Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9666:2013 về Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng tinh bột và glucose

• Số hiệu: TCVN9666:2013
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2013

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9666 : 2013

ISO 13965:1999

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT VÀ GLUCOSE - PHƯƠNG PHÁP ENZYM

Meat and meat products - Determination of starch and glucose content - Enzymatic method

Lời nói đầu

TCVN 9666:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 13965:1998;

TCVN 9666:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

...

...

...

Meat and meat products - Determination of starch and glucose content - Enzymatic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng tinh bột không chứa nước và hàm lượng glucose trong tất cả các loại thịt và sản phẩm thịt, kể cả thịt gia cầm.

Phương pháp này thích hợp cho việc xác định hàm lượng tinh bột và glucose đến 0,30% (khối lượng).

Phương pháp này không áp dụng cho tinh bột biến tính bằng phương pháp hóa học hoặc các dẫn xuất của chúng.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

...

...

...

3.1. Hàm lượng tinh bột của thịt và sản phẩm thịt (starch content of meat and meat products)

Hàm lượng tinh bột xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này và được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.

3.2. Hàm lượng glucose của thịt và sản phẩm thịt (glucose content of meat and meat products)

Hàm lượng glucose xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này và được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.

4. Nguyên tắc

4.1. Thủy phân tinh bột có trong phần mẫu thử bằng enzym a-amylase ở pH = 5,0 trong 15 min. Sử dụng các phản ứng enzym sau đây để xác định hàm lượng tinh bột.

4.2. Dùng amyloglucosidase (AGS) để thủy phân tinh bột đã được hòa tan, tạo thành glucose:

Tinh bột + (n-1)H₂O  glucose

Đối với phép xác định hàm lượng glucose thì bỏ qua bước này.

...

...

...

Glucose + ATP glucose 6-phosphat + ADP

4.4. Oxy hóa glucose 6-phosphat (G-6-P) bằng nicotinamide adenin dinucleotide phosphat (NADP) có mặt glucose 6-phosphat dehydrogenase (G-6-PDH), tạo thành gluconat 6-phosphat:

Glucose 6-phosphat + NADP^+ gluconat 6-phosphat + NADPH + H^+

4.5. Đo phổ của lượng khử nicotinamide dinucleotide phosphat (NADPH) ở bước sóng 340 nm.

5. Thuốc thử

Tất cả các thuốc thử được sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

5.1. Nước, phù hợp với loại 3 trong TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2. a-Amylase (EC 3.2.1.1), huyền phù enzym

Chế phẩm enzym dạng lỏng của a-amylase bền nhiệt được tạo ra từ Bacillus licheniformis (Termamyl^® 120L)1)

...

...

...

Hòa tan 200 g natri hydroxit trong nước. Làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến 1000 ml và trộn.

5.4. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,5 mol/l

Hòa tan 20 g natri hydroxit trong nước. Làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến 1000 ml và trộn.

5.5. Dung dịch amoni sulfat, c[(NH₄)₂SO₄] = 3,2 mol/l

Hòa tan 422 g amoni sulfat trong nước. Thêm nước đến 1000 ml và trộn.

5.6. Dung dịch đệm axetat, c(CH₃CO₂Na) = 0,1 mol/l, pH = 5,0

Hòa tan 6,80 g natri axetat ngậm ba phân tử nước (CH₃CO₂Na.3H₂O) trong 400 ml nước. Chỉnh pH đến 5,0 bằng axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit, kiểm tra bằng máy đo pH (6.2). Thêm nước đến 500 ml và trộn.

Khi được bảo quản nơi tối ở + 4^0C, dung dịch này có thể bền được 3 tháng.

5.7. Dung dịch đệm xitrat, c(xitrat) = 0,05 mol/l, pH = 4,6

...

...

...

Khi được bảo quản nơi tối ở + 4^0C, dung dịch này có thể bền được 3 tháng.

5.8. Dung dịch đệm triethanolamin, c(triethanolamin) = 0,75 mol/l, pH = 7,6

Hòa 14,0g triethanolamin hydrochloride (C₆H_15­NO_­3­.HCl) và 0,25 g magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄.7H₂O) trong 80 ml nước. Chỉnh pH về 7,6 bằng dung dịch natri hydroxit (5.3 và 5.4), kiểm tra bằng máy đo pH. Thêm nước đến 100 ml và trộn.

Khi được bảo quản nơi tối ở + 4^0C, dung dịch này có thể bền được 4 tuần.

5.9. Dung dịch nicotinamide adenin dinucleotide phosphat, c(b-NADP-Na­_2­) = 12,7 x 10^-3 mo/l.

Hòa tan 100 mg muối dinatri NADP trong 10,0 ml nước và trộn.

Khi được bảo quản nơi tối ở + 4^0C, dung dịch này có thể bền được 4 tuần.

