Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4829:2001 về Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung về phương pháp phát hiện Salmonella

• Số hiệu: TCVN4829:2001
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: 28/12/2001

Phép thử^1)	Phản ứng dương tính hay âm tính	Tỉ lệ phần trăm các chủng Salmonella có phản ứng^2)
TSI glucoza (hình thành axit) (9.5.2.1)	+	100
TSI glucoza (sinh khí) (9.5.2.1)	+	91,9^3)
TSI lactoza (9.5.2.1)	-	99,2^4)
TSI sucrosa (9.5.2.1)	_	99.5
TSI hydro sunfua (9.5.2.1)	+	91,6
Phân qiải ure (9.5.2.2)	-	99
Lysin decacboxyl (9.5.2.3)	+	94,6^5)
Phản ứng β-galactosidaza (9.5.2.4)	_	98,5^4)
Phản ứng Voges-Proskauer (9.5.2.5)	-	100
Phản ứng Indol (9.5.2.6)	-	98,9
1) W.H.Ewing và M.M. Ball., Các phản ứng sinh hóa của các chủng thuộc Salmonella. Trung tâm bệnh lây quốc gia, Atlanta, Georgia. Mỹ (1966). 2) Các tỷ lệ phần trăm này nói rằng không phải tất cả các chủng Salmonella có các phản ứng ghi "+' hoặc “-” .Các tỉ lệ phần trăm này có thể thay đổi tuỳ theo từng quốc gia hay từng loại thực phẩm. 3) Salmonella typhi là yếm khí. 4) Subgenus III Salmonella (arizona) cho các phản ứng lactoza dương tính hoặc âm tính nhưng β-galactosidaza luôn dương tính, Subgenus II Salmonella cho phản ứng lactoza âm tính nhưng có thể cho phản ứng β-galactosidaza dương tính. Để nghiên cứu các chủng, cần tiến hành các thử nghiệm sinh hoá bổ sung. 5) S.paratyphi là âm tính

9.5.3. Khẳng định về huyết thanh học

Phát hiện sự có mặt của Salmonella có kháng nguyên O, Vi và H bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với huyết thanh tương ứng từ các khuẩn lạc thuần khiết (9.5.1) và sau khi đã loại trừ những chủng tự ngưng kết.

9.5.3.1. Loại bỏ những chủng tự ngưng kết

Cho một giọt dung dịch muối (5.2.13) lên một phiến kính đã được làm sạch cẩn thận.

Trộn đều với khuẩn lạc cần kiểm tra thành một huyền phù đục và đều.

Lắc nhẹ trong 30 giây - 60 giây.

Xem xét kết quả trên nền tối, tốt nhất là với kính lúp.

Nếu các vi khuẩn dính kết thành các đơn vị ít hoặc nhiều rõ rệt thì chủng này được coi là tự ngưng kết và không phải thử nghiệm tiếp vì không thể phát hiện kháng nguyên được.

9.5.3.2. Kiểm tra kháng nguyên O

...

...

...

Phản ứng được coi là dương tính, nếu có ngưng kết.

Lần lượt sử dụng các huyết thanh đa giá và đơn giá.

9.5.3.3. Kiểm tra kháng nguyên Vi

Tiến hành theo 9.5.3.1, nhưng thay dung dịch muối bằng một giọt kháng huyết thanh Vi (5.3).

Nếu có ngưng kết, phản ứng được coi là dương tính.

9.5.3.4. Kiểm tra kháng nguyên H

Cấy khuẩn lạc thuần khiết, không có khả năng tự ngưng kết vào môi trường thạch dinh dưỡng bán đặc (5.2.12).

Ủ môi trường ở 35^oC hoặc 37^oC (theo thoả thuận) trong 18 h - 24 h.

Dùng chất nuôi cấy này để kiểm tra kháng nguyên H theo (9.5.3.1) nhưng dùng một giọt kháng nguyên H (5.3) thay cho dung dịch muối.

