|
Phép thử đối
với mẫu hoặc chất chuẩn
|
Phép thử mẫu trắng
|
lactoza và
galactoza
|
galactoza
|
lactoza và
galactoza
|
galactoza
|
Dùng pipet lấy cho vào cuvet đo phổ
|
Dung dịch đệm NAD*/xitrat (4.6)
|
0,20 ml
|
0,20 ml
|
0,20 ml
|
0,20 ml
|
Huyền phù b-galactosidaza
(4.7)
|
0,05 ml
|
-
|
0,05 ml
|
-
|
Nước
|
-
|
0,05 ml
|
-
|
0,05 ml
|
Dịch lọc của mẫu hoặc chất chuẩn
(7.5.2)
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
-
|
-
|
Dịch lọc của mẫu trắng (7.5.2)
|
-
|
-
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
Trộn lượng chứa trong cuvet đo phổ,
dùng que khuấy bằng chất dẻo (5.9) rồi ủ 5 min ở nhiệt độ trên 20 oC
trong nồi cách thủy (5.11), nếu cần
|
Dung dịch đệm phosphat (4.5)
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
Nước
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
1,00 ml
|
Trộn lượng chứa trong cuvet đo phổ;
2 min sau khi trộn, đo độ hấp thụ A0 của dung dịch trong từng
cuvet dựa vào không khí khi đo ở mức bước sóng 340 nm
Sau đó dùng pipet (5.4) thêm vào
cuvet đo phổ như sau:
|
Huyền phù b-Galactosidaza
dehydrogenaza (4.8)
|
0,05 ml
|
0,05 ml
|
0,05 ml
|
0,05 ml
|
Trộn lượng chứa trong cuvet đo phổ,
rồi ủ 15 min ở nhiệt độ trên 20 °C trong nồi cách thủy (5.11), nếu cần. Đo độ
hấp thụ A15 của dung dịch trong từng cuvet so với không khí.
Sau 5 min, đo lại độ hấp thụ của từng
dung dịch. Nếu phản ứng chưa kết thúc thì tiếp tục đọc độ hấp thụ của từng
dung dịch sau các khoảng thời gian 5 min, cho đến khi độ hấp thụ ổn định sau
các khoảng 5 min liên tiếp.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
7.6.2. Tính các độ hấp thụ
7.6.2.1. Nếu sau 15 min ủ mà độ
hấp thụ không tăng thì tính độ hấp thụ A của lượng chứa trong từng cuvet để sử
dụng trong phép tính (xem 8.1), dùng công thức sau:
A = At
- A0 (1)
Trong đó:
A0 là độ hấp thụ đo được
trước khi thêm huyền phù b-galactosidaza dehydrogenaza;
A1 là độ hấp thụ đo được
sau khi ủ trong khoảng thời gian 15 min.
7.6.2.2. Nếu sau 15 min mà phản
ứng vẫn chưa dừng thì tính độ hấp thụ A của lượng chứa trong từng cuvet để sử dụng
trong phép tính (xem 8.1), dùng công thức sau:
A = (At –
A0) - (At - At-5) (2)
Trong đó:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
At là độ hấp thụ đo được
sau khi ủ trong khoảng thời gian t min;
A(t-5) là độ hấp thụ đo được
sau khi ủ trong khoảng thời gian (t-5) min.
7.6.3. Kiểm tra xác nhận
Nếu độ hấp thụ A vượt quá 0,500 thì lặp
lại quy trình quy định trong 7.6.1 và 7.6.2, sử dụng dung dịch pha loãng thích
hợp của dịch lọc (7.5.2).
8. Tính và biểu thị kết
quả
8.1. Tính
Hàm lượng lactoza, wL tính
được theo công thức sau:
wL =
Trong đó:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A1 là độ hấp thụ (tính được
trong 7.6.2) của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về lactoza và galactoza;
A2 là độ hấp thụ (tính được
trong 7.6.2) của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về galactoza;
A3 là độ hấp thụ (tính được
trong 7.6.2) của phép thử mẫu trắng về lactoza và galactoza;
A4 là độ hấp thụ (tính được
trong 7.6.2) của phép thử mẫu trắng về galactoza;
Mr là khối lượng phân tử của
lactoza, đối với lactoza dạng khan thì Mr = 342,30 và lactoza ngậm một
phân tử nước thì Mr = 360,31;
K là hệ số hấp thụ phân tử của NADPH ở
bước sóng 340 nm (K = 6,3 x 10 6 cm2/mol);
l là chiều dài đường quang lý thuyết của
cuvet đo phổ, tính bằng centimet (1 cm);
V1 là tổng thể tích của chất
lỏng trong cuvet đo phổ (7.6.1), tính bằng mililit (3,30 ml);
V2 là thể tích dịch lọc
(7.5.2) hoặc dung dịch pha loãng của dịch lọc (7.6.3) được cho vào cuvet đo phổ
(1,00 ml), tính bằng mililit (ml);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
V4 là thể tích của dịch lọc
(7.5.2) được lấy để pha loãng (7.6.3), tính bằng mililit (ml);
V5 là thể tích dung dịch thử
được lấy để pha loãng (7.6.3), tính bằng mililit (ml);
m là khối lượng phần mẫu thử (7.3),
tính bằng gam (g).
