TIÊU CHUẨN VIỆT
NAM
TCVN
8352 : 2010
THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
HISTAMIN ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Fish
and fishery products - Determination of
histamine content - Method using high-performance liquid
chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8352 : 2010 do Cục Chế biến,
Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn
Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui
định phương pháp xác định hàm lượng histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy
sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2. Nguyên tắc
Histamin có trong mẫu
thủy sản và sản phẩm thủy sản được tách chiết bằng metanol. Dịch chiết được làm
sạch trên cột trao đổi anion, sau đó được tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-phthal
aldehyt (OPT). Hàm lượng dẫn xuất histamin được xác định bằng hệ thống HPLC với
detector huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.
3. Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng
các thuốc thử và vật liệu thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác,
và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1
Metanol.
3.2 Dung dịch
axit HCl,
2,5 M
Pha loãng 125 ml axit
clohydric (HCl, đậm đặc 37 %) trong nước để có 500 ml.
3.3 Dung dịch
axit HCl,
1 M
Pha loãng 40 ml dung
dịch axit HCl 2,5 M (3.2) trong nước để có 100 ml.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Pha loãng 10 ml dung
dịch axit HCl 1 M (3.3) trong nước để có 100 ml.
3.5
Dung
dịch NaOH,
1 M
Hòa tan 40 g natri
hydroxit (NaOH, rắn) trong 1 000 ml nước.
3.6 Dung dịch OPT
Hòa tan 0,100 mg
o-phthal aldehyt (OPT, 99 %, được bảo quản lạnh) trong 100 ml metanol (3.1).
Dung dịch OPT bền
trong 1 tuần khi bảo
quản lạnh trong chai sẫm màu.
3.7 Dung dịch H3PO4, 1,19 M
Pha loãng 121,8 ml
axit phosphoric (H3PO4, đậm đặc 85 %) với nước để có 1
000 ml.
3.8 Các dung
dịch chuẩn histamin
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hoà tan 0,165 6 g
histamin dihydroclorua (C5H11Cl2N3,
M = 184,07 g/mol) trong axit HCl 0,1 M rồi định mức đến 100 ml.
Dung dịch chuẩn gốc
histamin bền trong 1 tuần khi bảo quản lạnh.
3.8.2 Dung dịch chuẩn trung gian histamin, 10 mg/l
Pha loãng 1 ml dung
dịch chuẩn gốc histamin 1 000 mg/l (3.8.1) với dung dịch axit HCl 0,1 M (3.4)
rồi định mức đến 100 ml.
Dung
dịch chuẩn trung gian histamin bền trong 1 tuần khi bảo quản lạnh.
3.8.3 Các dung dịch
chuẩn làm việc histamin
Pha loãng lần lượt 1;
2 và 3 ml dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l (3.8.2) trong dung dịch axit HCl 0,1
M (3.4) rồi định mức đến 100 ml để được các dung dịch chuẩn 0,1; 0,2 và
0,3 mg/l.
Chuẩn bị mới các dung
dịch chuẩn làm việc mỗi khi phân tích.
3.9 Dung dịch
pha động
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH: Trong quá
trình chuẩn bị pha động, dung dịch phải được lọc qua giấy lọc 0,45 mm (4.6) và đuổi khí
bằng bể siêu âm (4.5) trước khi sử dụng.
3.10 Nhựa trao đổi
anion, Dowex loại 1 x 8, kích thước hạt 50 mesh đến 100 mesh
hoặc loại tương đương.
Nhựa trao đổi anion
được đổ vào trong dung dịch NaOH 1 M (3.5) với tỉ lệ tương ứng 15 ml NaOH/1 g
nhựa. Tiến hành khuấy đều dung dịch, để yên ít nhất trong 30 min rồi gạn bỏ
phần dung dịch. Lặp lại thao tác trên. Cuối cùng rửa nhựa với nước. Sau đó, đổ
nhựa lên giấy lọc rồi rửa nhiều lần với nước cho đến
khi hết NaOH. Nhựa bảo quản được 1 tuần trong nước.
4. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các
thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân
chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Bình nón, dung tích
150 ml.
4.3 Bình định mức, dung tích 50;
100 và 1 000 ml.
4.4 Pipet thủy tinh.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.6 Giấy lọc, 0.45 mm, Whatman No.1 hoặc
loại tương đương.
4.7 Máy nghiền, tốc độ 6
000 r/min đến 30 000 r/min, HEIDOLPH DIAX 900 hoặc loại tương đương.
4.8 Bể điều nhiệt, có thể duy
trì nhiệt độ 20 0C đến100 0C, GRANT Y14 hoặc loại tương
đương.
4.9 Máy lắc, tốc độ 50
r/min đến 500 r/min, IKAÒ KS 260 basic hoặc loại tương đương.
4.10 Máy đo pH, có thể đo
từ 2 đến 12 đơn vị pH, Knick 766 hoặc loại tương đương.
4.11
Cột thủy tinh, có khóa teflon,
dài 300 mm, đường kính trong 10,5 mm, đường kính ngoài 13 mm.
4.12 Cột sắc ký
lỏng C18,
dài 50 mm, đường kính trong 4,6 mm, kích thước hạt: 5 mm, Licrocart hoặc
loại tương đương.
4.13 Hệ thống HPLC, được trang
bị detector huỳnh quang.
4.14 Máy nghiền, sử dụng
chất lỏng để đồng hóa mẫu.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.1 Chuẩn bị
mẫu thử
Nghiền ít nhất 200 g
mẫu bằng máy nghiền (4.14). Cân 10 g mẫu đã được nghiền, chính xác đến 0,1 mg
cho vào bình nón 150 ml (4.2).
Thêm 50 ml metanol
(3.1), đồng hóa mẫu bằng máy nghiền (4.7) trong 2 min. Đặt bình chứa dung dịch
mẫu trên bể điều nhiệt (4.8) ở nhiệt độ 60 0C trong 15 min. Sau đó,
chuyển toàn bộ sang bình định mức 100 ml (4.3); tráng bình nón bằng metanol
(3.1).
Để nguội dung dịch
tới nhiệt độ trong phòng rồi định mức đến vạch bằng metanol (3.1) để có 100 ml
(kí hiệu V1). Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc (4.6).
Dịch chiết thu được bền trong vài tuần khi bảo quản lạnh.
CHÚ THÍCH: Đối với
mẫu nước mắm, mẫu thử được chuẩn bị bằng cách pha loãng trực tiếp 0,1 ml nước
mắm với 0,9 ml metanol (3.1) trong ống ly tâm dung tích 1,5 ml, ly tâm và lấy
0,1 ml dịch ly tâm đem làm sạch theo 5.4.2.
5.2 Chuẩn bị
mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thuỷ
sản đã được xác định không chứa histamin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như
chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để
xác định độ thu hồi 100 ppm
Thêm chính xác 1 ml
dung dịch chuẩn histamin 1 000 mg/l (3.8.1) vào 10 g mẫu trắng đã được nghiền.
Tiến hành chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi như chuẩn bị với mẫu thử theo
5.1.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.4.1 Chuẩn bị cột
làm sạch
Nhồi nhựa trao đổi
anion đã được chuẩn bị (3.10) vào cột thủy tinh (4.11) đến chiều cao khoảng 8
cm và giữ không để khô cột. Trước khi sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml
nước.
5.4.2 Làm sạch mẫu
Lần lượt cho 1 ml
dịch chiết thu được theo 5.1, 5.2 và 5.3 hoặc 0,1 ml nước mắm pha loãng theo
5.1 (kí hiệu V2) qua cột, rồi rửa cột bằng 4 ml đến 5 ml
nước. Thu dịch chảy ra vào bình định mức 50 ml (4.3) đã chứa 5 ml dung dịch
axit HCl 1 M (3.3). Khi lớp dung dịch cách mặt trên lớp nhựa khoảng 2 mm phải
cho tiếp nước vào cột cho đến khi thu được khoảng 35 ml dịch giải hấp. Khóa cột
rồi định mức phần dịch giải hấp thu được bằng nước để có 50 ml (kí hiệu V3).
