TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
9051-1:2012
ISO
5765-1:2002
SỮA BỘT, HỖN HỢP KEM LẠNH DẠNG BỘT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN -
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTOZA - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP ENZYM SỬ DỤNG NHÓM CHỨC
GLUCOZA CỦA LACTOZA
Dried milk, dried
ice-mixes and processed cheese - Determination of lactose content - Part 1: Enzymatic method
utilizing the
glucose moiety of the lactose
Lời nói đầu
TCVN 9051-1:2012 hoàn toàn tương đương
với ISO 5765-1:2002;
TCVN 9051-1:2012 do Cục An toàn vệ
sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường
Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;
Bộ tiêu chuẩn TCVN 9051 (ISO 5765), Sữa
bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột và phomat chế biến - Xác định hàm lượng lactoza
gồm các phần sau đây:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
TCVN 9051-2:2012 (ISO 5765-2:2002), Sữa
bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột và phomat chế biến - Xác định hàm lượng lactoza
- Phần 2: Phương pháp enzym sử dụng nhóm chức galactoza của lactoza.
SỮA BỘT, HỖN
HỢP KEM LẠNH DẠNG BỘT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTOZA - PHẦN 1:
PHƯƠNG PHÁP ENZYM SỬ DỤNG NHÓM CHỨC GLUCOZA CỦA LACTOZA
Dried milk, dried
ice-mixes and processed cheese - Determination of lactose content - Part 1: Enzymatic method
utilizing the
glucose moiety of the lactose
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp
enzym để xác định hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột, hỗn hợp kem lạnh dạng
bột khi có mặt các loại cacbohydrat khác và các chất khử trong phomat chế biến.
2. Thuật ngữ và định
nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ
và định nghĩa sau đây:
2.1. Hàm lượng
lactoza (lactose content)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Hàm lượng lactoza được biểu
thị bằng phần trăm khối lượng.
3. Nguyên tắc
3.1. Dung dịch hoặc huyền
phù từ phần mẫu thử được tách protein để thu được dịch chiết tinh sạch.
3.2. Dịch chiết đã tinh sạch
của phần mẫu thử được cho phản ứng với các enzym và các hợp chất sinh hóa sau
đây:
a) b-galactosidaza để
tách lactoza thành glucoza và galactoza;
b) hexokinaza và adenosin triphosphat
(ATP) để phosphoryl hóa glucoza (cả hai vốn có sẵn và được giải phóng bởi b-galactosidaza) thành
glucoza 6-phosphat (G6P);
c) glucoza 6-phosphat dehydrogenaza
(G6P-DH) khi có mặt nicotinamid adenin dinucleotid phosphat (NADP+)
để xúc tác oxi hóa G6P thành 6-phosphogluconat, NADP+ được khử thành
NADPH.
3.3. Lượng NADPH xác định
được bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch thử ở bước sóng 340 nm.
3.4. Hàm lượng lactoza tạo
ra tỷ lệ thuận với lượng NADPH và có thể tính được bằng cách hiệu chỉnh hàm lượng
glucoza có mặt trong mẫu thử khi bắt đầu phân tích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh
khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. Nước sử dụng để chuẩn bị các dung dịch
enzym phải là nước được chưng cất hai lần bằng dụng cụ thuỷ tinh. Nước sử dụng
cho các mục đích khác là nước được chưng cất bằng dụng cụ thuỷ tinh hoặc có độ
tinh khiết tương đương.
Cần chú ý ngày sản xuất và hạn sử dụng
của các thuốc thử.
Nếu sử dụng huyền phù enzym có hoạt độ
khác với quy định này thì thể tích của huyền phù nêu trong (7.6.1) phải được
tăng lên hoặc giảm đi tương ứng.
CHÚ THÍCH: Các thuốc thử nêu trong 4.3
và 4.5 đến 4.7 có thể có bán sẵn trên thị trường làm hỗn hợp thử, ví dụ bộ kít
thử Boehringer1).
4.1. Dung dịch kali hexacyanoferat(ll), K4[Fe(CN)6]
Hòa tan trong nước 3,6 g kali
hexacyanoferat(ll) ngậm ba phân tử nước. Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn.
4.2. Dung dịch
kẽm sulfat, ZnSO4
Hòa tan trong nước 7,2 g kẽm sulfat ngậm
bảy phân tử nước. Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn.
