Gradient
|
0 min: Cân bằng 100 % dung môi A
ở 1 ml/min. Dung môi A cân bằng chậm. Trong ngày phân tích cân bằng cột sắc
kí đã được bảo quản trong dung dịch acetonitrile 50 % trong khoảng 1 h trước
khi bắt đầu chạy mẫu. Tiến hành chạy mẫu lần đầu sử dụng dung dịch đệm trắng
để loại bỏ pic lạ tạo thành từ việc chạy các dung dịch đệm kéo dài qua cột
sắc kí lỏng. Sự cân bằng cột sắc kí lỏng giữa các lần chạy thực hiện trong
vài phút.
|
Từ 0 min đến 1 min: 100 % dung
môi A ở 1 ml/min.
|
Từ 1 min đến 6 min: dung môi
A-acetonitrile-methanol (70 + 22 + 8).
|
Từ 6 min đến 17 min: Dung môi
A-acetonitrile-methanol (70 + 22 + 8) ở 1 ml/min. Có thể kéo dài thời gian
nếu cần rửa giải tất cả các tetracycline.
|
Từ 17 min đến 19 min: 100 % dung
môi A với độ tuyến tính từ 1 ml/min đến 1,5 ml/min.
|
Từ 19 min đến 20 min: 100 % dung
môi A với độ dốc tuyến tính giảm từ 1,5 ml/min đến 1 ml/min.
|
Từ 20 min đến 24 min: 100 % dung
môi A ở 1 ml/min.
|
Hệ
thống bơm hai kênh
Nếu dung môi B chứa
axetonitril-metanol (22 + 8, thể tích) thì bắt đầu ở 100 % dung môi A và tăng
dần dung môi A lên 70 % và dung môi B 30 % trong 5 min và duy trì trong 11
min.
Nếu dung môi B chứa axit
oxalic-axetonitrile-metanol (70 + 22 + 8, thể tích) 10 mM thì bắt đầu ở 100 %
dung môi A và tăng dần dung môi B lên 100 % trong 5 min và duy trì trong 11
min.
Cân bằng lại cột sắc kí lỏng trong
khoảng ³ 4 min ( để ổn định thời gian
lưu) ở điều kiện ban đầu trước khi bơm dung dịch thử tiếp theo.
Các hệ thống không có bộ bơm heli
tự động thì có thể gặp phải vấn đề về khử khí, điển hình là sự xuất hiện pic
lớn, rộng quanh thời gian rửa giải oxytetracycline. Nếu khó khử khí trong quá
trình sắc kí gradient, thì bổ sung các lượng nhỏ axetonitril (từ 2 % đến 5 %)
vào dung môi A và tăng thời gian cân bằng giữa các lần chạy mẫu. Điều này có
thể cần phải chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tetracycline (3.4.2) dùng nước
thay cho metanol.
Tetracycline không bền trong dung
dịch nước, do đó phải chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tetracycline (3.4.2)
trong ngày phân tích.
Bảo quản cột sắc kí lỏng trong dung
dịch axetonitril-nước (1 + 1). Trước và sau bảo quản, thổi rửa cột sắc kí và hệ
thống sắc kí bằng nước dùng cho sắc kí (khoảng 10 min đến 15 min ở tốc độ dòng
1 ml/min) để ngăn ngừa sự kết tủa của axit oxalic do nồng độ dung môi hữu cơ
cao.
6.6.2 Bơm dung dịch thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong mỗi ngày thử nghiệm cho chạy
từ 1 đến 2 gradient thử trắng trước khi bơm dung dịch chuẩn sắc kí tetracycline
(3.4.1) hoặc dung dịch thử để đảm bảo không có chất gây nhiễu nền cạnh thời
gian lưu của tetracycline.
6.6.3 Nhận biết pic
Tetracycline rửa giải theo thứ tự
sau: minocycline, oxytetracycline, tetracycline, demeclocycline, chlortetracycline,
methacycline và doxycycline.
CHÚ THÍCH Thời gian lưu có xu hướng
thay đổi nhẹ theo thời gian sử dụng cột và số lần bơm.
