Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7605-3:2017 phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phần 3

• Số hiệu: TCVN7605-3:2017
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2017

Tên	Trình tự ADN của oligonucleotid	Nồng độ cuối trong PCR
Cấu trúc P35S-pat là trình tự đích:^[1,2^]
Đoạn mồi 35SP03.f	5'-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3’	200 nmol/1
Đoạn mồi pat-7.r	S'-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3’	200 nmol/l
Đoạn dò GSS01.s	5'-(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT C- (TAMRA)-3'^a	100 nmol/l
^a FAM:6-Cirboxyfluorescein,TAMRA:6-Carboxytetramethylrhodamine;

CHÚ THÍCH Có thể sử dụng các loại thuốc nhuộm reporter và/hoặc thuốc nhuộm quencher tương đương cho đoạn dò nếu chúng cho kết quả tương tự hoặc tốt hơn.

5.2.4  ADN chuẩn dùng cho hiệu chuẩn

Dung dịch ADN chuẩn với nồng độ đã biết (ng/μl) có thể được sử dụng để tính số lượng bản sao của trình tự đích P35s-pat.

Khi sử dụng hệ gen ADN thực vật làm ADN chuẩn, thì số lượng gen đơn bội tương ứng cần được tính theo khối lượng phân tử của gen đơn bội thực vật bằng Công thức (1) sau đây:

                                                                                        (1)

Trong đó:

n_hgeq là số lượng gen đơn bội tương ứng trên microlit

[ADN] là nồng độ ADN tính bằng nanogam trên microlit, (ng/μl);

m_hg là khối lượng hệ gen đơn bội, tính bằng picogam (pg).

...

...

...

6  Thiết bị, dụng cụ

Đối với thiết bị và vật liệu, xem TCVN 7605 (ISO 21569). Ngoài các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường cần có các thiết bị sau:

6.1  Thiết bị real-time PCR

Thiết bị real-time PCR thích hợp cho việc kích thích các phân tử huỳnh quang và phát hiện các tín hiệu huỳnh quang tạo ra trong quá trình PCR.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị mẫu thử

Cần đảm bảo rằng mẫu thử được sử dụng để chiết ADN là mẫu đại diện của phòng thử nghiệm, ví dụ bằng cách nghiền hoặc đồng hóa mẫu. Lưu ý đến các bước đo và thực hiện theo quy định trong TCVN 7606 (ISO 21571) và TCVN 7608 (ISO 24276).

7.2  Chuẩn bị chiết ADN

Việc chuẩn bị ADN từ phần mẫu thử, phải tuân thủ các hướng dẫn chung và các phép đo được nêu trong TCVN 7606 (ISO 21571). Nên chọn phương pháp chiết ADN được mô tả trong Phụ lục A, TCVN 7606 (ISO 21571).

...

...

...

Phương pháp quy định tổng thể tích là 25 μl cho mỗi ống phản ứng PCR. Chuẩn bị phản ứng theo Bảng 2.

Rã đông hoàn toàn thuốc thử ở nhiệt độ phòng. Mỗi loại thuốc thử phải được trộn cẩn thận và cho ly tâm nhanh trước khi được lấy bằng pipet. Chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử có chứa tất cả các thành phần trừ mẫu ADN. Lượng hỗn hợp thuốc thử PCR yêu cầu phụ thuộc vào số lượng phản ứng cần được thực hiện, bao gồm ít nhất một phản ứng bổ sung để dự phòng. Với mỗi phản ứng sử dụng 5 μl ADN mẫu.

Bảng 2 - Chuẩn bị phản ứng để khuếch đại

Tổng thể tích phản ứng

25 μl

Mẫu ADN (đến 200 ng) hoặc mẫu kiểm soát

5 μl

Dung dịch đệm PCR^a (bao gồm MgCI₂, dNTP và polymerase ADN hot-start

12,5 μl

...

...

...

Xem Bảng 1

Đoạn dò GSSO1.s

Xem Bảng 1

Nước

Đến 25 μl

^a Trong nghiên cứu cộng tác, tùy thuộc vào thiết bị real-time PCR mà các dung dịch đệm PCR khác nhau đã được sử dụng [TaqM.in Universal PCR Mastermix (Life Technologies. Darmstadt), QuantiTeci Multiplex PCR NoROX hoặc QuantiTect Probe PCR Master/mix (Oiagen GmbH, Hilden)]. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Các sản phẩm tương ứng từ các nhà sản xuất khác có thể được sử dụng nếu chúng cho kết quả tương tự hoặc tốt hơn. Nếu cần, điều chỉnh các lượng thuốc thử và chương trình nhiệt độ-thời gian cho phù hợp.