...

...

...

9.5.4. Diễn giải kết quả của các phản ứng sinh hoá và huyết thanh học

Bảng 2 cho phép diễn giải kết quả những phép thử khẳng định (9.5.2 và 9.5.3) tiến hành trên những khuẩn lạc đã chọn (9.5.1).

Bảng 2

Phản ứng sinh hoá

Tự ngưng kết

Phản ứng huyết thanh

Diễn giải

Điển hình

Không

...

...

...

Các chủng được coi là Salmonella

Điển hình

Không

Tất cả phản ứng âm tính

Có thể là Salmonella

Điển hình

Có

Không thử (xem 9.5.3.1)

Không có phản ứng điển hình nào

...

...

...

Kháng nguyên O, Vi hoặc H dương tính

Không có phản ứng điển hình nào

Không

Tất cả phản ứng âm tính

Không được coi là Salmonella

9.5.5. Xác nhận định danh

Gửi những chủng được coi là Salmonella hoặc có thể là Salmonella (xem bảng 2) đến một trung tâm chuẩn được công nhận về Salmonella để xác định type.

Cần gửi theo tất cả thông tin liên quan đến các chủng đó.

10. Biểu thị kết quả

...

...

...

11. Báo cáo thử nghiệm

Bảo cáo thử nghiệm phải nêu rõ phương pháp sử dụng và kết quả thu được. Báo cáo thử nghiệm cũng phải nêu tất cả những điều kiện tiến hành mà tiêu chuẩn không qui định hoặc những điều được coi như tuỳ ý , cũng như các sự cố có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Đặc biệt, phải báo cáo rõ về nhiệt độ nuôi cấy đã sử dụng, tức là 35^oC hay 37^oC và đối với môi trường selenit/ xystin thì liệu đã có đưa nhiệt độ nuôi cấy lên đến 42^oC hay không.

Báo cáo thử nghiệm cũng cần nêu rõ xem có thu được kết quả dương tính không, khi chỉ sử dụng một môi trường đổ đĩa (5.2.4) không qui định trong tiêu chuẩn này.

Trong báo cáo phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu.

12. Đảm bảo chất lượng

Để kiểm tra phòng thí nghiệm về khả năng phát hiện Salmonella theo tiêu chuẩn này. Cần đưa các mẫu chuẩn vào các bình đối chứng từ môi trường tiền tăng sinh (xem 5.2.1). Tiến hành với bình đối chứng như đối với môi trường nuôi để thử nghiệm.

...

...

...

(Qui định)

Sơ đồ qui trình

Phụ lục B

(Qui định)

Thành phần và cách chuẩn bị môi trường nuôi cấy và các thuốc thử

B.1 Nước pepton có đệm

B.1.1 Thành phần

...

...

...

10,0 g

Natri clorua

5,0 g

Natri hydro phosphat ngậm 12 nước (Na₂HPO_4.12H₂O)

9,0 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1,5 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH để sau khi thanh trùng pH bằng 7,0, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình có dung tích thích hợp để thu được phần mẫu thử cần thiết cho phép thử.

Thanh trùng bằng nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121^oC trong 20 phút.

B.2 Môi trường magie clorua - lục malachit Rappaport - Vassiliadis

B.2.1 Dung dịch A

B.2.1.1 Thành phần

Trypton

5,0 g

...

...

...

8,0 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1,6 g

Nước

1 000 ml

B.2.1.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng đến khoảng 70^oC.

Dung dịch này và môi trường RV cần được chuẩn bị cùng ngày.

B.2.2 Dung dịch B

...

...

...

Magie clorua ngậm 6 nước (MgCl₂.6H₂O)

400,0 g

Nước

1 000 ml

B.2.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan magie clorua trong nước.

