN 7117 (ISO 2418) và nghiền da theo TCVN 7126 : 2002 (ISO 4044 : 1977). Nếu không thể lấy mẫu theo TCVN 7117 (ISO 2418) (ví dụ da lấy từ sản phẩm đã hoàn tất như giày ủng, quần áo) thì chi tiết của quá trình lấy mẫu phải được ghi trong báo cáo thử nghiệm.

...

...

...

4.4.2. Chiết formalđehyt

Cân 2 g ± 0,1 g da cho vào bình tam giác 100 ml. Thêm 50 ml dung dịch chất tẩy rửa (4.2.1) (đun ấm trước đến 40 ^oC) và đậy kín bình bằng nút thủy tinh (xem chú thích). Hỗn hợp trong bình được khuấy hoặc lắc nhẹ nhàng ở 40 ^oC ± 0,5 ^oC trên bếp cách thủy (4.3.2) trong 60 phút ± 2 phút. Dung dịch chiết đã đun ấm được lọc chân không ngay lập tức qua phễu lọc thủy tinh (4.3.1) vào một bình tam giác. Dung dịch lọc để trong bình kín được làm nguội đến nhiệt độ phòng (18 ^oC đến 26 ^oC).

CHÚ THÍCH: Tỉ lệ da/dung dịch phải không được thay đổi. Việc chiết và phân tích phải được thực hiện trong cùng một ngày.

4.4.3. Phản ứng với DNPH

Dùng pipet lấy 4,0 ml axetonitril (4.2.3), 5,0 ml dung dịch nước rửa giải đã lọc và 0,5 ml dung dịch DNPH (4.2.2) cho vào bình định mức 10 ml. Bình định mức được cho thêm nước đã khử khoáng đầy đến vạch mức và lắc mạnh bằng tay để trộn đều hỗn hợp. Để nguyên bình ít nhất trong 60 phút, nhưng tối đa không quá 180 phút. Sau khi lọc qua màng lọc (4.3.5) mẫu thử được tiến hành chạy sắc ký. Nếu nồng độ của mẫu vượt ngoài khoảng hiệu chuẩn thì lấy một lượng nhỏ hơn. (Nên dùng thủ tục thêm chuẩn).

4.4.4. Điều kiện HPLC (khuyến nghị)

Tốc độ dòng

1,0 ml/phút

Pha động

...

...

...

Cột tách

Merck 100, CH 18,2 (tráng phủ dày, 12 % C) + precolumn (1 cm, RP18)

Bước sóng phát hiện UV

350 nm

Thể tích bơm:

20 ml

4.4.5. Hiệu chuẩn HPLC

Dùng pipet lấy 0,5 ml dung dịch formalđehyt gốc (3.2) có hàm lượng formalđehyt đã biết chính xác cho vào bình định mức 500 ml, trước đó bình đã có khoảng 100 ml nước, trộn đều, cho thêm nước đến vạch mức, và trộn đều lại. (Nồng độ khoảng 2 mg formalđehyt/ml).

Dung dịch này là dung dịch chuẩn.

...

...

...

4.4.6. Tính toán nồng độ formalđehyt trong mẫu da

C_F

là nồng độ formalđehyt có trong mẫu thử chính xác đến 0,01 mg/kg, tính theo mg/kg;

C_S

là nồng độ formalđehyt thu được từ đồ thị hiệu chuẩn tính theo mg/10 ml;

F

là hệ số pha loãng;

E_W

...

...

...

4.4.7. Tạo mẫu biết trước - Xác định tỉ lệ thu hồi

Cho 4 ml axetonitril vào bình định mức 10 ml sau đó thêm 2,5 ml dung dịch lọc thu được như mô tả trong điều 4.4.2. Sau đó cho thêm một thể tích đã được xác định chính xác của dung dịch formalđehyt chuẩn để thu được dung dịch có nồng độ gần tương đương với dung dịch xác định được trong mẫu thử.

Dung dịch này được xử lý tương tự như mô tả ở 4.4.5 và C_S2 được xác định tương tự 4.4.3. Tiến hành xác định hai lần và ghi kết quả trung bình và giá trị riêng lẻ trong báo cáo thử nghiệm.

