Dung dịch hiệu chuẩn
|
Thể tích dung dịch chuẩn 1, ml
|
Thể tích pha động LC, ml
|
Nồng độ OTA cuối cùng, mg/ml
|
Dung
dịch chuẩn 1
|
-
|
-
|
40
|
Dung
dịch chuẩn 2
|
1500
|
500
|
30
|
Dung
dịch chuẩn 3
|
1000
|
1000
|
20
|
Dung
dịch chuẩn 4
|
500
|
1500
|
10
|
Dung
dịch chuẩn 5
|
250
|
1750
|
5
|
Dung dịch chuẩn 6
|
100
|
1900
|
2
|
4.2. Axit axetic băng - nước, tỷ lệ 1 : 29
Cho 30 ml axit axetic băng vào 870 ml nước đã khử ion, lọc
qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 mm
4.3. Dung dịch natri bicacbonat nước, 3 %
Cho 30 g natri bicacbonat vào 1 000 ml nước đã khử ion.
4.4. Dinatri hydro phosphat khan,
loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng
4.5. Kali dihydro phosphat,
loại tinh khiết phân
tích dùng cho sắc ký lỏng
4.6. Dung dịch PBS, pH 7.0
Cho 0.20 g kali dihydro phosphat,
1,10 g dinatri hydro phosphat khan, 8,00 g NaCI và 0,20 g KCI vào 1 000 ml nước đã khử ion và
đồng hóa. Cách khác, dùng các viên PBS có bán sẵn, ví dụ như Oxoid Code BR14 (pH 7,3) hoặc loại tương
đương.
4.7. Metanol, loại tinh khiết
phân
tích dùng cho sắc ký lỏng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.9. Axit axetic băng, loại
tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng.
4.10. Dung dịch metanol-natri bicacbonat
nước 3 % (tỷ lệ 1 : 1 phần thể tích)
Cho 500 ml dung dịch natri
bicacbonat 3 % (4.3) vào 500 ml metanol.
4.11. Toluen - axit axetic,
tỷ lệ 99 : 1
Cho 1 ml axil axetic băng (4.9) vào
99 ml
toluen.
4.12. Nitơ,
có độ tinh khiết 99,9 %
4.13. Heli, khí nén đã tinh sạch
hoặc hệ thống khử khi khác.
4.14. Pha động LC
Kết hợp axetonitril, metanol và axit
axetic băng-nước (4.2) để có được axetonitril-metanol-nước- axit axetic băng
(theo tỷ lệ 35 : 35 : 29 : 1). Pha động cần được khử khí bằng siêu lọc hoặc hệ
thống khử khí khác và bằng cách sục khí heli vào pha động trong quá trình bơm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết
bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể sau
5.1. Cột ái lực miễn nhiễm, chứa các kháng thể
OTA. Cột có công suất ³ 100 ng OTA và khả năng
thu hồi ³ 85 % OTA khi 100 ml dung dịch chuẩn chứa
5 ng độc tố trong dung dịch metanol-natri bicacbonat 3 % (4.10) (tỳ ]ệ
50 : 50)/dung dịch PBS (tỷ lệ 4 : 96) đi qua cột. Các cột ái lực miễn dịch cần
được đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
5.2. Máy đồng hóa/máy trộn, tốc độ của môtơ từ
0 r/min đến 16 000 r/min, được trang bị các lọ thủy tinh dung tích 946 ml.
5.3. Thiết bị siêu âm
5.4. Giấy lọc nhanh, đường kính 24 cm, được gấp nếp, ví dụ:
Giấy Whatman số 4 hoặc loại tương đương.
5.5. Màng lọc bằng sợi thủy tinh, đường kính 5,5 cm, cỡ lỗ 1 mm, ví dụ: Whatman GF/B hoặc loại tương đương
5.6. Bộ lọc màng, có cỡ lỗ khoảng 0,45
mm làm bằng xenluloza hoặc xenluloza
nitrat, dùng cho dung môi hữu cơ lỏng.