Trộn hỗn hợp thuốc thử, ly tâm nhanh và dùng pipet lấy 20 μl hỗn hợp này vào từng ống phản ứng. Đối với việc kiểm soát thuốc thử PCR, thêm 5 μl nước để thiết lập phản ứng. Dùng pipet lấy 5 μl mẫu ADN hoặc 5 μl dung dịch kiểm soát tương ứng (kiểm soát chiết mẫu trắng, kiểm soát đích ADN dương tính). Nếu cần, chuẩn bị kiểm soát ức chế PCR như nêu trong TCVN 7608 (ISO 24276).

Chuyển các ống phản ứng vào máy chu trình nhiệt và khởi động chương trình nhiệt độ-thời gian.

7.4  Chương trình nhiệt độ-thời gian

...

...

...

Bảng 3 - Chương trình nhiệt độ-thời gian

Bước

Thông số

Nhiệt độ

Thời gian

Đo huỳnh quang

Số chu trình

1

Hoạt hóa UNG (tùy chọn)

...

...

...

2 min

Không

1

2

Biến tính ban đầu

95 °C

10 min

Không

1

...

...

...

Khuếch đại

Biến tính

95 °C

15 s

Không

45

Gắn mồi và kéo dài

60 °C

60 s

...

...

...

8  Tiêu chí chấp nhận/từ chối

8.1  Yêu cầu chung

Chương trình phân tích dữ liệu thiết bị đặc hiệu real-time PCR tương ứng được sử dụng để nhận biết các sản phẩm PCR. Các kết quả khuếch đại có thể được đưa ra theo cách khác nhau, tùy thuộc vào thiết bị được sử dụng. Trong trường hợp không có sản phẩm PCR được phát hiện (kiểm soát âm tính), thì kết quả có thể được biểu thị là "không xác định được", "không khuếch đại được" hoặc số chu trình tối đa. Nếu việc khuếch đại của trình tự ADN đích xảy ra trong mẫu (kiểm soát dương tính), thì có thể quan sát được đường khuếch đại hình chữ S và số chu trình được tính mà tại đó giá trị huỳnh quang xác định trước bị vượt quá ngưỡng (giá trị C_t hoặc giá trị C_p).

Nếu số liệu tín hiệu đo huỳnh quang không điển hình, thì việc giải thích tự động không mang lại kết quả có nghĩa, cần phải thiết lập thủ công đường nền và ngưỡng trước khi giải thích dữ liệu. Trong trường hợp này, áp dụng các hướng dẫn cho thiết bị cụ thể nêu trong sổ tay dùng phần mềm giải thích.

8.2  Nhận biết

Trình tự đích phát hiện được, nếu:

- sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu P35S-pat của 35SP03.C và pat-7.r và đoạn dò GSS01.S, có thể quan sát được đường khuếch đại hình chữ S và giá trị huỳnh quang xác định trước đã bị vượt quá ngưỡng,

- việc thiết lập kiểm soát PCR không bổ sung ADN (kiểm soát thuốc thử PCR, kiểm soát chiết âm tính), không quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S và giá trị huỳnh quang xác định trước không bị vượt quá ngưỡng, và

- việc thiết lập kiểm soát khuếch đại (kiểm soát đích ADN dương tính, kiểm soát ức chế PCR) các giá trị C_t dự kiến (hoặc giá trị C_p) đạt được.

...

...

...

Với các chuẩn ADN có chứa các lượng xác định số bản sao P35S-pat (xem 5.2.4, 9.3), có thể dựng đường chuẩn và được sử dụng để tính số lượng bản sao P35S-pat trong các mẫu chưa biết.

9  Thực trạng xác định giá trị sử dụng và tiêu chí hiệu năng

9.1  Độ chắc chắn của phương pháp

Độ chắc chắn của phương pháp chưa được kiểm tra với những thay đổi nhỏ các yếu tố như nồng độ thuốc thử (ví dụ đoạn mồi, đoạn dò) hoặc các điều kiện phản ứng (ví dụ: nhiệt độ gắn mồi).

CHÚ THÍCH Trong phép thử nghiệm cộng tác, độ chắc chắn của phương pháp đã được kiểm tra bằng các máy real-time PCR khác nhau (ABI 7500, ABI 7700, ABI 7900, RotorGene 3000, RotorGene 6000, LightCycler 480). Máy real-time PCR không ảnh hưởng đến hiệu năng của phương pháp.