5.10. Dung dịch adenosin-5'-triphosphat, c(5'-ATP-Na­₂H₂.3H₂O) » 81 x 10^-3 mol/l.

Hòa tan 500 mg 5'-ATP-Na_2­­H­₂.3H_­2O và 500 mg natri hydro carbonat (NaHCO­₃) khan trong 10,0 ml nước và trộn.

...

...

...

5.11. Amyloglucosidase (AGS; EC 3.2.1.3), huyền phù enzym trong dung dịch amoni sulfat (5.5), r(AGS) = 10 mg/ml.

Hoạt độ riêng của enzym phải bằng 14 đơn vị trên miligam.

Khi được bảo quản nơi tối ở + 4^0C, huyền phù này có thể bền được 1 năm.

5.12. Hexokinase (HK; EC 2.7.1.1)/glucose 6-phosphat dehydrogenase (G-6-PDH; EC 1.1.1.49), huyền phù enzym trong dung dịch amoni sulfat (5.5), r(HK) = 2 mg/ml và r(G-6-PDH) = 1 mg/ml.

Hoạt độ riêng của cả hai enzym phải bằng 140 đơn vị trên miligam.

Khi được bảo quản nơi tối ở + 4^0C, huyền phù này có thể bền được 1 năm.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Thiết bị đồng hóa bằng cơ hoặc bằng điện, có khả năng đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm.

...

...

...

6.2. Máy đo pH

6.3. Giấy lọc gấp nếp, không chứa glucose, đường kính khoảng 15 cm.

6.4. Pipet, đã hiệu chuẩn dùng cho phân tích enzym hoặc micropipet tự động có chất lượng tương tự, có các dung tích 20 ml, 50 ml, 100 ml và 200 ml.

6.5. Dao trộn nhỏ bằng chất dẻo, để trộn lượng chứa trong cuvet (6.9).

6.6. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ 60^0C ± 2 ^0C.

6.7. Bếp điện

6.8. Máy đo phổ, có khả năng đo được ở bước sóng 340 nm.

CHÚ THÍCH: Khi sử dụng máy đo phổ có đèn hơi thủy ngân thì có thể tiến hành đo ở bước sóng 365 nm và 334 nm. Hệ số hấp thụ phân tử k đối với NADPH là 3,51 l.mmol^-1 . cm^-1 ở 365 nm và 6,18 l.mmol^-1 . cm^-1 ở 334 nm.

6.9. Cuvet, bằng thạch anh hoặc thủy tinh, có nắp đậy hoặc cuvet sử dụng một lần làm bằng polymethacrylat, có chiều dài đường quang 10 mm.

...

...

...

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4833-1 (ISO 3100-1)^[1]*).

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Phần mẫu đại diện ít nhất là 200 g. Bảo quản mẫu theo cách sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và thay đổi thành phần.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm bằng thiết bị thích hợp (6.1). Chú ý không để nhiệt độ của mẫu tăng quá 25^0C. Nếu sử dụng máy nghiền thì nghiền mẫu ít nhất hai lần.

Đổ đầy mẫu đã chuẩn bị vào hộp chứa kín khí thích hợp. Đậy nắp hộp và bảo quản sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và thay đổi thành phần. Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, nhưng trong vòng 24 h sau khi mẫu đã được đồng hóa.

9. Cách tiến hành

CHÚ THÍCH: Glycogen cơ thịt thường có trong các sản phẩm như xúc xích không gây nhiễu đến phép xác định. Maltose gây nhiễu cho phép xác định vì disaccharid này bị thủy phân bởi amyloglucosidase thành glucose. Tuy nhiên, có thể tách maltose (và glucose) ra khỏi mẫu bằng cồn.

...

...

...

Nếu mẫu thử có chứa maltose thì đảm bảo rằng hàm lượng nước không vượt quá 20% (khối lượng). Làm khô mẫu, nếu cần.

Cân khoảng 400 mg mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 8), chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm rồi tiến hành theo 9.2.

Nếu mẫu thử không chứa maltose thì cân khoảng 100 mg đến 1,0 g(m) phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,1 mg cho vào bình nón 100 ml.

Thêm 30 ml dung dịch đệm axetat (5.6) và tiến hành theo 9.3.

9.2. Chiết maltose (và glucose)

Rửa mẫu thử ba lần, mỗi lần dùng 10 ml etanol 40% thể tích và cho ly tâm sau mỗi lần rửa. Lọc phần nổi phía trên. Gộp phần kết tủa trong ống ly tâm với phần còn lại trên bộ lọc rồi chuyển vào bình nón 100 ml, sử dụng bốn phần, mỗi phần 5 ml dung dịch đệm axetat (5.6). Thêm 10 ml dung dịch đệm axetat (5.6).