4.3. Dung dịch natri
hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.4. Dung dịch
đệm xitrat, pH 6,6 ± 0,1
Hòa tan 2,8 g trinatri xitrat ngậm hai
phân tử nước (C6H5O7Na3.2H2O),
0,042 g axit xitric ngậm một phân tử nước (C6H8O7.H2O)
và 0,625 g magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O)
trong khoảng 40 ml nước.
Chỉnh pH đến 6,6 ±0,1 ở 20 °C bằng
axit sulfuric (2 mol/l) hoặc dung dịch natri hydroxit (0,1 mol/l). Pha loãng bằng
nước đến 50 ml và trộn.
Khi dung dịch này được bảo quản trong
tủ lạnh ở nhiệt độ trong khoảng từ 0 °C đến 5 °C thì có thể bền được 3 tháng.
4.5. Dung dịch đệm
trietanolamin (TEA), pH 7,6 ± 0,1
Hòa tan 14,0 g trietanolamin
hydroclorua (C6H15NO3.HCI) và 0,25 g magie sulfat
ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O) trong khoảng 80 ml nước.
Chỉnh pH đến 7,6 ± 0,1 ở 20 °C bằng khoảng 5 ml dung dịch natri hydroxit (5
mol/l). Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn.
Khi dung dịch này được bảo quản trong
tủ lạnh ở nhiệt độ trong khoảng từ 0 °C đến 5 °C thì có thể bền được 8 tuần.
4.6. Dung dịch đệm NADP+/ATP/TEA
Hòa tan 65 mg muối dinatri nicotilamid
adenin dinucleotid phosphat [C21H26N7O17P3Na2
(có độ tinh khiết từ 98 % đến 99 %)] và 170 mg muối dinatri adenosin
5'-triphosphat [C10H14N5O13P3Na2
(có độ tinh khiết từ 99 % đến 100 %)] trong 30 ml dung dịch đệm trietanolamin
(4.6).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.7. Huyền phù b-galactosidaza (từ Escherichia
coli), tạo huyền phù trong dung dịch amoni sulfat 3,2 mol/l, có pH xấp xỉ bằng
6.
Hoạt tính của huyền phù b-galactosidaza (EC
3.2.1.23)[5] phải lớn hơn hoặc bằng 60 đơn vị/ml (lactoza làm cơ chất
ở 25 °C). Khi huyền phù này được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ trong khoảng
từ 0 °C đến 5 °C thì có thể bền được 12 tháng. Khi sử dụng, phải ngâm lọ đựng
huyền phù trong đá nghiền.
CHÚ THÍCH: Huyền phù b-galactosidaza có chứa
không quá 0,001 % mỗi loại b-fructosidaza, a-galactosidaza, glucoza dehydrogenaza, a-glucosidaza và
NADH-oxidaza, được tính theo hoạt tính đặc trưng của b-galactosidaza cho thấy
thích hợp.
4.8. Huyền phù HK/G6P-DH (từ nấm
men), tạo huyền phù trong dung dịch amoni sulfat 3,2 mol/l, có pH xấp xỉ bằng
6.
Hoạt độ của huyền phù hexokinaza (EC
2.7.1.1)[5] phải bằng hoặc lớn hơn 280 đơn vị/ml ở 25 °C.
Glucoza-6-phosphat dehydrogenaza (EC 1.1.1.49)[5] phải bằng hoặc lớn
hơn 140 đơn vị/ml ở 25 °C.
Khi huyền phù này được bảo quản trong
tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 °C đến 5 °C thì có thể bền được 1 năm. Khi sử dụng, phải
ngâm lọ đựng huyền phù trong đá nghiền.
CHÚ THÍCH: Huyền phù HK/G6P-DH chứa nhỏ
hơn 0,01 % 6-phosphogluconat dehydrogenaza và nhỏ hơn 0,01 % phosphoglucomutaza,
nhỏ hơn 0,002 % phosphogluco-isomeraza và nhỏ hơn 0,02 % glutathion reductaza, tính
theo hoạt độ đặc trưng của HK/G6P-DH là thích hợp.
4.9. Dung dịch chuẩn
lactoza,
c(C12H22O11.H2O) = 0,8
mg/ml
Trước khi sử dụng, sấy khô lactoza ngậm
một phân tử nước đến khối lượng không đổi trong tủ sấy (5.13) ở 87 °C.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5. Thiết bị dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của
phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1. Cân phân tích, có thể cân
chính xác đến 1 mg và có thể đọc được đến 0,1 mg.