Xác định rõ việc nhận biết pic, vì
các tetracycline rửa giải gần như cùng nhau. Tất cả các pic dư lượng yêu cầu
cần có thời gian lưu trong khoảng 0,05 min của các thời gian lưu quan sát được
từ các chuẩn nằm trong khung.
Một số chất chuyển hóa có thể làm
nhiễu phép phân tích các hợp chất gốc khác. Thuốc tetracycline uống cho bò có
thể làm xuất hiện cả pic của tetracycline và các pic trước (ví dụ: epitetracycline)
mà rửa giải rất gần oxytetracycline.
Đôi khi, có thể xuất hiện pic nội
sinh giữa oxytetracycline và tetracycline. Điều này có thể do nồng độ của
riboflavin trong sữa cao, thời gian lưu xuất hiện sớm hơn khoảng 0,1 min so với
thời gian lưu của tetracycline. Để giảm độ nhiễu của riboflavin, thì trong quy
trình chiết dùng thể tích dung dịch đệm natri sucxinat (3.6) lớn gấp đôi để rửa
cột mini (việc này chỉ hơi giảm độ thu hồi của oxytetracycline hoặc
tetracycline).
6.6.4 Ổn định dịch chiết
Các tetracycline không bền ở nhiệt
độ phòng trong các môi trường axit [nghĩa là trong dung dịch đệm
Mcllvaine-EDTA-NaCl (3.3)]. Tetracycline và chlortetracycline suy giảm chất
lượng ³ 50 % trong vòng 24 h. Các sản
phẩm phân hủy có xu hướng rửa giải sớm hơn so với hợp chất gốc và thường dịch
chuyển về oxytetracycline. Để tránh điều này, nên tiến hành tất cả các bước li
tâm ở 10 oC. Làm lạnh dịch chiết hoặc phân tích trong vòng 4 h. Dung
dịch rửa giải cột mini có thể được làm lạnh không quá 2 ngày hoặc đông lạnh
không quá 1 tuần chỉ hơi làm thay đổi nồng độ tetracycline.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chuẩn bị đường chuẩn đối với từng
loại tetracycline từ sắc đồ chuẩn.
Tính nồng độ tetracycline sử dụng
đường hồi quy tuyến tính sau:
y
= ax + b
Trong đó:
y là nồng độ tetracycline
của dịch chiết được bơm, tính bằng ng/ml;
x là diện tích pic hoặc
chiều cao pic của tetracycline.
Đường chuẩn của mỗi loại
tetracycline phải tuyến tính.
Tính nồng độ tetracycline trong sữa
nguyên chất bằng cách chia nồng độ xác định được đối với dung dịch thử được bơm
cho 2 (hệ số pha loãng được dùng cho cột mini, để giảm thể tích của phần mẫu
thử từ 5 ml xuống 2,5 ml).
Đường nền xác định được bằng hệ
thống phân tích dữ liệu tự động cần được kiểm tra đối với từng sắc đồ (xem Phụ
lục B về xây dựng đường nền thích hợp).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận
biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng,
nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và
viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không quy định
trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn và các chi tiết bất thường khác có ảnh
hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
Phụ lục A
(Tham
khảo)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng A.1 và Bảng A.2 đưa ra các kết
quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về chấp nhận phương pháp.