Nếu giá trị (A2 - A4)
là giá trị âm thì mới được tính đến.
CHÚ THÍCH: Nếu khối lượng phần mẫu thử
lớn hơn 1 g thì thể tích có thể được tính như sau:
V3 =
100 - P
Trong đó P là thể tích phần kết
tủa, tính bằng mililit. Có thể tính giá trị P từ thành phần gần đúng của
phần mẫu thử theo công thức:
P = 1,1 x (gam chất béo) + 0,73 x (gam
protein) + 0,65 x (gam tinh bột) +
0,55 x (gam tro hòa
tan).
8.2. Biểu thị kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9. Độ chụm
9.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm
Các chi tiết về phép thử liên phòng thử
nghiệm về độ chụm của phương pháp được công bố trong 6.
Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập
thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này được xác định phù hợp với TCVN
6910-2 (ISO 5725-2). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này
có thể không áp dụng được cho dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ
và chất nền đã nêu.
CHÚ THÍCH: IDF 135 đưa ra các hướng dẫn
chi tiết về các phép thử liên phòng quốc tế đối với các phương pháp phân tích và
các sản phẩm sữa. Hướng dẫn này được dựa vào TCVN 6910 (ISO 5725).
9.2. Độ lặp lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả
thử độc lập, riêng rẽ thu được, khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một
loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác và sử
dụng cùng một thiết bị trong cùng một khoảng thời gian ngắn như nhau, không được
quá 5 % trường hợp vượt quá các giá trị sau:
- đối với sữa bột và hỗn hợp kem lạnh
dạng bột: 3 % trung bình của các kết quả;
- đối với phomat chế biến: 6 % trung bình
của các kết quả.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử
độc lập, riêng rẽ thu được, khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại
vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thao tác
khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các
trường hợp vượt quá các giá trị sau:
- đối với sữa bột và hỗn hợp kem lạnh
dạng bột: 6 % trung bình của các kết quả;
- đối với phomat chế biến: 14 % trung
bình của các kết quả.
10. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận
biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu
biết;
c) viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định
trong tiêu chuẩn này, hoặc được cho là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường
khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục A
(Quy định)
Các nguyên tắc về Thực hành phòng thử nghiệm
tốt (GLP) để tiến hành các phép phân tích enzym
A.1. Giới thiệu
Các nguyên tắc về Thực hành phòng thử
nghiệm tốt (GLP) để tiến hành các phép phân tích enzym thông thường ít được biết
đến hơn so với các phép phân tích hóa học.
Đặc biệt chú ý đến các nguyên tắc để thu
được các kết quả chính xác và độ chụm thích hợp.
Do đó, trước khi phân tích cần đọc kỹ
các nguyên tắc về Thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP) để tiến hành các phép
phân tích enzym nêu dưới đây.
A.2. Thuốc thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.2. Chỉ sử dụng các
coenzym quy định (loại tinh khiết, dạng muối hoặc axit, chất nhiễm bẩn).
A.2.3. Tất cả các thuốc thử
không kết enzym và coenzym phải là loại tinh khiết phân tích.
A.2.4. Nước dùng để pha chế
các dung dịch enzym và các thuốc thử khác phải là nước được cất hai lần bằng dụng
cụ thủy tinh.
A.2.5. Nước dùng để pha chế
các dung dịch mẫu phải là nước được cất bằng dụng cụ thủy tinh hoặc đã loại
ion.
A.2.6. Bảo quản các thuốc
thử, các dung dịch/huyền phù enzym theo chỉ dẫn (thường khoảng từ 2 °C đến 8 °C).
A.2.7. Không làm đông lạnh
các huyền phù enzym.
A.2.8. Khi đã quá hạn sử dụng
của các loại thuốc thử thì phải loại bỏ hoặc kiểm tra hiệu quả của thuốc thử bằng
cách kiểm tra các dung dịch chuẩn có các hàm lượng chất phân tích khác nhau.