5.2. Cốc có mỏ, dung tích
50 ml và 250 ml.
5.3. Pipet chia độ, có
thể phân phối được 5 ml và 10 ml, được chia các vạch 0,1 ml.
5.4. Pipet, có thể phân phối được
10 ml, 5 ml, 1 ml, 0,2 ml và 0,05 ml.
5.5. Bình định mức một vạch, dung tích
100 ml.
5.6. Giấy lọc gấp nếp, loại trung
bình, đường kính khoảng 15 cm.
5.7. Phễu lọc, đường kính khoảng 7
cm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.9. Que khuấy bằng chất dẻo, dùng để trộn
hỗn hợp mẫu/enzym trong cuvet.
5.10. Đũa thủy tinh, đường kính
khoảng 6 mm, dài 150 mm để làm ướt mẫu
5.11. Nồi cách thuỷ, có thể duy
trì nhiệt độ trong khoảng từ 20 °C đến 25 °C, có giá đỡ thích hợp để giữ cuvet
đo phổ (5.8) (tùy chọn, xem 7.6).
CHÚ THÍCH: Ngâm cuvet trong nồi cách
thủy chỉ khi nhiệt độ phòng thấp dưới 20 °C.
5.12. Thiết bị trộn, thích hợp để
chuẩn bị huyền phù phần mẫu thử là phomat chế biến (ví dụ: Ultra Turrax2)).
5.13. Tủ sấy, khống chế nhiệt độ ổn
định, có thể duy trì được nhiệt độ 87 °C ± 2 °C.
5.14. Dụng cụ nghiền hoặc xay,
có thể nghiền hoặc xay phomat và dễ dàng làm sạch.
6. Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu
chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7. Cách tiến hành
7.1. Phép thử để kiểm tra quy trình
7.1.1. Tiến hành phép thử
sau đây để kiểm tra độ thu hồi lactoza khi áp dụng một hoặc một số điều kiện dưới
đây:
a) nếu sử dụng mẻ mới của dung dịch đệm
NADP+/ATP/TEA (4.6), huyền phù b-galactosidaza (4.7)
và/hoặc HK/G6P-DH (4.8);
b) nếu dung dịch đệm NADP+/ATP/TEA
(4.6), huyền phù b-galactosidaza
(4.7) và/hoặc huyền phù HK/G6P-DH (4.8) đã được bảo quản trong tủ lạnh quá 2 tuần
mà chưa sử dụng;
c) nếu bắt đầu lại công việc phân tích
sau một khoảng thời gian nghỉ;
d) nếu có điều chỉnh trong khi thực hiện
phép thử.
7.1.2. Dùng pipet lấy 5,0
ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn lactoza (4.9) cho vào từng bình định mức 100 ml
(5.5) tương ứng. Thêm khoảng 50 ml nước vào mỗi bình. Tiến hành theo 7.5 và
7.6.
7.1.3. Tính hàm lượng
lactoza ngậm một phân tử nước của dung dịch chuẩn lactoza (4.9) theo công thức
(3) (xem 8.1), nhưng sử dụng các giá trị sau đây:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
V4 là thể tích dung dịch
chuẩn lactoza đã sử dụng (7.1.2), V4 = 5 ml và 10 ml tương ứng;
V5 là thể tích dung dịch
chuẩn lactoza đã pha loãng (7.1.2), V5 = 100 ml.
7.1.4. Tính đến độ tinh khiết
của lactoza ngậm một phân tử nước thì độ thu hồi thu được đối với cả hai dung dịch
(7.1.2) phải nằm trong dải 100 % ± 2 %.
Nếu độ thu hồi nằm ngoài dải này thì
kiểm tra lại thuốc thử, kỹ thuật thao tác, độ chính xác của pipet và điều kiện
của máy đo phổ. Cần thực hiện chính xác để thu được kết quả thích hợp. Lặp lại
phép thử để kiểm tra quy trình cho đến khi thu được các kết quả thích hợp .
7.2. Chuẩn bị mẫu thử
7.2.1. Sữa bột và hỗn hợp kem lạnh dạng
bột
Chuyển mẫu thử sang hộp đựng có nắp đậy
kín khí, có dung tích lớn gấp đôi thể tích mẫu. Đậy ngay nắp hộp. Trộn kỹ mẫu bằng
cách lắc và đảo chiều hộp đựng mẫu.
