Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7608:2007 thực phẩm - phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen

• Số hiệu: TCVN7608:2007
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2007

Bước kiểm chứng	Kiểm chứng môi trường^b	Kiểm chứng mẫu trắng tách chiết^c	Kiểm chứng tách chiết dương tính^d	Kiểm chứng ADN dương tính đích^e	Kiểm chứng ADN âm tính đích^f	Kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại^g	Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR^h
Đồng hóa	Khuyến cáo
tách chiết axit nucleic	¯a	một/dãy thử	bắt buộc tại các khoảng định kỳ
Đánh giá chất lượng axit nucleic	¯	¯	¯
Khuyếch đại axit nucleic	¯	¯	¯	bắt buộc	khuyến cáo	bắt buộc	khuyến cáo nhưng bắt buộc trong một số trường hợp
Đánh giá kết quả khuyếch đại axit nucleic	¯	¯	¯	¯	¯	¯	¯
Diễn giải		¯	¯	¯	¯	¯	¯
Báo thử nghiệm		¯	¯	¯	¯	¯	¯
a Các mũi tên cho thấy việc kiểm chứng này được áp dụng trong các bước phân tích tiếp theo. b Sử dụng việc kiểm chứng môi trường giúp cho phòng thử nghiệm nhận biết được các nguồn nhiễm bẩn ở giai đoạn sớm và thậm chí có thể được sử dụng để nhận biết được tại khu vực làm việc có sự nhiễm bẩn. c Ít nhất một kiểm chứng tách chiết mẫu trắng phải được thực hiện cho mỗi lần tách chiết ADN từ một hay nhiều mẫu. Ống nghiệm luôn luôn nằm cuối cùng trong mỗi dãy. Ví dụ, thích hợp là đặt một ống chiết mẫu trắng trên giá gồm 8 ống hoặc là vi đĩa 96 giếng cho một quá trình chiết tự động. d Thường xuyên thực hiện kiểm chứng tách chiết dương tính khi có mẻ thuốc thử chiết mới được dùng. Việc kiểm chứng này sẽ cho biết các sai sót về thuốc thử hay là sai sót do quá trình chiết. e Kiểm chứng ADN dương tính đích để chứng minh khả năng của qui trình khuyếch đại ADN của axit nucleic để phát hiện mẫu đại diện axit nucleic của sinh vật biến đổi gen hoặc taxon đích. Việc này có thể thực hiện được nhờ kiểm chứng tách chiết dương tính thích hợp. f Kiểm chứng ADN âm tính đích để chứng minh khả năng của qui trình khuyếch đại axit nucleic để tránh việc khuyếch đại dương tính giả khi không có mặt axit nucleic của sinh vật biến đổi gen hoặc của taxon đích. g Kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN để chứng minh không có sự nhiễm axit nucleic trong các mẻ thuốc thử PCR được sử dụng. Kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN có thể bỏ qua khi đã kiểm chứng tách chiết mẫu trắng. h Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR được sử dụng để chứng minh sự không có mặt của chất ức chế có thể hòa tan. Điều này có thể được chứng minh qua dãy dung dịch pha loãng axit nucleic làm khuôn. Tuy nhiên, một số đánh giá về ảnh hưởng của chất ức chế hòa tan đến các kết quả phân tích mẫu cần phải được tiến hành. l Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR là bắt buộc, nếu tất cả các phép thử PCR trên mẫu thử là âm tính và đối với các loại mẫu mà không thấy có ADN được khuyếch đại.

5.3. Tổ chức phòng thử nghiệm

5.3.1. Khái quát

Tuân thủ các yêu cầu về các quy định an toàn và các khuyến nghị an toàn của nhà sản xuất và cần tuân theo hướng dẫn đã được đưa ra trong TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/IEC 17025:1999).

5.3.2. Thiết kế phòng thử nghiệm

Sự nhiễm ADN một cách ngẫu nhiên có thể bắt nguồn từ bụi bẩn và sol khí. Chính vì vậy, việc tổ chức khu vực làm việc trong phòng thử nghiệm phải dựa vào:

- phân khu một cách hệ thống các bước có liên quan đến việc tạo ra kết quả và

- theo nguyên tắc “dòng chảy xuôi: đối với việc xử lý mẫu.