Do muối này hút ẩm mạnh, nên hoà tan MgCI₂.6H₂O từ bao bì mới mở theo tỷ lệ, thí dụ 250 g MgCI₂.6H₂O thì thêm 625 ml nước để có dung dịch với tổng thể tích 795 ml và nồng độ khoảng 31,5 g phần trăm MgCI₂.6H₂O.

Dung dịch có thể bảo quản trong chai thuỷ tinh màu nâu ở nhiệt độ phòng.

B.2.3 Dung dịch C

...

...

...

Oxalat lục malachit

0,4 g

Nước

100 ml

B.2.3.2 Chuẩn bị

Hoà tan oxalat lục malachit trong nước.

Dung dịch có thể bảo quản trong chai thuỷ tinh màu nâu ở nhiệt độ phòng.

B.2.4 Môi trường hoàn chỉnh

B.2.4.1 Thành phần

...

...

...

1 000 ml

Dung dịch B (B.2.2)

100 ml

Dung dịch C (B.2.3)

10 ml

B.2.4.2 Chuẩn bị

Thêm 100 ml dung dịch B và 10 ml dung dịch C vào 1000 ml dung dịch A.

Chỉnh pH sao cho sau khi thanh trùng pH bằng 5,2, nếu cần.

Cho từng lượng 10 ml vào ống thử trước khi sử dụng.

...

...

...

Bảo quản môi trường trong tủ lạnh.

B.3 Môi trường selenit/xystin

B.3.1 Môi trường cơ bản

B.3.1.1 Thành phần

Trypton

5,0 g

Lactoza

4,0 g

Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄.12H₂O)

...

...

...

Natri hydro selenit

4,0 g

Nước

1 000 ml

B.3.1.2 Chuẩn bị

Hoà tan ba thành phần cơ bản đầu tiên trong nước bằng cách đun sôi trong 5 phút. Sau khi làm nguội, cho thêm natri hydro selenit.

Chỉnh pH đến 7,0, nếu cần .

B.3.2 Dung dịch L-Xystin

B .3.2.1 Thành phần

...

...

...

0,1 g

Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 1 mol/l

15 ml

Nước vô trùng, vừa đủ để có thể tích cuối cùng

100 ml

B.3.2.2 Chuẩn bị

Cho các thành phần trên vào bình định mức vô trùng

Pha loãng với nước vô trùng đến 100 ml

Không thanh trùng.

...

...

...

B.3.3.1 Thành phần

Môi trường cơ bản (B.3.1)

1 000 ml

Dung dịch L-Xystin (B.3.2)

10 ml

B.3.3.2. Chuẩn bị

Làm nguội môi trường cơ bản và cho thêm dung dịch L-xystin một cách vô trùng.

Chỉnh pH đến 7,0, nếu cần.

Phân phối môi trường một cách thanh trùng vào các bình vô trùng có dung tích thích hợp để nhận được những phần mẫu cần thiết cho thử nghiệm.

...

...

...

B.4 Thạch đỏ phenol/lục sáng (Edel và Kampelacher)

B.4.1 Môi trường cơ bản

B.4.1.1 Thành phần

Bột cao men

5,0 g

Pepton

10,0 g

Bột cao nấm

3,0 g

...

...

...

1,0 g

Natri dihidro phosphat (NaH₂PO₄)

0,6g

Thạch bột hoặc thạch vẩy

12 g đến 18 g^1)

Nước

900 ml

1) Phụ thuộc vào độ đông của thạch.

B.4.1.2 Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH sao cho pH là 7,0 sau khi thanh trùng, nếu cần.

Chuyển dung dịch cơ bản vào các bình hoặc ống nghiệm có dung tích thích hợp.

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) ở 121^oC trong 15 phút.

B.4.2 Dung dịch đỏ phenol/đường

B.4.2.1 Thành phần

Lactoza

10,0 g

Saccaroza

10,0 g

...

...

...

0,09 g

Nước, đủ để có thể tích cuối cùng

100 ml

B.4.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong bình định mức với khoảng 50 ml nước.

Định mức bằng nước đến 100 ml.