7.2.2. Phomat chế biến
Loại bỏ phần cùi, đốm bẩn hoặc lớp mốc
trên bề mặt của phomat sao cho phần mẫu thử đúng là đại diện cho phomat thường
dùng. Nghiền hoặc xay mẫu thử bằng dụng cụ thích hợp (5.14). Trộn nhanh phần khối
lượng mẫu thử đã nghiền hoặc xay và nghiền hoặc xay lần thứ hai, nếu có thể. Trộn
kỹ lại. Nếu phần mẫu thử không thể nghiền thì trộn kỹ mẫu thử bằng cách khuấy
và trộn mạnh.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ngay sau khi nghiền, xay hoặc khuấy và
trộn bằng dao, chuyển phần mẫu thử thu được vào cốc thủy tinh có mỏ 250 ml
(5.2). Thêm cùng một lượng nước, dùng thiết bị trộn (5.12) để tạo hỗn hợp huyền
phù.
7.3. Phần mẫu
thử
Cân khoảng 1 g hoặc một lượng lớn hơn
của mẫu thử đã chuẩn bị (7.2.1) hoặc huyền phù của mẫu thử (7.2.2), chính xác tới
1 mg, cho vào cốc có mỏ 100 ml (5.2). Hòa hoặc tao huyền phù mẫu thử trong ít
nhất 20 ml nước đã được làm ấm trước đến khoảng từ 40 °C đến 50 °C, sử dụng đũa
thuỷ tinh (5.10) hoặc thiết bị trộn (5.12). Chuyển định lượng lượng chứa trong
cốc có mỏ sang bình định mức 100 ml (5.5). Pha loãng bằng nước đến khoảng 60 ml
và trộn.
Khi xác định khối lượng phần mẫu thử cần
lấy, phải xem xét đến các yếu tố sau đây:
- phần mẫu thử phải đại diện cho toàn
bộ mẫu thử;
- hàm lượng lactoza trong cuvet đo phổ
tốt nhất là trong khoảng từ 5 mg
đến 100 mg;
- độ hấp thụ (A2) của dung
dịch trong cuvet đo phổ đối với glucoza trong mẫu thử (xem 8.1), nên trong khoảng
từ 0,1 đến 0,4;
- nếu phần khối lượng lactoza trong phần
mẫu thử nhỏ hơn 0,2 % thì cần nhiều hơn 1 g phần mẫu thử. Khi đó, thể tích chất
béo, protein và các chất khác kết tủa trong 7.5.1 có thể có ảnh hưởng đáng kể đến
thể tích phần mẫu thử (xem V3 trong 8.1).
7.4. Phép
thử mẫu trắng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.5. Loại protein
7.5.1. Thêm theo thứ tự dưới
đây, vào dung dịch thử hoặc huyền phù mẫu thử (7.3) đựng trong bình định mức một
vạch 100 ml:
- 5,0 ml dung dịch kali
hexacyanoferat(ll) (4.1);
- 5,0 ml dung dịch kẽm sulfat (4.2) và
- 10,0 ml dung dịch natri hydroxit
(4.3), khuấy kỹ sau mỗi lần thêm.
Thêm nước đến vạch 100 ml và trộn kỹ.
Sau khi thu được hỗn hợp, để yên 30
min. Không làm xáo trộn lượng chứa trong bình định mức trước khi lọc.
7.5.2. Lọc phần nổi phía
trên qua giấy Iọc (5.6), loại bỏ phần địch lọc đầu tiên.
7.6. Tiến hành xác định
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiến hành xác định theo sơ đồ trong Bảng
1, chú ý để đưa dung dịch đệm xitrat (4.4), dung dịch đệm NADP+/ATP/TEA
(4.6) và nước về nhiệt độ phòng (từ 20 °C đến 25 °C) trước khi sử dụng.