Đối với các phương pháp dựa vào ADN, thiết kế phòng thử nghiệm được áp dụng như sau:

...

...

...

a) khu vực nghiền và đồng hóa mẫu;

b) khu vực tách chiết axit nucleic từ vật liệu thử nghiệm;

c) khu vực dành riêng cho thiết bị PCR/các phản ứng khuyếch đại ADN;

d) khu vực dành cho các quá trình tiếp theo, bao gồm phân tích và đặc tính hóa của trình tự ADN đã được khuyếch đại, nếu có thể.

Nếu sử dụng kỹ thuật nghiền mẫu sinh ra các hạt bụi thì công việc này cần được thực hiện trong khu phụ.

Việc phân chia khu vực làm việc thông qua việc sử dụng các phòng khác nhau là hiệu quả nhất và là cách tốt nhất đảm bảo khu vực làm việc riêng biệt, cũng có thể sử dụng các phương pháp khác để tránh nhiễm bẩn miễn là chúng có hiệu quả tương tự.

5.3.3. Nhân viên

Ở những khu việc làm khác nhau, nhân viên mặc quần áo khoác khác nhau ví dụ như ở khu vực nghiền hoặc khu vực sau PCR. Nhân viên cũng phải mang găng tay dùng một lần. Nếu có thể, nên tránh dùng găng tay có phủ bột phấn khi làm việc với các phản ứng trước PCR, vì bột phấn có thể gây ứng chế các phản ứng PCR hoặc có thể gây nhiễm khi mà bột đó được làm từ tinh bột ngô. Găng tay và quần áo khoác phải được thay đổi thường xuyên. Tất cả các bước tiến hành PCR được thực hiện trong điều kiện không gây nhiễm ở mức có thể.

Tất cả các nhân viên thực hiện qui trình thử nghiệm cần được đào tạo về các kỹ thuật thích hợp.

...

...

...

Phòng thử nghiệm cần sử dụng các trang thiết bị đã được bảo dưỡng một cách hợp lý, phù hợp với các phương pháp sử dụng. Ngoài các trang thiết bị của phòng thử nghiệm chuẩn, trang thiết bị phụ được mô tả trong các phụ lục của các tiêu chuẩn cụ thể.

Dụng cụ và thiết bị phải được bảo dưỡng theo sự chỉ dẫn của nhà sản xuất.

5.3.5. Vật liệu và thuốc thử

Đối với việc phân tích, chỉ sử dụng các loại thuốc thử phân tích phù hợp với sinh học phân tử, không chứa ADN và ADNaza, trừ khi có qui định khác. Các thuốc thử và các dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng, trừ khi có quy định khác. Thuốc thử PCR được bảo quản với các lượng nhỏ để giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn. Nước được sử dụng là nước cất hai lần hoặc có chất lượng phù hợp. Các dung dịch được chuẩn bị bằng cách hòa tan các thuốc thử phù hợp trong nước và được hấp áp lực, trừ khi có qui định khác. Có thể sử dụng thiết bị lọc khử trùng (có cỡ lỗ là 0,22 µm) khi không thể hấp áp lực.

Để tránh nhiễm, kỹ thuật vô trùng cần được thực hiện trong khu vực để chuẩn bị PCR, cụ thể găng tay không có bột, dụng cụ bằng nhựa được tiệt trùng, hóa chất được hấp tiệt trùng, dụng cụ bằng nhựa vô trùng sử dụng một lần, đầu hút pipet được bảo vệ khỏi môi trường không khí.

Vật liệu và tất cả các hộp chứa và dụng cụ đựng thuốc thử dùng một lần cần được bảo quản khỏi các tác nhân nhiễm bẩn (ví dụ như bụi bẩn).