5.5 Tạo dẫn xuất
huỳnh quang
5.5.1 Dung
dịch xác định đường chuẩn
Hút chính xác 5 ml
các dung dịch chuẩn histamin làm việc (3.8.3) vào các bình định mức 50 ml
(4.3), thêm 3 ml dung dịch NaOH 1 M (3.5) vào mỗi bình rồi lắc đều. Sau khoảng
5 min, thêm 1 ml dung dịch OPT (3.6) vào mỗi bình. Sau đúng 4 min, tiếp tục
thêm 3 ml dung dịch H3PO4 1,19 M (3.7) vào mỗi bình, định
mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M (3.4) rồi lắc đều các bình.
Chú ý cần lắc đều
dung dịch sau mỗi lần thêm thuốc thử, ít nhất 1 lần trong quá trình tạo phản
ứng với dung dịch OPT (3.6).
5.5.2 Mẫu
trắng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.5.3 Mẫu xác
định độ thu hồi
Hút chính xác 5 ml
dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi đã được làm sạch (5.4.2) vào bình định mức
50 ml (4.3). Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định
đường chuẩn theo 5.5.1.
5.5.4 Mẫu thử
Hút chính xác 5 ml
dịch chiết mẫu thử đã được làm sạch (5.4.2) vào bình định mức 50 ml (4.3). Sau
đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo
5.5.1.
5.6 Tiến hành phân
tích trên HPLC
5.6.1 Điều kiện phân
tích
– cột sắc ký: cột
C18 (4.12);
– nhiệt độ cột: 40
0C;
– pha động: hỗn
hợp gồm: KH2PO4 , axetonitril và TEA (3.9);
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
– bước sóng kích
thích: 350 nm;
– bước sóng phát xạ: 444
nm;
– thể tích tiêm: 20
ml.
5.6.2 Ổn định cột
sắc ký trong 30 min tại chế độ làm việc.
5.6.3 Tiêm các dung
dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5.1). Dựng đường chuẩn theo mối
quan hệ tuyến tính của diện tích píc sắc ký và nồng độ.
Đường
chuẩn phải có hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) lớn
hơn hoặc bằng 0,99.
5.6.4 Tiêm dịch
chiết mẫu trắng (5.5.2),dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi (5.5.3) và dịch
chiết mẫu thử (5.5.4) đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC. Mỗi
dịch thực hiện 2 lần. Tính diện tích trung bình và xác định nồng độ histamin
trong dịch chiết từ đường chuẩn.
6.
Tính kết quả
Hàm lượng histamin có
trong mẫu thử, C, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg) được tính
theo công thức sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
trong đó
Co là
nồng độ histamin có trong dịch chiết mẫu (5.6.4), tính bằng microgam trên
mililit (mg/ml);
V1 là
thể tích dịch mẫu thử (100 ml) đã được định mức (5.1);
V2 là
thể tích dịch chiết được làm sạch (5.4.2) (1 ml dịch chiết thủy sản hoặc 0,1 ml
dịch nước mắm pha loãng);
V3 là
thể tích dịch đã được làm sạch (5.4.2) chứa trong bình định mức (V3
= 50 ml);
m là
khối lượng (10 g) của mẫu thử đã được nghiền (5.1).
CHÚ THÍCH: Nếu kết
quả tính trên mẫu lớn hơn 15 mg/100 g thủy sản thì phải pha loãng dịch chiết
mẫu và thực hiện lại qui trình từ 5.4.
7.
Độ lặp lại và độ thu hồi
7.1 Độ lặp lại
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.2 Độ thu hồi
Độ thu hồi của mẫu, R,
được xác định theo mỗi lần phân tích mẫu. Độ thu hồi tính được phải nằm trong
khoảng từ 90 % đến 110 %.
8
Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử
nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông
tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương
pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương
pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao
tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự
chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả
thử nghiệm thu được.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
THƯ
MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] NMKL (Nordic
committee on food analysis), No 99, 1981, Histamine.
Determination in fish