C_S2

là nồng độ formalđehyt thu được từ đồ thị hiệu chuẩn tính theo mg/10 ml;

C_S

là nồng độ formalđehyt trong mẫu thử không pha tính theo mg/10 ml;

C_FA1

...

...

...

RR

là tỉ lệ thu hồi làm tròn đến 0,1 %, tính bằng phần trăm.

5. Phương pháp so màu

5.1. Phạm vi áp dụng

Hàm lượng formalđehyt thu được là lượng formalđehyt có trong nước chiết từ da ở điều kiện mô tả dưới đây tương ứng với lượng da đem cân.

Quy trình này không chọn lọc hoàn toàn. Chất phát hiện không chỉ có formalđehyt tự do mà còn có cả formalđehyt bị thủy phân trong quá trình chiết để thu formalđehyt tự do.

5.2. Nguyên tắc

Mẫu da được rửa bằng nước ở 40 ^oC. Nước rửa giải được xử lý với axetylaxeton, nhờ đó formalđehyt phản ứng tạo thành hợp chất màu vàng (3,5 - điaxetyl - 1,4 - đihydrotoluiđin). Độ hấp thụ của hợp chất này được đo ở bước sóng 412 nm. Lượng formalđehyt tương ứng với giá trị độ hấp thụ của mẫu thử thu được từ đường cong hiệu chuẩn được chuẩn bị trong cùng điều kiện.

5.3. Hóa chất

...

...

...

5.3.1. Natri dodecylsulphonat 0,1 % (chất tẩy rửa), 1g trong 1 000 ml nước;

5.3.2. 150 g amoni axetat + 3 ml axit axetic băng + 2 ml axetylaxeton (pentan 2,4 đion, CAS 123-54-6) trong 1 000 ml nước. Chuẩn bị dung dịch trong ngày và để trong chỗ tối (dung dịch này nhạy với ánh sáng);

5.3.3. 150 g amoni axetat + 3 ml axit axetic băng trong 1 000 ml nước;

5.3.4. 5 g đimeđon trong 1 000 ml nước (đimeđon = meton = 5,5'-Đimetyl-1,3-cyclohexanđion, CAS 126-81-8).

CHÚ THÍCH: Đimeđon không thể hòa tan ngay lập tức trong nước tinh khiết. Trong trường hợp này có thể hòa tan đimeđon trong một lượng nhỏ etanol trước, sau đó pha với nước đến thể tích yêu cầu.

5.4. Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị tương tự như trong điều 4.3 nêu trên.

5.4.1. Quang phổ kế có cuvet thích hợp có thể đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm. Nên dùng cuvet có độ dày là 20 mm.

5.5. Chuẩn bị và chuẩn hóa dung dịch formalđehyt gốc

...

...

...

5.6. Cách tiến hành xác định formalđehyt trong da

5.6.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

Nếu có thể, lấy mẫu thử phù hợp với TCVN 7117 (ISO 2418) và nghiền da theo TCVN 7126 : 2002 (ISO 4044 : 1977). Nếu không thể lấy mẫu theo TCVN 7117 (ISO 2418) (ví dụ da lấy từ sản phẩm đã hoàn tất như giày ủng, quần áo) thì chi tiết của quá trình lấy mẫu phải được ghi trong báo cáo thử nghiệm.

Trước khi cân, điều hòa mẫu thử đã nghiền theo TCVN 7115 (ISO 2419)

5.6.2. Chiết formalđehyt

Cân 2 g ± 0,1 g mẫu da cho vào bình tam giác 100 ml. Thêm 50 ml dung dịch chất tẩy rửa (5.3.1) (được đun ấm trước đến 40 ^oC) và đậy bình bằng nút thủy tinh (xem chú thích). Hỗn hợp trong bình được khuấy hoặc lắc nhẹ nhàng ở 40 ^oC ± 0,5 ^oC trên bếp cách thủy (4.3.2) trong khoảng 60 phút ± 2 phút. Dung dịch chiết đã đun ấm được lọc chân không ngay lập tức qua phễu lọc thủy tinh (4.3.1) vào một bình tam giác. Dung dịch lọc để trong bình kín được làm nguội đến nhiệt độ phòng (18 ^oC đến 26 ^oC).