5.7. Bình định mức đã hiệu chuẩn,
dung tích 50 ml, 100 ml,
1 000 ml và
2 000 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.9. Cân, có thể đọc được đến
0,01 g.
5.10. Xyranh dùng một lần, dung tích 60 ml và 10 ml được dùng như bình chứa,
có ống nối thích hợp.
5.11. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì
nhiệt độ trong khoảng từ 40 °C đến 45 °C.
5.12. Hệ thống chân không, có phễu
lọc
màng phía trên đỉnh, giá đỡ phễu lọc màng, bàn kẹp bằng nhôm, nắp đậy và bình
cầu có tay cầm bên, kiểu Millipore hoặc loại tương đương.
5.13. Pipet định mức đã hiệu chuẩn,
dung tích 4 ml và 25 ml.
5.14. Máy trộn Vortex.
5.15. Máy đo quang phổ,
có cuvet thạch anh, có thể đo ở bước sóng từ 200 nm đến 400 nm.
5.16. Hệ thống sắc ký lỏng, gồm có hệ thống van
tiêm cỡ vòng 20 ml hoặc
loại tương đương, bơm pha động có thể bơm với tốc độ 1 ml/min, có detector huỳnh quang, bước
sóng kích thích l = 332 nm và bước sóng phát xạ l = 476 nm, có hệ
thống máy tính xử lý dữ liệu, cột pha đảo (C18) kích thước 250
mm x 4.6 mm, cỡ hạt 5 mm
và bộ phận khử khí.
5.17. Ống hút chân không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.20. Pipet dạng pittông đã hiệu chuẩn,
dung tích từ 100 m1
đến 1000 ml,
từ 20 ml
đến 200 ml
và từ 500 ml
đến 5000 ml, với các đầu pipet thích
hợp.
5.21. Bình cầu thủy tinh màu nâu,
dung tích 2 ml, 5 ml
và 10 ml.
6. Cách tiến hành
6.1. Yêu cầu chung
Toàn bộ qui trình phân tích cần được thực
hiện trong ngày.
6.2. Chuẩn bị mẫu thử
Dùng máy nghiền phòng thử nghiệm (5.1) để
nghiền mẫu thử và trộn kỹ cho đến khi lọt hết qua sàng 1 mm (5.1) hoặc dùng máy
trộn để trộn kỹ.
6.3. Chiết Ochratoxin A ra khỏi mẫu
Dùng cân (5.9) cân lấy 25 g, chính xác đến
0,1 g của phần mẫu thử cho vào bình định mức 500 ml (5.7). Thêm 200 ml dung dịch metanol -
natri bicacbonat 3 % (tỷ lệ 1:1). Trộn bằng máy trộn (5.2) trong 5 min với tốc
độ 8 000 r/min. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc nhanh (5.4) Ngay sau khi lọc, thu lấy
phần dịch lọc rồi lọc lại qua màng lọc sợi thủy tinh (5.5). Sử dụng hệ
thống chân không. Ngay sau khi lọc lần thứ hai chuyển 4 ml phần dịch lọc thu được cho vào
ống đong. Pha loãng bằng dung dịch PBS (4.6) đến 100 ml và đồng hóa.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Để cho cột ái lực miễn nhiễm (5.1) đạt đến
nhiệt độ phòng, rồi nối với ống hút chân không (5.17) và gắn xyranh dung tích
60 ml
(5.10).
Sử dụng 2 phần, mỗi phần khoảng 50 ml, của dịch chiết mẫu đã pha loãng thu được
trong 6.3 cho vào bình chứa dung tích 60 ml và cho đi qua cột ái lực miễn dịch với tốc
độ từ 2 ml/min đến 3 ml/min. Nếu cần, dùng đũa ấn xuống hoặc sử dụng chân không
nhẹ. Không để tốc độ dòng vượt quá 3 ml/min và không để cột chảy
đến khô. Rửa cột bằng 10 ml nước đã khử ion với
tốc
độ 3 ml/min. Làm khô cột bằng cách sử dụng chân không nhẹ trong 30 s hoặc dùng
đũa ấn nhẹ xuống. Tháo cột ái lực miễn dịch ra và thay bình chứa 60 ml bằng xyranh thủy tinh
10 ml.