Sử dụng thuốc thử phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tiến hành kiểm tra để đánh giá sự nguyên vẹn của thuốc thử và không có ADNaza.

Cần đảm bảo rứng không có mặt các hoạt tính của enzym không mong muốn (ví dụ như exonucleaza) vốn gây cản trở phản ứng PCR. Dung dịch đệm phản ứng phải phù hợp với loại polymeraza sử dụng.

6. Diễn giải và biểu thị kết quả

...

...

...

Đối với phương pháp dịnh lượng, việc tính toán và biểu thị kết quả được đưa ra trong ISO 21570 và TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004). Khi nghi ngờ thì không được biểu thị kết quả.

6.2. Diễn giải các phép kiểm chứng

Mỗi phép kiểm chứng đều có giá trị hợp lệ, nếu kết quả quan sát được đối với bất kỳ phép kiểm chứng nào khác với giá trị hợp lệ thì phải phân tích lại. Kiểm chứng môi trường có thể là dương tính hoặc âm tính, nhưng khi cho kết quả dương tính thì phải thực hiện các biện pháp để loại bỏ và ngăn cản sự nhiễm do môi trường phòng thử ngihệm. Nếu kết quả thu được không hợp lệ đối với bất kỳ một phép kiểm chứng lặp lại nào thì phải thực hiện các biện pháp là loại bỏ hoặc thay thế những nguồn là nguyên nhân gây ra sai lỗi rồi sau đó phân tích lại. Kết quả phân tích chỉ có thể được báo cáo khi tất cả các phép kiểm chứng có kết quả phù hợp. Kết quả phù hợp đối với các phép kiểm chứng như sau:

- kiểm chứng tách chiết dương tính phải luôn dương tính;

- kiểm chứng tách chiết mẫu trắng phải luôn âm tính;

- kiểm chứng ADN dương tính đích phải luôn dương tính;

- kiểm chứng ADN âm tính đích phải luôn âm tính;

- kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN phải luôn âm tính.

Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR phải cho thấy ảnh hưởng ức chế không đáng kể lên phản ứng (đối với phép phân tích định tính thì ảnh hưởng của sự ức chế sẽ ít quan trọng hơn đối với phân tích định lượng).

...

...

...

Bảng 2 - Một số ví dụ về kết quả phản ứng PCR

Mẫu thử nghiệm

Kiểm chứng tách chiết dương tính

Kiểm chứng tách chiết mẫu trắng

Kiểm chứng ADN âm tính đích

Kiểm chứng ADN dương tính đích

Kết quả

+^a

+

...

...

...

-^b

+

dương tính

-

+

-

-

+

âm tính

...

...

...

+

+

-

+

không kết luận được^c

-

-

+

-

...

...

...

không kết luận được^c

-

-

-

-

-

không kết luận được^c

a Sản phẩm PCR phát hiện được.

b Không có sản phẩm PCR được phát hiện.

...

...

...

d Qui trình được lặp lại sử dụng phương pháp tách chiết khác hoặc bước tinh sạch tiếp theo (có thể có chất ức chế).

Ghi lại tất cả các bước thử nghiệm và các kết quả thu được.

6.3. Biểu thị kết quả âm tính

Kết quả âm tính không bao giờ biểu thị “không” hoặc là “không có mặt sinh vật biến đổi gen”.

Câu sau đây thường được xuất hiện trong báo cáo thử nghiệm:

“Đối với chất cần phân tích X, không phát hiện được vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen”

Ngoài ra, báo cáo thử nghiệm bao gồm các thông tin về:

- LOD của phương pháp phù hợp trên mẫu cụ thể và

- LOD thực tế đối với mẫu dựa trên kinh nghiệm của phòng thử nghiệm hoặc trên mẫu được phân tích (hoặc nói rõ rằng chưa biết).

...

...

...

6.4. Biểu thị kết quả dương tính

Câu sau đây thường được xuất hiện trong báo cáo:

“Đối với chất cần phân tích X, đã phát hiện được sử có mặt của vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen (nêu rõ trình tự đích đặc hiệu)”.