CHÚ THÍCH: Tỉ lệ da/dung dịch phải không được thay đổi. Việc chiết và phân tích phải được thực hiện trong cùng một ngày.

5.6.3. Phản ứng với axetylaxeton

Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch vừa thu được theo 5.6.2 cho vào bình tam giác 25 ml và thêm 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2). Đậy kín bình bằng nút thủy tinh. Dung dịch được khuấy trong khoảng thời gian 30 phút ± 1 phút ở nhiệt độ 40 ^oC ± 1 ^oC. Sau khi để nguội (trong bóng tối), đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 412 nm đối chiếu với dung dịch mẫu trắng là hỗn hợp của 5 ml dung dịch chất tẩy rửa (5.3.1) + 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2). Độ hấp thụ đo được ký hiệu là E_p.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Lấy một phần chia nhỏ hơn đối với da có hàm lượng formalđehyt cao (> 75 mg/kg). Đối với các phần chia nhỏ hơn 5 ml cho thêm nước để đạt đến 5 ml.

Ví dụ: hàm lượng formalđehyt: 500 mg/kg.

Cách tiến hành: dùng pipet lấy 0,5 ml dung dịch lọc (5.6.2) cho vào bình tam giác 25 ml, thêm 4,5 ml nước. Sau đó tiến hành theo qui trình mô tả ở trên.

5.6.4. Kiểm tra thuốc thử không có formalđehyt

Tiến hành đo hỗn hợp 5 ml dung dịch chất tẩy rửa (5.3.1) + 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2) so sánh với 5 ml dung dịch chất tẩy rửa (5.3.1) + 5 ml nước. Độ hấp thụ đo được không được lớn hơn 0,025 (đo với cuvet 20 mm ở bước sóng 412 nm).

5.6.5. Thử các hợp chất khác có khả năng tạo màu với axetylaxeton

Lấy 5 ml dung dịch lọc thu được theo điều 5.6.2 trộn với 1 ml dung dịch đimeđon (5.3.4) và đun ấm đến 40 ^0C ± 1 ^oC trong 10 phút ± 1 phút. Cho thêm 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2) và để hỗn hợp trong 30 phút ± 1 phút ở nhiệt độ 40 ^oC ± 1 ^oC. Trong lúc để nguội đến nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm đối chiếu với dung dịch mẫu trắng, dung dịch này thay cho dung dịch lọc (5.6.2) có chứa 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2). Độ hấp thụ này phải nhỏ hơn 0,05 (đo với cuvet 20 mm) nếu formalđehyt phát hiện có trong mẫu da.

5.6.6. Hiệu chuẩn

Dùng pipet lấy 3 ml dung dịch formalđehyt gốc thu được từ 3.2, đã biết chính xác lượng formalđehyt cho vào bình định mức 1 000 ml đã có 100 ml nước. Trộn đều hỗn hợp và cho thêm nước đầy đến vạch mức và trộn đều lại. Dung dịch này là dung dịch chuẩn dùng để hiệu chuẩn (nghĩa là dung dịch chuẩn khoảng 6 mg/ml).

...

...

...

Từ mỗi dung dịch này, dùng pipét lấy 5 ml và trộn với 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2) cho vào bình tam giác 25 ml. Hỗn hợp này được lắc mạnh và đun ấm đến 40 ^oC ± 1 ^oC trong 30 phút ± 1 phút.

Trong lúc để nguội hỗn hợp đến nhiệt độ phòng (tránh ánh sáng) tiến hành chụp phổ ở bước sóng 412 nm cho dung dịch mẫu trắng gồm 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2) và 5 ml nước.

Trước khi đo, đặt máy quang phổ về điểm "0"với dung dịch mẫu trắng (5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2) và 5 ml nước), đã được xử lý dưới cùng điều kiện với dung dịch hiệu chuẩn.

Nồng độ tính theo mg/ml, được vẽ vào đồ thị hiệu chuẩn tương ứng với độ hấp thụ đo được, trục x: nồng độ tính bằng mg/ml, trục y: độ hấp thụ.

5.6.7. Tính toán hàm lượng  formalđehyt có trong da

C_P

là nồng độ formalđehyt có trong mẫu da làm tròn đến 0,1 mg/kg, tính theo mg/kg;

E_P

...

...

...

