Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về
Các bản dự thảo

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8899:2012 Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp định lượng pseudomonas spp

Số hiệu:	TCVN8899:2012	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2012	Ngày hiệu lực:
ICS:	67.100.01	Tình trạng:	Đã biết

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8899:2012

ISO/TS 11059:2009

SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOMONAS SPP.

Milk and milk products – Method for the enumeration of Pseudomonas spp.

Lời nói đầu

TCVN 8899:2012 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 11059:2009;

TCVN 8899:2012 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Milk and milk products – Method for the enumeration of Pseudomonas spp.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Pseudomonas spp. có trong sữa và các sản phẩm sữa. Phương pháp này cho phép phân lập được tất cả Pseudomonas spp. ưa lạnh sinh sắc tố và không sinh sắc tố.

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng cho các mẫu môi trường trong sản xuất sữa.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2009), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy – Phần 1: Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm;

TCVN 8128-2:2009 (ISO/TS 11133-2:2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy – Phần 2: Các hướng dẫn thực hành về thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

...

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1. Pseudomonas spp. (Pseudomonas spp.)

Các loài vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas tạo thành các khuẩn lạc trong thạch penicillin và pimaricin (PPA) ở 25 ^oC có các đặc tính hóa sinh như mô tả, khi tiến hành các phép thử theo quy định trong tiêu chuẩn này.

4. Nguyên tắc

Cấy lên bề mặt môi trường nuôi cấy chọn lọc đặc một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc một lượng xác định của huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác. Trong các điều kiện tương tự, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

Ủ các đĩa đã cấy trong 48 h ở nhiệt độ 25 ^oC trong điều kiện hiếu khí.

Tính lượng Pseudomonas trong một mililit hoặc trong một gam mẫu từ số khuẩn lạc thu được trên các đĩa ở các mức pha loãng được chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và sau khi khẳng định các khuẩn lạc được chọn bằng phép thử oxidaza và phép thử lên men glucoza.

5. Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử

...

Về thực hành phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1) và TCVN 8128-2 (ISO/TS 11133-2).

5.2. Dịch pha loãng

Xem ISO 6887-5.

5.3. Thạch penicillin và pimaricin (PPA)

5.3.1. Môi trường cơ bản

5.3.1.1. Thành phần

Thành phần

Khối lượng

Sản phẩm phân hủy gelatin bằng enzym

...

Kali sulfat (K₂SO₄)

Magie clorua (MgCl₂)

Thạch

Nước

16,0 g

10,0 g

1,4 g

12,0 g đến 18,0 g ^a

...

^a Tùy thuộc vào cường độ gel của thạch.

5.3.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào các bình hoặc các chai có dung tích thích hợp. Khử trùng môi trường trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC trong 15 min.

5.3.2. Dung dịch ức chế

5.3.2.1. Dung dịch penicillin

5.3.2.1.1. Thành phần

Thành phần

Khối lượng

Penicillin G, muối kali

...

10⁶ IU

10 ml

5.3.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan penicillin trong nước và lọc để khử trùng.

Dung dịch penicillin này khi được bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC thì có thể bền được một tuần hoặc khi được làm đông lạnh các lượng nhỏ ở - 20 ^oC thì có thể bền được 6 tháng.

5.3.2.2. Dung dịch pimaricin

5.3.2.2.1. Thành phần

Thành phần

Khối lượng

...

Nước

0,1 g

10 ml

5.3.2.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan pimaricin trong nước. Khử trùng bằng hấp áp lực (6.1) ở 110 ^oC trong 20 min.

Pamaricin không bền trong dung dịch và cần được bảo quản tránh ánh sáng. Do đó, cần sử dụng dung dịch này trong ngày chuẩn bị. Cách khác, có thể bảo quản đông lạnh dung dịch này với các lượng nhỏ ở - 20 ^oC trong 6 tháng.

5.3.3. Môi trường hoàn chỉnh

5.3.3.1. Thành phần

Thể tích

...