Các độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với các nồng độ.
A.2.9. Các dung dịch đệm được
lấy ra từ tủ lạnh phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi bổ sung vào các
hỗn hợp phân tích.
A.3. Cuvet đo quang và cuvet đo phổ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Các cuvet bằng chất dẻo có
các ưu điểm hơn so với cuvet thủy tinh như sau:
- rẻ (dùng một lần);
- có thể tiến hành nhiều phép phân tích
hơn;
- trong một mẻ, các cuvet bằng chất dẻo
cho độ hấp thụ thống nhất với nhau.
A.3.2. Mỗi khi đưa một mẻ
cuvet mới vào sử dụng, cần kiểm tra chiều dài đường quang của cuvet chính xác
(ví dụ: cuvet thạch anh) như sau:
Đổ đầy nước vào cuvet chính xác và các
cuvet bằng chất dẻo rồi đo độ hấp thụ (A1) của từng cuvet dựa vào
không khí. Sau khi tráng rửa, đổ đầy dung dịch NADH (khoảng 0,15 mg/ml) và đo lại
độ hấp thụ (A2) dựa vào không khí.
Đối với cả hai cuvet chính xác và
cuvet bằng chất dẻo, tính (A2 - A1). Chênh lệch (A2
- A1) giữa hai loại cuvet phải không đáng kể. Nếu chênh lệch (A2
- A1) vượt quá 0,5 % của giá trị hấp thụ thực đối với cuvet chính
xác thì tính độ chênh lệch trung bình theo phần trăm và cần tính đến giá trị
này đối với chiều dài đường quang, l, trong phần tính kết quả (xem 8.1).
A.3.3. Luôn sử dụng cuvet sạch
và không có vết xước. Làm khô hoặc lau sạch bên ngoài cuvet bằng khăn mềm.
A.3.4. Không đo độ hấp thụ
của cuvet mẫu thử dựa theo độ hấp thụ của cuvet thử trắng, vì sẽ không thu được
thông tin về cường độ hấp thụ của phép thử mẫu trắng. Đo độ hấp thụ của cả hai
mẫu thử và cuvet mẫu trắng dựa vào không khí và tính độ chênh lệch.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3.6. Dùng que khuấy bằng chất
dẻo để trộn lượng chứa trong cuvet hoặc đậy kín cuvet bằng parafin rồi xoay nhẹ
cuvet.
A.3.7. Sử dụng que khuấy để
loại bọt khí ra khỏi thành cuvet. Tránh làm xước thành cuvet.
A.3.8. Luôn sử dụng cùng một
loại cuvet để đo mẫu thử và phép thử mẫu trắng.
A.3.9. Luôn đặt các cuvet
theo cùng tư thế và cùng hướng trong giá đỡ cuvet. Đối với mục đích này, đánh dấu
một mặt của cuvet quang học.
A.4. Máy đo quang và máy đo phổ
A.4.1. Sử dụng máy đo phổ
(chiều rộng dải £ 10 nm), có
trang bị bộ lọc nhiễu (chiều rộng dải £ 10 nm) hoặc máy đo quang phổ, được trang bị
đèn hơi thủy ngân. Các phép đo sử dụng máy đo phổ hoặc máy đo quang có bộ lọc,
phải được thực hiện ở độ hấp thụ tối đa của NADH hoặc NADPH, nghĩa là ở bước
sóng 340 nm, còn các phép đo sử dụng máy đo quang có đèn hơi thủy ngân phải được
thực hiện ở 365 nm hoặc 334 nm.
CHÚ THÍCH: Các hệ số hấp thụ phân tử của
NADH và NADHP được đo ở bước sóng 334 nm, 340nm và 365 nm như sau:
- NADH và NADHP ở bước sóng 334 nm
(Hg): 6,18 x 106 cm2/mol;
- NADH và NADHP ở bước sóng 340 nm: 6,3
x 106 cm2/mol;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- NADH ở bước sóng 365 nm (Hg): 3,4 x 106
cm2/mol;
A.4.2. Giữa độ hấp thụ và nồng
độ của NADH hoặc NADPH phải có mối quan hệ tuyến tính đến độ giá trị 2,0. Kiểm
tra như sau:
a) Dùng pipet lấy 2,00 ml nước cất cho
vào cuvet. Đo độ hấp thụ A0 so với không khí.
b) Dùng pipet lấy 0,10 ml dung dịch
NADH (0,5 mg/ml) cho vào cuvet và trộn. Đo độ hấp thụ A1.