6.5. Rửa giải OTA
Dùng xyranh 10 ml (5.10) lấy 4 ml metanol và đợi 3 min
để cho dung môi thấm vào gel trước khi rửa giải. Rửa giải độc tố ra khỏi cột
vào bình nón 5 ml hoặc 10 ml (5.18) với tốc độ dòng từ 2 ml/min đến 3
ml/min, dùng áp suất dương. Cho bay hơi dịch rửa giải đến khô bằng
cách sử dụng dòng nitơ (4.12) nhẹ trên nồi cách thủy (5.11). Hòa tan lượng cặn
thu được với 200 ml pha động LC và đồng hóa trong máy trộn Vortex (5.14) và/hoặc thiết
bi siêu âm (5.3).
6.6. Xác định OTA
6.6.1. Điều kiện vận hành máy sắc ký lỏng
Thể tích dung dịch chuẩn và thể tích dung
dịch mẫu được bơm lá 20 ml. Thực hiện theo
hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị về nhiệt độ của bộ bơm và nhiệt độ cột LC,
nghĩa là nhiệt độ phòng, tốc độ rửa giải 0,8 ml/min, pha động, xem 4.14.
6.6.2. Đánh giá cột
Độ phân dải của đường nền pic OTA được tách ra khỏi các
pic khác, có thời gian lưu của OTA khoảng 10 min có thể đạt
được khi sử dụng cột pha đảo (C18) kích thước 250 mm x 4,6 mm, với cỡ hạt
5 mm và pha động axit
axetonitril-metanol-nước-băng axetic (35 + 35 + 29 + 1) (4.14).
6.6.3. Đường chuẩn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.6.4. Xác định OTA trong dung dịch mẫu
thử
Bơm một lượng 20 ml dung dịch mẫu thử
cho vào hệ thống LC, sử dụng các điều kiện tương tự như đã được dùng trong khi dựng
đường chuẩn. Nhận biết Ochratoxin A bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với
thời gian lưu của dung dịch chuẩn. Nếu diện tích pic OTA trong sắc đồ mẫu lớn
hơn diện tích pic của dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất, thì pha loãng dịch
chiết mẫu và bơm lại.
7. Tinh toán và biểu
thị kết quả
Từ đường chuẩn, xác định phần khối lượng
của OTA, bằng nanogam trong dung dịch mẫu thử được bơm vào hệ thống sắc ký
lỏng.
Tính phần khối lượng WOTA của Ochratoxin A bằng
nanogam trên gam, sử dụng công thức (1):
(1)
Trong đó
M là khối lượng của OTA trong phần dịch
chiết mẫu (20 ml) được bơm vào hệ thống LC, tính bằng
nanogam (ng);
W là khối lượng phần mẫu thử được bơm vào
hệ thống LC, tính bằng gam (g). (trong trường hợp này là 0,05 g);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
V1, là thể tích dung môi chiết,
tính bằng mililit (ml), (ở đây = 200 ml);
V2 là thể tích dịch lọc
được đưa vào cột ái lực miễn dịch, tính bằng mililit-(ml), (trong trường hợp
này là 4 ml);
V3 là thể tích pha động
được dùng để lấy được cặn khô, tinh bằng microlit (ml), (trong trường hợp
này là 200 ml);
V4 là thể tích dịch chiết
được bơm vào hệ thống LC, tính bằng microlit (ml), (trong trường hợp
này là 20 ml).
8. Báo cáo thử
nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất
các thông tin dưới đây:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu
thử;
- viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp
đã sử dụng;
- kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- ngày tháng nhận mẫu thử nghiệm;
- ngày tháng thử
nghiệm;
- các điểm quan sát
được trong quá trình thử nghiệm;
- mọi thao tác không
qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc các phương án lựa chọn mà có thể ảnh hưởng
đến kết quả.