Bảng
A.1 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về phép xác định nhóm dư
lượng tetracycline trong sữa có bổ sung chuẩn, bằng sắc kí lỏng ái lực dùng
chelat kim loạia
Chất
kháng sinh
Độ
thu hồi trung bình
Độ
lệch chuẩn lặp lại
Độ
lệch chuẩn tương đối lặp lại
Giới
hạn lặp lại
Độ
lệch chuẩn tái lập
Độ
lệch chuẩn tương đối tái lập
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
%
sr
RSDr,
%
r
sR
RSDR,
%
R
Sữa
bò có bổ sung ở nồng độ khoảng 15 ng/ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
69,0
11,4
17
32
16,8
24
47
Oxytetracycline
75,2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
12
26
14,4
19
40
Tetracycline
73,6
9,30
13
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
16,2
22
45
Demeclocycline
71,0
11,6
16
32
11,6
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
32
Chlortetracycline
61,7
15,6
25
44
15,6
25
44
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
58,9
10,3
18
29
10,6
18
30
Doxycycline
64,9
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
22
41
14,5
22
41
Sữa
bò có bổ sung ở nồng độ khoảng 30 ng/ml
Minocycline
69,2
12,4
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
35
16,2
24
45
Oxytetracycline
77,5
6,32
8,2
18
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
16
34
Tetracycline
74,8
6,48
8,7
18
15,1
20
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Demeclocycline
72,3
8,16
11
23
9,13
13
26
Chlortetracycline
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4,72
7,4
13
8,45
13
24
Methacycline
60,3
6,36
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
18
8,53
14
24
Doxycycline
65,2
7,34
11
21
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
13
24
Sữa
bò có bổ sung ở nồng độ khoảng 60 ng/ml
Minocycline
72,0
4,11
5,7
12
6,97
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
20
Oxytetracycline
78,2
6,75
8,6
19
9,98
13
28
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
74,1
6,38
8,6
18
9,68
13
27
Demeclocycline
69,1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9,0
17
7,79
11
22
Chlortetracycline
63,5
6,25
9,8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
11,0
17
31
Methacycline
58,6
5,84
10
16
9,48
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
26
Doxycycline
64,8
6,76
10
19
9,25
14
26
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
b Dựa trên dữ liệu từ
7 phòng thử nghiệm.
Bảng
A.2 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về phép xác định nhóm dư
lượng tetracycline trong sữa có bổ sung bằng sắc kí lỏng ái lực dùng chelat kim
loại.
Chất
kháng sinh
Trung
bình
Độ
lệch chuẩn lặp lại
Độ
lệch chuẩn tương đối lặp lại
Giới
hạn lặp lại
Độ
lệch chuẩn tái lập
Độ
lệch chuẩn tương đối tái lập
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
ng/ml
sr
RSDr,
%
r
sR
RSDR,
%
R
Minocycline
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2,74
24
7,7
9,25
80
26
Oxytetracycline
18,6
2,50
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7,0
3,97
21
11
Oxytetracycline
18,8
3,03
16
8,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
34
18
Oxytetracycline
30,0
4,47
15
13
10,3
34
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Oxytetracycline (40)b
31,4
2,55
8.1
7,1
3,79
12
11
Tetracycline
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3,73
16
10
8,62
37
24
Tetracycline
45,3
3,44
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9,6
13,3
29
37
Tetracycline (80)
54,1
3,94
7,3
11
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
16
24
Demeclocycline
37,0
4,39
12
12
5,93
16
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chlortetracycline (25)
14,5
1,87
13
5,2
2,94
20
8,2
Chlortetracycline
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4,06
12
11
6,28
18
18
Chlortetracycline
37,4
3,98
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
11
6,02
16
17
Methacyclinec
38,2
5,51
14
15
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
18
20
Doxycycline
30,1
3,60
12
10
6,25
21
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a Mẫu mù lặp lại hai
lần được các phòng thử nghiệm tham gia chuẩn bị; dựa trên dữ liệu do 8 phòng
thử nghiệm cung cấp.
b Số thành trong dấu
ngoặc đơn là nồng độ sữa danh định đối với dư lượng tetracycline có bổ sung,
tính bằng ng/ml.
c Dựa trên dữ liệu từ
7 phòng thử nghiệm.
Phụ lục B
(Tham
khảo)
Ví dụ về sắc đồ
Hình
B.1 - Ví dụ về sắc đồ của mẫu thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A Dịch chiết của sữa có bổ sung
chất kiểm soát với nồng độ 30 ng của từng tetracycline/ml:
1) minocycline,
5) chlortetracycline,
2) oxytetracycline,
6) methacycline
3) tetracycline,
7) doxycycline.
4) demeclocycline
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C Dịch chiết của sữa kiểm soát.
THƯ
MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Simultaneous Determination
of Multiple Tetracycline Residues in Milk Using Metal Chelate Affinity
Chromatography, J. AOAC International Vol. 76, No. 2, 1993, p.329
[2] Simultaneous Determination
of Multiple Tetracycline Residues in Milk by Metal Chelate Affinity
Chromatography: Collaborative Study, J. AOAC International Vol. 79,
No. 1, 1996, p. 29-42