9.2  Phép thử cộng tác để xác định LOD

LOD của phương pháp được thử nghiệm trong nghiên cứu cộng tác được tổ chức Bảo vệ Người tiêu dùng và An toàn Thực phẩm Liên bang Đức (BVL) thực hiện năm 2011 với tổng cộng 10 phòng thử nghiệm tham gia. Các phòng thử nghiệm tham gia đã nhận được 4 mẫu ADN từ thực vật biến đổi gen dương tính có chứa trình tự đích P35S-pat.

Để chuẩn bị mẫu, các mẫu chuẩn đã được chứng nhận của Hiệp hội các nhà Hóa học về dầu của Mỹ (AOCS Urbana USA) và Viện Chất chuẩn và Đo lường (IRMM, Geel Belgium) đã được sử dụng. Các vật liệu được sử dụng là ADN từ lá cây hạt cải dầu T45 (AOCS 0208-A2), đậu tương A2704-12 (AOCS, 0707-B2), ngô T25 (AOCS, 0306-H) và ADN chiết được từ bột ngô 1507 (IRMM ERM- BF418d). Nồng độ ADN được xác định bằng quang phổ. Số lượng gen trên mỗi μl được tính theo Công thức (1). Trên cơ sở số lượng gen tính được số bản sao tương ứng với trình tự P35S-pat dựa trên số tích hợp của trình tự P35S-pat vào hệ gen thực vật cũng như mức độ tiếp nhận gen vào thực vật được sử dụng (xem Bảng 4). Số lượng bản sao của mẫu ADN được điều chỉnh đến khoảng 100 bản sao của trình tự P35S-pat trên mỗi μl.

Bảng 4 - Đặc tính của mẫu chuẩn để xác định LOD

...

...

...

Nguồn mẫu chuẩn

Vật liệu/% (m/m) biến đổi gen

Khối lượng gen đơn bội (pg) [3]

Tình trạng tiếp hợp giao tử

Số bản sao P35S-pat trên gen đơn bội

Chiều dài của sản phẩm PCR P35S-pat (bp)

Hạt cải dầu T45

AOCS

ADN/99,99 %

...

...

...

Đồng hợp tử

1^[^4^]

111

Đậu tương A2704-12

AOCS

ADN/99,99 %

1,13

Đồng hợp tử

2^[5]

...

...

...

Ngô T25

AOCS

ADN/99,99 %

2,7

Đồng hợp tử

1^[6]

111

Ngô TC1507

IRMM

...

...

...

2,7

Dị hợp tử

1^[7]

102

Trên cơ sở của bốn dung dịch ADN chuẩn, các phòng thử nghiệm chuẩn bị dãy pha loãng để thu được các dung dịch ADN với 50 số bản sao từ 0,1/25 μl phản ứng PCR, tương ứng. Các thành viên tham gia đã phân tích từng dung dịch ADN pha loãng bằng phương pháp real-time PCR P35S-pat sáu lần phép xác định theo các điều kiện được nêu trong Bảng 1 đến Bảng 3. Kết quả của nghiên cứu thử nghiệm cộng tác này được liệt kê trong Bảng 5.

Bảng 5 - Các kết quả phép thử cộng tác để xác định LOD

Số bản sao P35S- pat trên PCR

Số kết quả dương tính (C_t < 45) trong số 60 kết quả

Hạt cải dầu T45

...

...

...

Ngô T25

Đậu tương A2704-12

50

60

60

60

60

20

60

...

...

...

60

60

10

59

60

60

60

5

46

...

...

...

56

55

2

26

52

41

36

1

11

...

...

...

21

24

0,1

3

8

3

2

9.3  Phép thử cộng tác để định lượng cấu trúc P35S-pat trong hạt cải dầu

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong nghiên cứu cộng tác được Tiểu ban về xây dựng Phương pháp của Ủy ban Hợp tác Quốc gia và Liên bang Đức về Kỹ thuật di truyền (LAG) thực hiện vào năm 2014 với tổng 14 phòng thử nghiệp tham gia. Những bên tham gia đã nhận được 5 mẫu hạt và 5 mẫu ADN tương ứng.

...

...

...

Các phòng thử nghiệm tham gia thực hiện ba lần phép xác định với mỗi mẫu bằng phương pháp real-time PCR P35S-pat với các điều kiện được nêu trong Bảng 1 đến Bảng 3. Để hiệu chuẩn, 6 ADN chuẩn (100, 300, 900, 2 700, 8 100, 100 000 bản sao đã được cung cấp) được đo hai lần trong cùng một lần phân tích PCR. Ngoài ra, thực hiện cùng số phép đo sử dụng phương pháp real-time PCR taxon đích đặc hiệu gen pepC của hạt cải dầu.^[^1^] Dựng đường chuẩn bằng cách dựng các giá trị C_t theo lôgarit của số bản sao trình tự đích được cung cấp cho các dung dịch hiệu chuẩn, số lượng bản sao tương ứng với các mẫu được tính bằng nội suy từ đường chuẩn.