Tính độ hấp thụ giảm, Ar1,
theo công thức sau:
Ar1 = (At - A0) x
Trong đó:
A1 là độ hấp thụ thu được
trong phép đo dung dịch NADH (b);
A0 là độ hấp thụ thu được
trong phép đo của nước (a);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sau mỗi cặp phép đo, tính sự giảm của
độ hấp thụ, Am, theo công thức sau:
Am = (An - A0) x
Trong đó:
An là độ hấp thụ thu được tại
phép đo thứ n;
V là thể tích lượng chứa trong cuvet tại
phép đo thứ n.
d) Đối với mỗi phép đo, vẽ đồ thị của thể
tích dung dịch NADH có trong cuvet theo các độ hấp thụ giảm tương ứng. Đường đi
qua các điểm giao nhau phải là đường thẳng.
A.5. Pipet tự động và các bộ phân phối
khác
A.5.1. Sử dụng các pipet tự
động và các bộ phân phối khác theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
A.5.2. Sử dụng các đầu tip thích
hợp cho mỗi loại pipet.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a) cân cốc thủy tinh có mỏ với nước ở thời
điểm t;
b) dùng pipet hoặc bộ phân phối đong
nước cho vào cốc có mỏ và cân chính xác ở thời điểm t + 1 min sau khi
cân lần thứ nhất;
c) lặp lại chín lần quy trình sử dụng
pipet hoặc bộ phân phối như trong b);
d) cân cốc có mỏ tại các thời điểm t
+ 11 min, t + 12 min, t + 13 min, t + 14 min và t +
15 min không có pipet hoặc bộ phân phối, tính hao hụt khối lượng do bay hơi
trên một phút giữa các lần cân này;
e) tính thể tích và độ lặp lại của
pipet hoặc bộ phân phối, có tính đến hao hụt khối lượng do nước bị bay hơi.
A.5.4. Thể tích của một số
pipet tự động có thể bị ảnh hưởng bởi sự truyền nhiệt từ lòng bàn tay khi sử dụng
lâu.
Kiểm tra hiện tượng này bằng quy trình
trong A.5.3 và tránh sử dụng các pipet này.
A.5.5. Ngay trước khi sử dụng,
tráng đầu tip của pipet vài lần bằng dung dịch/huyền phù cần được lấy. Đối với
mỗi dung dịch mẫu, sử dụng một đầu tip mới.
A.5.6. Dùng pipet lấy nước,
dung dịch đệm, enzym, coenzym và dung dịch mẫu (nhúng đầu tip càng thấp càng tốt)
vào các góc khác nhau của cuvet.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.5.7. Tránh nhiễm bẩn.
A.6. Thông tin bổ sung
A.6.1. Kiểm tra về các khả
năng gây nhiễu và về sai số tổng thể bằng cách xác định các độ hấp thụ của hai
dung dịch có các nồng độ khác nhau của chất phân tích. Các độ hấp thụ thu được
phải tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích.
A.6.2. Sử dụng chất chuẩn để
kiểm tra các phản ứng enzym. Chất chuẩn này là chuẩn làm việc.
CHÚ THÍCH: Các chuẩn đối chứng có độ tinh
khiết xác nhận có thể có được từ các Viện chuẩn quốc gia.
A.6.3. Tiến hành phép thử độ
thu hồi khi có mặt của dung dịch mẫu. Lượng chất phân tích được bổ sung phải gần
bằng lượng có mặt trong dung dịch mẫu.
A.6.4. Sử dụng một que khuấy
cho mỗi cuvet hoặc dùng que khuấy sử dụng một lần.
CHÚ THÍCH: Lượng chất lỏng còn lại
trên que khuấy phải được coi như không đáng kể.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản
phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu
[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ
chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1:
Nguyên tắc và định nghĩa chung
[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính
xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp
cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn
[4] IDF 135B:1991, Milk and milk products -
Precision characteristics of analytical methods - Outline of collaborative
study procedure
[5] Comité de
Nomenclature de I’Union
Internationale de Biochimie, Recommandations en matière de Nomenclature des
Enzymes. Academic Press, New York, 1984
[6] Interlaboratory Collaborative Studies,
second series. Bulletin International Dairy Federation, 285, 1993, annex
A, annex B and annex C
1) Bộ kit thử Boehringer là một ví dụ về sản phẩm có
bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo
thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, còn tiêu chuẩn này không ấn định phải
sử dụng chúng.
2) Ultra Turrax là một ví dụ về sản phẩm
có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng
tiêu chuẩn, còn tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.