Bảng 1 - Sơ đồ
xác định
Phép thử đối
với mẫu hoặc chất chuẩn
Phép thử mẫu
trắng
lactoza và
glucoza
glucoza
lactoza và
glucoza
glucoza
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dung dịch đệm xitral (4.4)
0,20 ml
0,20 ml
0.20 ml
0,20 ml
Huyền phù b-galactosidaza
(4.7)
0,05 ml
-
0,05 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước
-
0,05 ml
-
0,05 ml
Dịch lọc của mẫu hoặc chất chuẩn
(7.5.2)
1,00 ml
1,00 ml
-
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dịch lọc của mẫu trắng
-
-
1,00 ml
1,00 ml
Trộn lượng chứa trong cuvet đo phổ,
dùng que khuấy bằng chất dẻo (5.9) rồi ủ 15 min ở nhiệt độ trên 20oC
trong nồi cách thủy (5.11), nếu cần.
Sau đó dùng pipet (5.4) thêm vào
cuvet đo phổ như sau:
Dung dịch đệm NADP+/ATP/TEA (4.6)
Nước
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,00 ml
1,00 ml
1,00 ml
1,00 ml
1,00 ml
1,00 ml
1,00 ml
Trộn lượng chứa trong cuvet đo phổ;
2 min sau khi trộn, đo độ hấp thụ Ao của dung dịch trong từng
cuvet dựa vào không khí khi đo ở bước sóng 340 nm
Sau đó dùng pipet (5.4) thềm vào
cuvet đo phổ như sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,05 ml
0,05 ml
0,05 ml
0,05 ml
Trộn lượng chứa trong cuvet đo phổ rồi
ủ 15 min ở nhiệt độ trên 20 °C trong nồi cách thủy (5.11), nếu cần. Đo độ hấp
thụ A15, của dung dịch trong từng cuvet so với không khí.
Sau 5 min, đo lại độ hấp thụ của từng
dung dịch. Nếu phản ứng chưa kết thúc thì tiếp tục đọc độ hấp thụ của từng
dung dịch sau các khoảng thời gian 5 min, cho đến khi độ hấp thụ ổn định sau
các khoảng 5 min liên tiếp.
7.6.2. Tính các độ hấp thụ
7.6.2.1. Nếu sau 15 min ủ mà
độ hấp thụ không tăng thì tính độ hấp thụ A, của lượng chứa trong từng cuvet để
sử dụng trong phép tính (xem 8.1), dùng công thức sau:
A = At
– A0 (1)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A0 là độ hấp thụ đo được
trước khi thêm huyền phù HK/G6P-DH;
At là độ hấp thụ đo được
sau khi ủ trong khoảng thời gian 15 min.
7.6.2.2. Nếu sau 15
min mà phản ứng vẫn chưa dừng thì tính độ hấp thụ A của lượng chứa trong từng cuvet
để sử dụng trong phép tính (xem 8.1), dùng công thức sau:
A = (At
– A0) -
(At – At-5) (2)
Trong đó:
A0 là độ hấp thụ đo được
trước khi thêm huyền phù HK/G6P-DH;
At là độ hấp thụ đo được
sau khi ủ trong khoảng thời gian t min;
A(t-5) là độ hấp thụ đo được
sau khi ủ trong khoảng thời gian (t-5) min.
7.6.3. Kiểm tra xác nhận
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8. Tính và biểu thị kết
quả
8.1. Tính
Hàm lượng lactoza, wL được
tính theo công thức sau:
wL
=
(3)
Trong đó:
wL là hàm lượng lactoza, tính
bằng phần trăm khối lượng;
A1 là độ hấp thụ (tính được
trong 7.6.2) của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về lactoza và glucoza;
A2 là độ hấp thụ (tính
được trong 7.6.2) của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về glucoza;
A3 là độ hấp thụ (tính
được trong 7.6.2) của phép thử mẫu trắng về lactoza và glucoza;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mr là khối lượng phân tử của
lactoza, đối với lactoza dạng khan thì Mr = 342,30 và lactoza ngậm một
phân tử nước thì Mr = 360,31;
K là hệ số hấp thụ phân tử của NADPH ở
340 nm (K = 6,3 x 106 cm2/mol);
/ là chiều dài đường quang lý thuyết của
cuvet, tính bằng centimet (1 cm);
V1 là tổng thể tích của chất
lỏng trong cuvet đo quang (7.6.1), tính bằng mililit (3,30 ml);
V2 là thể tích dịch lọc
(7.5.2) hoặc dung dịch pha loãng của dịch lọc (7.6.3) được cho vào cuvet đo phổ
(1,00 ml), tính bằng mililit (ml);
V3 là thể tích của dung dịch
được chuẩn bị trong 7.5.1 (100 ml), tính bằng mililit (ml);
V4 là thể tích của dịch lọc
(7.5.2) được lấy để pha loãng (7.6.3), tính bằng mililit (ml);
V5 là thể tích được lấy để
pha loãng dung dịch thử (7.6.3), tính bằng mililit (ml);
m là khối lượng phần mẫu thử (7.3), tính
bằng gam (g).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Nếu khối lượng phần mẫu thử
lớn hơn 1 g thì thể tích có thể được tính như sau:
V3
= 100-P
Trong đó P là thể tích phần kết tủa, tính
bằng mililit. Có thể tính giá trị P từ thành phần gần đúng của phần mẫu thử
theo công thức
P = 1,1 x (gam chất béo) + 0,73
x (gam protein) + 0,65 X (gam tinh bột) + 0,55 x (gam tro hòa tan)
8.2. Biểu
thị kết quả
Báo cáo kết quả đến ba chữ số có
nghĩa.