Trong Bảng 6 đưa ra tóm tắt các kết quả. Bảng 7 cho thấy các kết quả định lượng. Trước khi tính các hàm lượng biến đổi gen trung bình và dữ liệu độ chụm sử dụng phép kiểm tra thống kê theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) ^[8^], các số lạc Gruhbs và Cochran được xác định và loại bỏ nếu có. Vì không biết được số lượng alen pepC trong các giống cải dầu khác nhau, nên không thể sử dụng các kết quả của PCR taxon đặc hiệu để tính số bản sao gen của cây cải dầu. Do đó, độ chính xác của phương pháp này không thể xác định được. Ngoài ra, giả định rằng hàm lượng biến đổi gen đúng trong mẫu hạt có thể sai lệch so với hàm lượng dự kiến. Không thể ước lượng được độ sai lệch.

Bảng 6 - Kết quả phép thử cộng tác để định lượng cấu trúc P35S-pat trong hạt cải dầu

Năm thực hiện phép thử cộng tác

2004

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

14

Số lượng phòng thử nghiệm báo cáo kết quả

14

...

...

...

5

Số lượng mẫu ADN cho mỗi phòng thử nghiệm

5

Số lượng kết quả được chấp nhận

140

Số lượng mẫu được chấp nhận chứa trình tự đích P3SS-pat

112

Số lượng mẫu được chấp nhận không chứa trình tự đích P3SS-pat

28

...

...

...

0 (0 %)

Kết quả âm tính giả

0 (0 %)

Bảng 7 - Kết quả định lượng thu được trong phép thử cộng tác P35S-pat

Hàm lượng biến đổi gen tương đối của mẫu tính bằng % khối lượng (w/w)

Hàm lượng biến đổi gen tính được, %
(số bản sao P35S-pat/số bản sao pepC)

MW^a

RSD_R^b (%)

0,1 % (hạt cải dầu)

...

...

...

52,0

0,5 % (hạt cải dầu)

0,88

29,5

1 % (hạt cải dầu)

1,78

42,1

2 % (hạt cải dầu)

3,91

...

...

...

0,1 % (ADN)

0,14

32,2

0,5 % (ADN)

0,54

34,5

1 % (ADN)

1,08

21,8

...

...

...

2,26

17,3

^a Giá trị trung bình sau khi trừ số lạc Grubbs và Cochran

^b Độ lệch chuẩn tương đối (trong điều kiện tái lập) sau khi trừ số lạc Grubbs và Cochran

9.4  Độ nhạy

Trong Bảng 5, các kết quả phép thử cộng tác với các mẫu ADN cho thấy số lượng thấp về bản sao của trình tự đích P35S-pat. ADN chuẩn, thiết lập nồng độ 10 bản sao cho mỗi phản ứng PCR, dẫn đến sự khuếch đại ở hầu hết các phòng thử nghiệm chỉ loại một trong 60 phản ứng đối với cây cải dầu T45. Dựa trên những kết quả này, giới hạn phát hiện đối với sự kiện biến đổi gen đã kiểm tra nhỏ hơn hoặc bằng 10 bản sao.

9.5  Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của đoạn mồi và đoạn dò đã được đánh giá xác nhận in silico sử dụng các liên kết trình tự có dữ liệu trong ngân hàng gen GenBank/EMBL/DDBJ (ngày tìm kiếm: 2011-06-16). Với mục đích này, bằng cách sử dụng chương trình BLASTN và trình tự của sản phẩm PCR của ngô từ sự kiện FP967 (Tài liệu tham khảo [2]), để so sánh với các trình tự nucleotid trong GenBank (cơ sở dữ liệu "non-redundant" với tất cả GenBank, RefSeq, EMBL, DDBJ và PDB) và cơ sở dữ liệu về các trình tự nucleotid đã có bản quyền được cấp bằng sáng chế. Kết quả tìm kiếm cho thấy không hoàn toàn giống với các trình tự khác trong cơ sở dữ liệu ngoại trừ các oligonucleotid đích. Tính đồng nhất của trình tự amplicon chỉ tìm thấy đối với các trình tự nucleotid rõ ràng của DAS 59122-7, DAS-59132, TCI507 và A5547-127, cũng như đối với các trình tự nucleotid rõ ràng khác của thực vật biến đổi gen không đặc hiệu hoặc vector được sử dụng để chuyển hóa cây trồng. Tìm kiếm BLASTN (ngày tìm kiếm: ngày 15 tháng 11 năm 2011) xác nhận tính đồng nhất hoàn toàn của trình tự P35S-pat với trình tự nucleotid của thực vật biến đổi gen hoặc vectơ được sử dụng để chuyển hóa cây trồng.