Có thể nêu sự nhận dạng sinh vật biến đổi gen, nếu biết.

6.5. Biểu thị kết quả nghi ngờ

Các kết quả của tất cả các phần thử nghiệm phải thống nhất. Khi ít nhất một phần thử nghiệm cho kết quả dương tính và ít nhất một phần thử nghiệm cho kết quả âm tính, thì phải phân tích lại.

Nếu ít nhất hai lần lặp lại cách tiến hành (bắt đầu bằng tách chiết axit nucleic) cho kết quả nghi ngờ, chẳng hạn như một kết quả dương tính và một kết quả âm tính, thì báo cáo phải nêu rõ rằng mẫu là âm tính ở giới hạn phát hiện được biểu thị theo TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005)  và ISO 21570.

6.6. Yêu cầu đảm bảo chất lượng

Các khía cạnh về đảm bảo chất lượng được nêu trong TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/EIC 17025:1999).

...

...

...

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất bao gồm các thông tin sau:

a) mọi các thông tin cần thiết để nhận dạng mẫu thử;

b) bất kỳ thông tin đặc biệt nào liên quan đến mẫu thử nghiệm (chẳng hạn: kích cỡ không phù hợp, trạng thái bị phân giải);

c) viện dẫn tiêu chuẩn này và các phụ lục tương ứng;

d) ghi ngày và phương pháp xử lý mẫu được sử dụng;

e) ngày nhận mẫu;

f) điều kiện bảo quản, nếu có;

g) ngày bắt đầu/kết thúc phân tích, nếu có;

...

...

...

i) cỡ mẫu phòng thử nghiệm và cỡ mẫu thử;

j) các kết quả theo yêu cầu của phương pháp cụ thể và các đơn vị được sử dụng để báo cáo kết quả, các thiết bị hiệu chuẩn và phương pháp tính toán được sử dụng;

k) quan sát bất thường trong khi thử nghiệm;

l) bất kỳ sự sai lệch nào, thêm vào, hay bớt đi so với quy định thử nghiệm;

m) các yêu cầu theo quy định trong báo cáo thử nghiệm của TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005) hoặc ISO 21570;

n) mọi yêu cầu quy định trong điều 6.

Thông tin phải được ghi cùng với đơn vị đo.

Khi có yêu cầu, sự không chắc chắn và mức độ tin cậy của phép đo sẽ được cung cấp cho người sử dụng kết quả.

...

...

...

[1] Codex Alimentarius Commission, Procedural Manual, Twelfth Edition for Principles for the Establishment of Codex Methods of Analysis, Guidelines on the Application of the Criteria Approach, 2001, p. 64 (see CX!MAX 01/4)

[2] HORWITZ, W. Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies. Pure and Applied Chemistry, 67, 1995, pp. 331-343

[3] Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling, In House method validation. In House validated methods and their role in methods of analysis for Codex purposes. Codex Alimentarius Commission. (CX!MAS 98/8), 1998, Budapest, Hungary, 23-27 November 1998

[4] INHORN, S.L.Quality Assurance Practices for Health Laboratories. APHA, Washington DC, 1978, p. 588

[5] httD://www.eurachem.ul.Dt/audies/mval.htm, ISBN 0-948926-12-0

[6] THOMPSON, M., ELLISON, S.L. and WOOD, R. Harmonised guidelinesf-r single laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl. Chem., 47, No.5, 2002, pp. 835-855

[7] ARUMUGANATHAN, K. and EARLE, E.D. Nuclear content of some important plant species. Plant Mol. Bioi. Rep., 9(3), 1991, pp. 208-218

[8] ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method

[9] ISO 7002:1986, Agricultural food products-Layout for a standard method of sampling from a lot

...

...

...

[11] ISO Guide 30:1992, Terms and definitions used in connection with reference materials

[12] ISOITS 21098, Foodstuffs - Nucleic acid based methods of analysis of genetically modified organisms and derived products - Information to be supplied and procedure for the addition of methods to ISO 21569, ISO 21570 or ISO 21571.