9.3. Chuẩn bị dịch chiết

Dùng pipet (6.4) lấy 50 ml huyền phù a-amylase (5.2) cho vào bình nón chứa mẫu. Đậy bình nón bằng giấy nhôm và đem đun sôi trên bếp điện (6.7) trong 15 min. Thỉnh thoảng lắc bình.

Giữ bình nón trong nồi cách thủy (6.6) ở 60^0C trong 15 min. Chuyển định lượng phần chứa trong bình nón sang bình định mức 100 ml. Tráng bình nón bằng nước ấm rồi cho nước rửa sang bình định mức. Để nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm nước đến vạch. Lọc ít nhất 10 ml dịch chiết mẫu qua bộ lọc (6.3), loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên và tiến hành ngay theo 9.4.

...

...

...

9.4. Phép xác định

9.4.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng thuốc thử như sau: dùng pipet (6.4) lấy 200 ml dung dịch đệm xitrat (5.7) và 100 ml nước cho vào cuvet (6.9) có dao trộn (6.5).

9.4.2. Chuẩn bị dung dịch thử để xác định glucose như sau: dùng pipet (6.4) lấy 200 ml dung dịch đệm xitrat (5.7) và 100 ml (V_2­) dịch chiết mẫu (9.3) cho sang cuvet (6.9) có dao trộn (6.5).

9.4.3. Chuẩn bị dung dịch thử để xác định tinh bột như sau: dùng pipet (6.4) lấy 200 ml dung dịch đệm xitrat (5.7) và 100 ml (V₂) dịch chiết mẫu (9.3) cho sang cuvet (6.9) có dao trộn (6.5).

Nếu nồng độ của tinh bột có trong dung dịch mẫu lớn hơn 0,4 g/l thì pha loãng dịch chiết trước khi phân tích.

9.4.4. Dùng pipet (6.4) lấy 20 ml huyền phù AGS (5.11) cho vào cuvet có chứa dung dịch mẫu trắng thuốc thử (9.4.1) và cho vào cuvet chứa dung dịch thử để xác định tinh bột (9.4.3). Dùng pipet lấy 20 ml nước cho vào cuvet chứa dung dịch thử để xác định glucose (9.4.2).

Trộn các lượng chứa trong cuvet bằng cách xoay cuvet hoặc đưa dao trộn lên xuống.

Đậy các cuvet bằng nắp đậy hoặc bằng cách thích hợp khác (ví dụ: dùng tấm parafin). Để các cuvet trong nồi cách thủy (6.6) trong 15 min ở 60^0C ± 2^0C.

Quy trình trên được thể hiện như sau:

...

...

...

Dung dịch mẫu trắng thuốc thử

Dung dịch thử để xác định glucose

Dung dịch thử để xác định tinh bột

Dung dịch đệm xitrat (5.7)

200 ml

200 ml

200 ml

Dịch chiết mẫu (9.3)

-

...

...

...

100 ml

Nước (5.1)

100 ml

20 ml

-

Huyền phù AGS (5.11)

20 ml

-

20 ml

...

...

...

9.4.5. Làm nguội các cuvet đến 22,5^0C ± 2,5^0C và làm sạch bên ngoài cuvet. Dùng pipet (6.4) cho liên tiếp vào tất cả các cuvet 1,00 ml dung dịch đệm triethanolamin (5.8), 100 ml dung dịch NADP (5.9), 100 ml dung dịch ATP (5.10) và 1,50 ml nước. Trộn cẩn thận bằng cách xoay cuvet hoặc dùng dao trộn (6.5).

Đọc độ hấp thụ A₁ của từng cuvet bằng máy đo phổ (6.8) ở bước sóng 340 nm so với nước sau 3 min.

9.4.6. Dùng pipet (6.4) cho vào mỗi cuvet 20 ml huyền phù HK/G-6-PDH (5.12). Trộn lượng chứa trong cuvet bằng cách đưa dao trộn lên-xuống. Thể tích cuối cùng trong cuvet là 3,04 ml (V₁).

Đọc độ hấp thụ A₂ của từng cuvet ở bước sóng 340 nm so với nước sau 15 min.

CHÚ THÍCH: Phản ứng thường kết thúc trong vòng 5 min đến 10 min. Nếu phản ứng không dừng lại trong khoảng thời gian này thì đọc độ hấp thụ sau mỗi 2 min cho đến khi độ hấp thụ tăng ổn định. Ngoại suy độ hấp thụ theo thời điểm bổ sung enzym HK/G-6-PDH (ví dụ, xem Hình A.1).

10. Tính kết quả

10.1. Hàm lượng tinh bột không chứa nước

10.1.1. Chênh lệch độ hấp thụ

Tính chênh lệch độ hấp thụ bằng công thức sau đây:

...

...

...