Khi thử nghiệm xác định tính đồng nhất của phương pháp P35S-pat, không phát hiện sự khuếch đại ADN từ thực vật biến đổi gen sau đây:

...

...

...

- Hạt cải biến đổi gen: GT73 (MON-ØØØ73-7), Laurat (pCGN3828) (CGN-89465-2), MS1xRF1 (ACS- BNØØ4-7xACS-BNØØ1-4), MS8 (ACS-BNØØ5-8);

- Ngô biến đổi gen: 3272 (SYN-E3272-5), Btl76 (SYN-EV176-9), CBH-351 (ACS-ZMØØ4-3), M0N809 (PH-MON8Ø9-2), MON810 (MON-ØØ81Ø-6), GA21 (MON-ØØØ21-9), MIR604 (SYN-1R6Ø4-5), MONB63 (MON-ØØ863-5). M0N88017 (MON-88Ø17-3), NK603 (MON-ØØ6Ø3-6);

- Đậu tương biến đổi gen: 305423 (DP-3Ø5423-1), 356043 (DP-356Ø43-5), MON40-3-2 (MON-Ø4Ø32-6);

- Khoai tây biến đổi gen: EH92-527-1 (BPS-25271-9);

- Củ cải đường biến đổi gen: GTSB77,H7-1 (KM-ØØØ71-4);

- Đu đủ biến đổi gen: 55-1 (CUH-CP551-8).

Đối với thực vật biến đổi gen sau đây, thực nghiệm cho thấy rằng phương pháp phát hiện P35S-pat là phương pháp sàng lọc thích hợp:

- Hạt cải dầu biến đổi gen: Falcon GS40/90 (ACS-BNØ1Ø-4), Topas 19/2 (ACS-BNØØ7-1), T45 (ACS-BNØØ8-2), Liberator (ACS-BNØØ9-3);

- Ngô biến đổi gen: T14 (ACS-ZMØØ2-1), T25 (ACS-ZMØØ3-2), TC-1507 (DAS-Ø15Ø7-1), DAS- 59122 (DAS-59122-7);

...

...

...

Đối với các sự kiện Topas 19/2, T45, TC-1507. DAS-59122-7, DAS-59123, A2704-12 và A5547-127, đã xác định được các chiều dài lý thuyết của amplicon P35S-pat từ 102 bp đến 111 bp (xem Bảng 4).

CHÚ THÍCH Trong ngô Bt11, chiều dài amplicon P35S-pat là 410 bp và chỉ phát hiện được trong những trường hợp đặc biệt (ví dụ số lượng bản sao cao, một vài dung dịch đệm PCR).

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải được thực hiện theo TCVN 7068 (ISO 24276) và các tiêu chuẩn áp dụng khác (ví dụ TCVN/ISO/IEC 17025^[^9^]).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] SUB-COMMITTEE FOR METHOD DEVELOPMENT OF THE GERMAN NATIONAL AND FEDERAL JOINT COMMITTEE ON GENETIC ENGINEERING (LAG) Real-Time PCR zur quantitativen Bestimmung gentechnisch veränderter Rapslinien mit dem 35S/pat-Genkonstrukt. J. Verbr. Lebensm. 2008, 3 pp.111-114

[2] H.-U. Waiblinger, L. Grohmann, J. Mankertz, D. Engelbert, K. Pietsch A practical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 396 (6) pp. 2065-2072

[3] K. Arumuganathan, E.D. Earle Nuclear content of some important plant species. Plant Mol. Biol. Rep. 1991, 9 pp. 208-218

...

...

...

[7] Opinion of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on a request from the Commission related to the notification (Reference C/ES/01/01) for the placing on the market of insect-tolerant genetically modified maize 1507 for import, feed and industrial processing and cultivation, under Part C of Directive 2001/18/EC from Pioneer Hi-Bred lnternational/Mycogen Seeds. EFSA Journal. 2005, 181 pp. 1-33

[8] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[9] TCVN ISO/IEC 17025 (ISO/IEC 17025), Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn

[10] ISO 21570, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods

*) ISO 21569:2005 đang được soát xét để trở thành ISO 21569-1