9. Độ chụm
9.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm
Các chi tiết về phép thử liên phòng thử
nghiệm về độ chụm của phương pháp được công bố trong [6].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: IDF 135 đưa ra các hướng dẫn
chi tiết về các phép thử liên phòng quốc tế đối với các phương pháp phân tích
và các sản phẩm sữa. Hướng dẫn này đưa vào TCVN 6910 (ISO 5725).
9.2. Độ lặp
lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả
thử độc lập, riêng rẽ thu được, khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một
loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác và sử
dụng cùng một thiết bị trong cùng một khoảng thời gian ngắn như nhau, không được
quá 5 % trường hợp vượt quá các giá trị sau:
- đối với sữa bột và hỗn hợp kem lạnh
dạng bột: 3 % trung bình của các kết quả;
- đối với phomat chế biến: 6 % trung bình
của các kết quả.
9.3. Độ tái
lập
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả
thử độc lập, riêng rẽ thu được, khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một
loại vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thao
tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 %
các trường hợp vượt quá các giá trị sau:
- đối với sữa bột và hỗn hợp kem lạnh
dạng bột: 6 % trung bình của các kết quả;
- đối với phomat chế biến: 14 % trung
bình của các kết quả.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận
biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu
biết;
c) viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định
trong tiêu chuẩn này, hoặc được cho là tuỳ chọn, cùng với các chi tiết bất thường
khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu
kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
PHỤ
LỤC A
(Quy định)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1. Giới thiệu
Các nguyên tắc về Thực hành phòng thử
nghiệm tốt (GLP) để tiến hành các phép phân tích enzym thông thường ít được biết
đến hơn so với các phép phân tích hóa học.
Đặc biệt chú ý đến các nguyên tắc để
thu được các kết quả chính xác và độ chụm thích hợp.
Do đó, trước khi phân tích cần đọc kỹ
các nguyên tắc về Thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP) để tiến hành các phép
phân tích enzym nêu dưới đây.
A.2. Thuốc thử
A.2.1. Chỉ sử dụng các
enzym thuộc loại quy định (hoạt tính cụ thể, nồng độ, chất nhiễm bẩn với hoạt tính
enzym, dung môi).
A.2.2. Chỉ sử dụng các
coenzym quy định (loại tinh khiết, dạng muối hoặc axit, chất nhiễm bẩn).
A.2.3. Tất cả các thuốc thử
không kể enzym và coenzym phải là loại tinh khiết phân tích.
A.2.4. Nước dùng để pha chế
các dung dịch enzym và các thuốc thử khác phải là nước được cất hai lần bằng dụng
cụ thủy tinh.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.6. Bảo quản các thuốc
thử, các dung dịch/huyền phù enzym theo chỉ dẫn (thường khoảng từ 2 °C đến 8
°C).
A.2.7. Không làm đông lạnh
các huyền phù enzym.
A.2.8. Khi đã quá hạn sử dụng
của các loại thuốc thử thì phải loại bỏ hoặc kiểm tra hiệu quả của thuốc thử bằng
cách kiểm tra các dung dịch chuẩn có các hàm lượng chất phân tích khác nhau.
Các độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với các nồng độ.
A.2.9. Các dung dịch đệm được
lấy ra từ tủ lạnh phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi bổ sung vào các
hỗn hợp phân tích.
A.3. Cuvet đo quang và cuvet đo phổ
A.3.1. Sử dụng các cuvet bằng
thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài đường quang là 1 cm.