Trong đó:

DA_s là chênh lệch độ hấp thụ bởi hàm lượng tinh bột;

A_1b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng thuốc thử đo được trong 9.4.5;

A_1g là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định glucose đo được trong 9.4.5;

A_1s là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định tinh bột đo được trong 9.4.5;

A_2b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng thuốc thử đo được trong 9.4.6;

A_2g là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định glucose đo được trong 9.4.6;

A_2s là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định tinh bột đo được trong 9.4.6;

10.1.2. Tính hàm lượng tinh bột không chứa nước

...

...

...

w_s =

Trong đó:

w_s là hàm lượng tinh bột không chứa nước của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng;

DA_s là chênh lệch độ hấp thụ tính được trong 10.1.1;

M_rgs là khối lượng phân tử tương đối của glucose trong tinh bột (M_rgs = M_rglucose - M_rwater) = 162,1);

V₁ là thể tích cuối cùng trong cuvet, tính bằng mililit (V₁ = 3,04 ml);

f là hệ số pha loãng;

d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

k là hệ số hấp thụ phân tử của NADPH, tính bằng lít trên milimol centimet (k = 6,30 l.mmol^-1.cm^-1 khi đo ở bước sóng 340 nm);

...

...

...

V₂ là thể tích của dịch chiết mẫu được bổ sung trong 9.4.3, tính bằng mililit (ml).

Làm tròn kết quả đến hai chữ số thập phân.

10.2. Hàm lượng glucose

10.2.1. Chênh lệch độ hấp thụ

Tính chênh lệch độ hấp thụ bằng công thức sau đây:

DA_g = (A_2g - A_1g) - (A_2b - A_1b)

Trong đó:

DA_g là chênh lệch độ hấp thụ đối với hàm lượng glucose;

A_1b là độ hấp thụ của dung dịch trắng thuốc thử đo được trong 9.4.5;

...

...

...

A_2b là độ hấp thụ của dung dịch trắng thuốc thử đo được trong 9.4.6;

A_2g là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định glucose đo được trong 9.4.6.

10.2.2. Tính hàm lượng glucose

Tính hàm lượng glucose theo công thức sau:

w_g =

trong đó:

w_g là hàm lượng glucose của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng;

DA_g là chênh lệch độ hấp thụ tính được trong 10.2.1;

M_rg là khối lượng phân tử của glucose (M_rg = 180,2);

...

...

...

f là hệ số pha loãng;

d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

k là hệ số hấp thụ phân tử của NADPH, tính bằng lít trên milimol centimet (k = 6,30 l.mmol^-1.cm^-1 khi đo ở bước sóng 340 nm);

m là khối lượng phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam (g);

V₂ là thể tích của dịch chiết mẫu được bổ sung trong 9.4.3, tính bằng mililit (ml).

Làm tròn kết quả đến hai chữ số thập phân.

11. Độ chụm

11.1. Độ lặp lại

11.1.1. Hàm lượng tinh bột không chứa nước

...

...

...

r_s = 0,102 + 0,132 x

trong đó:

r_s là giới hạn độ lặp lại, tính bằng phần trăm khối lượng đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước;

là trung bình của hai kết quả đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước.

11.1.2. Hàm lượng glucose

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng một nguyên liệu thử chứa từ 0,3% đến 1,2% khối lượng glucose, thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn độ lặp lại r_g tính được bằng công thức sau:

r_g = 0,197 + 0,070 x

trong đó:

r_g là giới hạn độ lặp lại, tính bằng phần trăm khối lượng đối với hàm lượng glucose;

...

...

...

11.2. Độ tái lập

11.2.1. Hàm lượng tinh bột không chứa nước

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử chứa hàm lượng tinh bột từ 0,3% đến 5,0% khối lượng, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn độ tái lập tính được bằng công thức sau:

R_s = 0,229 + 0,232

Trong đó:

R_s là giới hạn độ tái lập, tính bằng phần trăm khối lượng đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước;

là trung bình của hai kết quả đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước.

11.2.2. Hàm lượng glucose

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử chứa hàm lượng glucose từ 0,3% đến 1,2% khối lượng, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn độ tái lập tính được bằng công thức sau:

...

...

...

Trong đó:

R_g là giới hạn độ tái lập, tính bằng phần trăm khối lượng đối với hàm lượng glucose;

là trung bình của hai kết quả đối với hàm lượng glucose.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

...

...

...

- nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Ví dụ về đồ thị và ngoại suy giá trị độ hấp thụ

Hình A.1 - Ví dụ về đồ thị và ngoại suy giá trị độ hấp thụ

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] Method No. 145 (1993). Starch and Glucose: Enzymatic Determination in Foods. Nordic Committee on Food Analysis (NMKL), Esbo, Finland (in English and Scandinavian) (UDC 577.1 - 5.08:641.13).

[5] Method No. 07.00-25(1983). Determination of Starch in Meat Products. Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Paragraph 35 LMBG (in German).