E_e

là độ hấp thụ của dung dịch lọc (màu ban đầu);

V₀

là thể tích dung dịch rửa giải (điều kiện chuẩn: 50 ml), tính theo ml;

V_a

là phần chia từ dung dịch lọc (điều kiện chuẩn: 5 ml), tính theo ml;

V_f

là thể tích của dung dịch thu được theo 5.6.3 sau khi phản ứng (điều kiện chuẩn: 10 ml), tính theo ml;

F

...

...

...

W

là khối lượng mẫu da, tính theo g.

5.6.8. Tạo mẫu biết trước và tỉ lệ thu hồi

Dùng pipet lấy 2,5 ml (xem chú thích 1) của dung dịch lọc thu được theo 5.6.2 cho vào hai bình định mức 10 ml. Cho vào một bình định mức một thể tích được xác định chính xác của dung dịch formalđehyt chuẩn để hiệu chuẩn (5.6.6) để đạt đến nồng độ xấp xỉ bằng nồng độ xác định được trong mẫu da (xem chú thích 2). Cả hai bình được làm đầy bằng nước đến vạch mức.

Sau đó chuyển lượng dung dịch trong các bình định mức sang các bình tam giác 25 ml riêng biệt, thêm 5 ml thuốc thử (5.3.2) vào mỗi bình và khuấy trong 30 phút ± 1 phút ở 40 ^oC ± 1 ^oC.

Sau khi đã được làm nguội (tránh ánh sáng), tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm với dung dịch mẫu trắng thu được từ 5 ml dung dịch chất tẩy rửa (5.3.1) + 5 ml dung dịch thuốc thử (5.3.2). Độ hấp thụ của mẫu đã biết trước được ký hiệu là E_A. Độ hấp thụ của mẫu không biết trước được ký hiệu là E_P.

CHÚ THÍCH 1: Nếu lượng formalđehyt có trong da nhỏ hơn 20 mg/kg, lấy phần chia 5 ml thay vì 2,5 ml.

CHÚ THÍCH 2: Ví dụ: Nếu lượng formalđehyt có trong da là 30 mg/kg thì pha với 0,5 ml dung dịch formalđehyt chuẩn (5.6.6).

...

...

...

là độ hấp thụ của mẫu đã biết trước;

E_p

là độ hấp thụ của mẫu không biết trước;

E_zu

là độ hấp thụ mong muốn của lượng formalđehyt thêm vào (từ đồ thị hiệu chuẩn);

RR

là tỉ lệ thu hồi làm tròn đến 0,1 %, tính theo phần trăm.

Nếu tỉ lệ thu hồi (RR) không nằm trong khoảng 80 % - 120 % thì tiến hành phân tích lại.

6. Biểu thị kết quả

...

...

...

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) loại, nguồn gốc, mô tả mẫu da phân tích và phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;

c) quy trình phân tích đã sử dụng;

d) kết quả phân tích về hàm lượng formalđehyt tự do;

e) bất kỳ sự sai lệch nào so với quy trình phân tích, đặc biệt là các bước thêm vào;

f) ngày thử nghiệm.

...

...

...

(tham khảo)

Độ chính xác

A.1 Độ chính xác của phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC)

Số liệu sau đây thu được từ liên phòng thí nghiệm với 10 phòng thử nghiệm mẫu da có số lượng formalđehyt chưa biết.

Mẫu da

Hàm lượng formalđehyt trung bình

mg/kg

Độ lặp lại (mg/kg)

r

...

...

...

R

Tỉ lệ thu hồi

%

A

7,65

1,27

3,13

94

B

...

...

...

3,82

7,97

96

C

28,69

5,40

11,42

91

D

...

...

...

20,82

64,33

94

A.2 Độ chính xác của phương pháp so màu

Số liệu sau đây thu được từ liên phòng thí nghiệm với 15 phòng thử nghiệm mẫu da có lượng formalđehyt chưa biết.

Mẫu da

Hàm lượng formalđehyt trung bình

mg/kg

Độ lặp lại (mg/kg)

...

...

...

Độ tái lập (mg/kg)

R

Tỉ lệ thu hồi

%

A

9,49

1,74

3,86

96

...

...

...

19,14

2,23

7,10

94

C

30,41

2,94

8,52

98

...

...

...