Môi trường cơ bản 100 ml

Dung dịch penicillin 0,1 ml

100 000 IU/I

Dung dịch pimaricin 0,1 ml

0,01 g/l

5.3.3.2. Chuẩn bị

Trong điều kiện vô trùng, bổ sung các dung dịch chất ức chế vào môi trường cơ bản đã được làm tan chảy và được duy trì ở 44 ^oC đến 47 ^oC. Trộn cẩn thận môi trường hoàn chỉnh mới được chuẩn bị này.

5.3.4. Chuẩn bị các đĩa thạch PPA

...

5.3.5. Thực hiện phép thử để kiểm soát chất lượng

5.3.5.1. Năng suất

Ủ: 25 ^oC ± 1^oC trong 48 h ± 2 h

Chủng: Pseudomonas fluorecens ATCC 13525 hoặc

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Môi trường đối chứng: Môi trường thạch từ dịch thủy phân casein đậu tương (TSA)

Phương pháp kiểm tra: Định lượng

Chuẩn cứ: Tỷ lệ năng suất, P_R > 0,5 và các khuẩn lạc không đặc trưng.

5.3.5.2. Tính chọn lọc

...

Chủng: Escherichia coli ATCC 25922 hoặc

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Phương pháp kiểm tra: Định tính

Chuẩn cứ: Ức chế hoàn toàn

5.4. Thạch dinh dưỡng

5.4.1. Thành phần

Thành phần

Khối lượng

Chất chiết thịt

...

Thạch

Nước

3,0 g

5,0 g

Từ 12,0 đến 18,0 g ^a

1 000 ml

^a Tùy vào cường độ gel của thạch

5.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm hoặc các chai có dung tích tích hợp. Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC trong 15 min.

...

Chuẩn bị, làm khô và bảo quản các đĩa thạch dinh dưỡng, theo TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1).

5.4.4. Thực hiện phép thử để kiểm soát chất lượng

Các chi tiết về năng suất như sau:

Ủ:

25 ^oC ± 1 ^oC trong 24h ± 2 h

Chủng:

Pseudomonas fluorecens ATCC 13525 hoặc

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Escherichia coli ATCC 25922 hoặc

...

Môi trường đối chứng: Môi trường thạch từ sản phẩm phân hủy casein đậu tương (TSA)

Phương pháp kiểm tra: Định lượng

Chuẩn cứ: Tỷ lệ năng suất, P_R > 0,7 và các khuẩn lạc không đặc trưng.

5.5. Thạch glucoza

5.5.1. Thành phần

Thành phần

Khối lượng

Sản phẩm phân hủy casein bằng enzym

Chất chiết nấm men

...

Glucoza

Bromocresol tía

Thạch

Nước

10,0 g

1,5 g

5,0 g

10,0 g

0,015 g

...

1 000 ml

^a Tùy vào cường độ gel của thạch

5.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi thử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm (6.5). Khử trùng thạch glucoza trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC trong 15 min. Để các ống nghiệm theo tư thế thẳng đứng.

Ngay trước khi sử dụng, gia nhiệt bằng nước sôi hoặc dòng hơi nước trong 15 min. Sau đó nhanh chóng đưa về nhiệt độ ủ.

5.5.3. Thực hiện phép thử để kiểm soát chất lượng

5.5.3.1. Phép thử dương tính

Ủ:

...

Chủng:

Escherichia coli ATCC 25922

Phương pháp kiểm tra:

Định tính

Chuẩn cứ:

Dương tính

5.5.3.2. Phép thử âm tính

Ủ:

25 ^oC ± 1 ^oC trong 24h ± 2 h

...

Pseudomonas fluorecens ATCC 13525 hoặc

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Phương pháp kiểm tra:

Định tính

Chuẩn cứ:

Âm tính

5.6. Thuốc thử phát hiện oxidaza

5.6.1. Thành phần

Thành phần

...