Đặt trong nồi cách thuỷ ở 70^oC trong 20 phút.

Để nguội đến 55^oC ± 1^oC và dùng ngay.

B.4.3 Dung dịch lục sáng

...

...

...

Lục sáng (xem quy định trong phần phụ lục C)

khoảng 0,5 g

Nước

100 ml

B.4.3.2 Chuẩn bị

Cho lục sáng vào nước.

Bảo quản dung dịch ở chỗ tối ít nhất một ngày để quá trình tự thanh trùng diễn biến.

B.4.4 Môi trường hoàn chỉnh

B.4.4.1 Thành phần

...

...

...

900 ml

Dung dịch đỏ phenol/đường (B.4.2)

100 ml

Dung dịch lục sáng (B.4.3)

1 ml

B.4.4.2 Chuẩn bị

Trong điều kiện vô trùng cho dung dịch lục sáng vào dung dịch đỏ phenol/đường đã được làm nguội đến 55^oC ± 1^oC.

Cho tất cả vào môi trường cơ bản ở 50^oC đến 55^oC và trộn đều.

B.4.5 Chuẩn bị các đĩa thạch

...

...

...

Ngay trước khi dùng, sấy đĩa thạch một cách cẩn thận (tốt nhất là mở nắp và úp mặt thạch xuống dưới) trong tủ sấy (6.2) ở 37^oC đến 55^oC cho đến khi mặt thạch khô.

Nếu chuẩn bị trước, khi dùng thì các đĩa thạch chưa khô không được giữ quá 4 h ở nhiệt độ phòng hoặc không quá một ngày trong tủ lạnh.

B.5 Thạch dinh dưỡng

B.5.1 Thành phần

Cao thịt

3,0 g

Pepton

5,0 g

Thạch

...

...

...

Nước

1 000 ml

1) Phụ thuộc sức đông của thạch.

B.5.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho pH là 7,0 sau khi thanh trùng, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy vào ống nghiệm hoặc bình có dung tích thích hợp.

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121^oC trong 20 phút.

B.5.3 Chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng

...

...

...

B.6 Thạch 3 đường / sắt (thạch TSI)

B.6.1 Thành phần

Cao thịt

3,0 g

Cao men

3,0 g

Pepton

20,0 g

Natri clorua

...

...

...

Lactoza

10,0 g

Saccaroza

10,0 g

Glucoza

1,0 g

Sắt III citrat

0,3 g

Natri thiosunfat

...

...

...

Đỏ phenol

0,024 g

Thạch

12 g đến 18 g^1)

Nước

1 000 ml

1) Phụ thuộc vào sức đông của thạch

B.6.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH đến 7,4 sau khi thanh trùng, nếu cần.

...

...

...

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121^oC trong 10 phút.

Đặt nghiêng ống nghiệm để đáy ống nghiêm sâu khoảng 2,5 cm.

B.7 Thạch urê (Christensen)

B.7.1 Môi trường cơ bản

B.7.1.1 Thành phần

Pepton

1,0 g

Glucoza

1,0 g

...

...

...

5,0 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

2,0 g

Đỏ phenol

0,012 g

Thạch

12 đến 18 g^1)

Nước

1 000 ml

...

...

...

B.7.1.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH đến 6,8 sau khi thanh trùng, nếu cần.

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121^oC trong 20 phút.

B.7.2 Dung dịch ure

B.7.2.1 Thành phần

Ure

400 g

Nước, đủ để có thể tích cuối cùng

...

...

...

B.7.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan ure trong nước.

Thanh trùng bằng phương pháp lọc và kiểm tra độ vô trùng.

(Chi tiết của kỹ thuật lọc thanh trùng, xem trong bất cứ sách vi sinh vật học thích hợp nào).

B.7.3 Môi trường hoàn chỉnh

B.7.3.1 Thành phần

Môi trường cơ bản (B.7.1)

950 ml

Dung dịch ure (B.7.2)

...