CHÚ THÍCH: Các cuvet bằng chất dẻo có
các ưu điểm hơn so với cuvet thủy tinh như sau:
- rẻ (dùng một lần);
- có thể tiến hành nhiều phép phân
tích hơn;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.2. Mỗi khi đưa một mẻ
cuvet mới vào sử dụng, cần kiểm tra chiều dài đường quang của cuvet chính xác
(ví dụ: cuvet thạch anh) như sau:
Đổ đầy nước vào cuvet chính xác và các
cuvet bằng chất dẻo rồi đo độ hấp thụ (A1) của từng cuvet dựa vào
không khí. Sau khi tráng rửa, đổ đầy dung dịch NADH (khoảng 0,15 mg/ml) và đo lại
độ hấp thụ (A2) dựa vào không khí.
Đối với cả hai cuvet chính xác và
cuvet bằng chất dẻo, tính (A2 – A1). Chênh lệch (A2
– A1)giữa hai loại cuvet phải không đáng kể. Nếu chênh lệch (A2
– A1) vượt quá 0,5 % của giá trị hấp thụ thực đối với cuvet chính
xác thì tính độ chênh lệch trung bình theo phần trăm và cần tính đến giá trị
này đối với chiều dài đường quang, I, trong phần tính kết quả (xem 8.1).
A.3.3. Luôn sử dụng cuvet sạch
và không có vết xước. Làm khô hoặc lau sạch bên ngoài cuvet bằng khăn mềm.
A.3.4. Không đo độ hấp thụ
của cuvet mẫu thử dựa theo độ hấp thụ của cuvet thử trắng, vì sẽ không thu được
thông tin về cường độ hấp thụ của phép thử mẫu trắng. Đo độ hấp thụ của cả hai
mẫu thử và cuvet mẫu trắng dựa vào không khí và tính độ chênh lệch.
A.3.5. Không đo độ hấp thụ
của mẫu thử hoặc cuvet thử trắng dựa theo cuvet trống (vì khuếch tán ánh sáng).
A.3.6. Dùng que khuấy bằng
chất dẻo để trộn lượng chứa trong cuvet hoặc đậy kín cuvet bằng parafin rồi
xoay nhẹ cuvet.
A.3.7. Sử dụng que khuấy để
loại bọt khí ra khỏi thành cuvet. Tránh làm xước thành cuvet.
A.3.8. Luôn sử dụng cùng một
loại cuvet để đo mẫu thử và phép thử mẫu trắng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.4. Máy đo quang và máy đo phổ
A.4.1. Sử dụng máy đo phổ
(chiều rộng dải £ 10 nm), có
trang bị bộ lọc nhiễu (chiều rộng dải £ 10 nm) hoặc máy đo quang phổ, được trang bị
đèn hơi thủy ngân. Các phép đo sử dụng máy đo phổ hoặc máy đo quang có bộ lọc,
phải được thực hiện ở độ hấp thụ tối đa của NADH hoặc NADPH, nghĩa là ở bước
sóng 340 nm, còn các phép đo sử dụng máy đo quang có đèn hơi thủy ngân phải được
thực hiện ở 365 nm hoặc 334 nm.
CHÚ THÍCH: Các hệ số hấp thụ phần tử của
NADH và NADHP được đo ở bước sóng 334 nm, 340nm và 365 nm như sau:
- NADH và NADHP ở bước sóng 334 nm
(Hg): 6,18 x 106 cm2/mol;
- NADH và NADHP ở bước sóng 340 nm: 6,3
x 106 cm2/mol;
- NADPH ở bước sóng 365 nm (Hg): 3,5
x 106 cm2/mol;
- NADH ở bước sóng 365 nm (Hg): 3,4
x 106 cm2/mol;
A.4.2. Giữa độ hấp thụ và nồng
độ của NADH hoặc NADPH phải có mối quan hệ tuyến tính đến độ giá trị 2,0. Kiểm tra như
sau:
a) Dùng pipet lấy 2,00 ml nước cất cho
vào cuvet. Đo độ hấp thụ A0 so với không khí.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tính độ hấp thụ giảm, Ar1,
theo công thức sau:
Ar1 =(A1 – A0)
x 
Trong đó:
A1 là độ hấp thụ thu được
trong phép đo dung dịch NADH (b);
A0 là độ hấp thụ thu được
trong phép đo của nước (a);
c) Lặp lại quy trình trong b) ở trên
14 lần.