N,N,N’,N’ – Tetrametyl-p-phenylenediamin dihydroclorua

1,0 g

Nước

100 ml

5.6.2. Chuẩn bị

Hòa tan thuốc thử trong nước ngay trước khi sử dụng.

Có thể sử dụng thuốc thử có bán sẵn trên thị trường và phải tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

...

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 25 ^oC ± 1 ^oC.

6.3. Máy đo pH.

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.4. Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc bằng chất dẻo vô trùng, đường kính khoảng 3 mm hoặc dây cùng chất liệu hoặc đũa thủy tinh.

CHÚ THÍCH: Không sử dụng que cấy vòng bằng niken-crom trong phép thử oxidaza (xem 8.4.2).

6.5. Ống nghiệm, chai hoặc bình cầu, có dung tích thích hợp.

6.6. Pipet chia độ xả hết, dung tích 1 ml, được chia vạch 0,1 ml phù hợp với loại A trong TCVN 7150 (ISO 835)^[2], hoặc pipet tự động như quy định trong ISO 8655-2^[3], sử dụng với các đầu tip vô trùng dùng một lần.

6.7. Đĩa Petri, làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

...

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707)^[1].

Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể nào liên quan đến việc lấy mẫu của sản phẩm có liên quan thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

8.1. Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân

Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân theo ISO 6887-5.

8.2. Cấy và ủ

8.2.1. Lấy hai đĩa thạch PPA (5.3.4). Dùng pipet vô trùng (6.6) chuyển vào mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu. Lấy một đĩa PPA khác. Dùng pipet vô trùng (6.6) chuyển vào đĩa mới vô trùng này 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất.

...

8.2.2. Dùng que gạt mẫu vô trùng (6.8) để dàn đều chất lỏng trên bề mặt đĩa thạch cho đến khô.

8.2.3. Lật úp các đĩa đã chuẩn bị (8.2.2) cho bề mặt thạch xuống phía dưới rồi để trong tủ ấm (6.2) ở 25 ^oC ± 1 ^oC trong 48 h ± 2 h.

8.3. Đếm và chọn khuẩn lạc

Sau khi kết thúc thời gian ủ quy định, đếm số khuẩn lạc trên từng đĩa và giữ lại các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Từ mỗi đĩa được giữ lại chọn ngẫu nhiên năm khuẩn lạc để thử khẳng định theo 8.4.

8.4. Thử khẳng định

8.4.1. Cấy truyền

Ria cấy từ mỗi khuẩn lạc đã chọn lên các đĩa thạch dinh dưỡng (5.4.3) để khẳng định.

Ủ các đĩa này trong tủ ấm (6.2) ở 25 ^oC ± 1 ^oC trong khoảng từ 24 h đến 48 h. Trên mỗi đĩa đã ủ chọn lấy một khuẩn lạc phân lập tốt để thử khẳng định đặc tính sinh hóa.

8.4.2. Phản ứng oxidaza

...

Trong trường hợp có mặt oxidaza, màu tím đậm đến màu đỏ tía sẽ xuất hiện trong khoảng từ 5 s đến 30 s. Nếu sau 30 s mà màu sắc không đổi thì phép thử được coi là âm tính.

8.4.3. Lên men glucoza

Dùng que cấy (6.4), cấy đâm sâu các khuẩn lạc được lấy từ thạch dinh dưỡng vào các ống thạch glucoza (5.5.2). Nới lỏng nút bông và ủ các ống thạch này ở 25 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± 3 h.

Phép thử được coi là âm tính (không lên men glucoza) khi thấy có vi khuẩn phát triển nhưng môi trường không chuyển màu vàng. Một số chủng Pseudomonas có thể làm bề mặt thạch chuyển màu vàng do oxi hóa glucoza.

8.4.4. Giải thích kết quả: các khuẩn lạc

Các khuẩn lạc có phản ứng oxidaza dương tính và không lên men glucoza được coi là khuẩn lạc Pseudomonas.

9. Biểu thị kết quả

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

10. Báo cáo thử nghiệm

...