Sau mỗi cặp phép đo, tính sự giảm của
độ hấp thụ, Am, theo công thức sau:
Am = (An
– A0) x 
Trong đó:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
V là thể tích lượng chứa trong cuvet tại
phép đo thứ n.
d) Đối với mỗi phép đo, vẽ đồ thị của
thể tích dung dịch NADH có trong cuvet theo các độ hấp thụ giảm tương ứng. Đường
đi qua các điểm giao nhau phải là đường thẳng.
A.5. Pipet tự động và các bộ phân phối
khác
A.5.1. Sử dụng các pipet tự
động và các bộ phân phối khác theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
A.5.2. Sử dụng các đầu tip
thích hợp cho mỗi loại pipet.
A.5.3. Định kỳ kiểm tra các
quy định về thể tích và độ lặp lại của các pipet tự động và các bộ phân phối
khác (ví dụ như mỗi tháng một lần) như sau:
a) cân cốc thủy tinh có mỏ với nước ở
thời điểm t;
b) dùng pipet hoặc bộ phân phối đong
nước cho vào cốc có mỏ và cân chính xác ở thời điểm t + 1 min sau khi cân lần
thứ nhất;
c) lặp lại chín lần quy trình sử dụng
pipet hoặc bộ phân phối như trong b);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
e) tính thể tích và độ lặp lại của
pipet hoặc bộ phân phối, có tính đến hao hụt khối lượng do nước bị bay hơi.
A.5.4. Thể tích của một số
pipet tự động có thể bị ảnh hưởng bởi sự truyền nhiệt từ lòng bàn tay khi sử dụng
lâu.
Kiểm tra hiện tượng này bằng quy trình
trong A.5.3 và tránh sử dụng các pipet này.
A.5.5. Ngay trước khi sử dụng,
tráng đầu tip của pipet vài lần bằng dung dịch/huyền phù cần được
lấy. Đối với mỗi dung dịch mẫu, sử dụng một đầu tip mới.
A.5.6. Dùng pipet lấy nước,
dung dịch đệm, enzym, coenzym và dung dịch mẫu (nhúng đầu tip càng thấp càng tốt)
vào các góc khác nhau của cuvet.
CHÚ THÍCH: Có thể dùng pipet lấy các
lượng nhỏ (từ 10 ml đến 50 ml) dung dịch
enzym/huyền phù cho lên que khuấy, được đưa vào cuvet và dùng que khuấy để trộn
lượng chứa trong cuvet.
A.5.7. Tránh nhiễm bẩn.
A.6. Thông tin bổ
sung
A.6.1. Kiểm tra về các khả
năng gây nhiễu và về sai số tổng thể bằng cách xác định các độ hấp thụ của hai
dung dịch có các nồng độ khác nhau của chất phân tích. Các độ hấp thụ thu được
phải tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Các chuẩn đối chứng có độ
tinh khiết xác nhận có thể có được từ các Viện chuẩn quốc gia.
A.6.3. Tiến hành phép thử độ
thu hồi khi có mặt của dung dịch mẫu. Lượng chất phân tích được bổ sung phải gần
bằng lượng có mặt trong dung dịch mẫu.
A.6.4. Sử dụng một que khuấy
cho mỗi cuvet hoặc dùng que khuấy sử dụng một lần.
CHÚ THÍCH: Lượng chất lỏng còn lại
trên que khuấy phải được coi như không đáng kể.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM
KHẢO
[1 ] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản
phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu
[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ
chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1:
Nguyên tắc và định nghĩa chung
[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ
chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2:
Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu
chuẩn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[5] Comité de
Nomenclature de l’Union
Internationale de Biochimie, Recommandations en matière de Nomenclature des
Enzymes. Academic Press, New York, 1984
[6] Interlaboratory Collaborative Studies,
second series. Bulletin International Dairy Federation, 285, 1993, annex A,
annex B and annex C
1) Bộ
kit thử Boehringer là một ví dụ về sản phẩm có bán sẵn trên thị trường. Thông
tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, còn tiêu chuẩn này
không ấn định sử dụng chúng.
2) Ultra
Turrax là một ví dụ về sản phẩm có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa
ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, còn ISO không ấn định phải sử dụng
chúng.