...

...

B.7.3.2 Chuẩn bị

Trong điều kiện vô trùng cho dung dịch ure vào môi trường cơ bản đã được làm chảy và sau đó để nguội đến 45^oC ± 1^oC.

Chia từng lượng 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào các ống nghiệm vô trùng.

Đặt nghiêng các ống nghiệm.

B.8 Môi trường L - Lysin decacboxyl

B.8.1 Thành phần

L-Lysin monohydroclorua

5,0 g

Chất chiết nấm

...

...

...

Glucoza

1,0 g

Tím bromocresol

0,015 g

Nước

1 000 ml

B.8.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH đến 6,8 sau khi thanh trùng, nếu cần.

...

...

...

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121^oC trong 10 phút.

B.9 Thuốc thử β-Galactosidaze

B.9.1 Dung dịch đệm

B.9.1.1 Thành phần

Natri dihydro phosphat (NaH₂PO₄)

6,9 g

Natri hydroxyt, dung dịch 10 mol/l

khoảng 3 ml

Nước, đủ để có thể tích cuối cùng

...

...

...

B.9.1.2 Chuẩn bị

Hoà tan natri dihydro phosphat trong bình định mức với khoảng 45 ml nước.

Chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch natri hydroxit.

Thêm nước đủ để có thể tích cuối cùng 50 ml.

B.9.2 Dung dịch ONPG

B.9.2.1 Thành phần

o-Nitrophenyl (β-o-galactopyranoside (ONPG)

0,08 mg

Nước

...

...

...

B.9.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan ONPG trong nước ở 50^oC ± 1^oC.

Để nguội dung dịch.

B.9.3. Thuốc thử hoàn chỉnh

B.9.3.1 Thành phần

Dung dịch đệm (B.9.1)

5 ml

Dung dịch ONPG (B.9.2)

15 ml

...

...

...

Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG.

B.10 Thuốc thử phản ứng Voges-Proskauer (VP)

B.10.1 Môi trường VP

B. 10.1.1 Thành phần

Pepton

7,0 g

Glucoza

5,0 g

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)

...

...

...

Nước

1 000 ml

B. 10.1.2 Chuẩn bị

Hoà các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH đến 6,9 sau khi thanh trùng, nếu cần.

Chuyển 3 ml môi trường vào một số ống nghiệm.

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 115^oC trong 20 phút.

B.10.2. Dung dịch creatin (N-amidinosacosin)

B.10.2.1 Thành phần

...

...

...

0,5 g

Nước

100 ml

B.10.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan creatin ngậm 1 phân tử nước trong nước.

B.10.3 1- Naphtol, pha trong dung dịch cồn etylic

B.10.3.1 Thành phần

1-naphtol

6 g

...

...

...

100 ml

B.10.3.2 Chuẩn bị

Hoà tan 1- naphtol trong cồn etylic.

B.10.4 Dung dịch kali hidroxit

10.4.1. Thành phần

Kali hidroxit

40 g

Nước

100 ml

...

...

...

Hoà tan kali hidroxit trong nước

B.11 Thuốc thử phản ứng indol

B.11.1 Môi trường tryptophan/trypton

B.11.1.1 Thành phần

Trypton

10 g

Natri clorua

5 g

DL-Tryptophan

...

...

...

Nước

1 000 ml

B.11.1.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước ở 100^oC.

Chỉnh pH đến 7,5 sau khi thanh trùng, nếu cần.

Chuyển 5 ml môi trường vào một số ống nghiệm.

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121^oC trong 15 phút.

B.11.2 Thuốc thử Kovacs

B.11.2.1 Thành phần

...

...

...

5 g

Axit clohydric, p = 1,18 -1,19 g/ml

25 ml

2-metylbutan-2-ol

75 ml

B.11.2.2 Chuẩn bị

Trộn lẫn các thành phần.

B.12 Thạch dinh dưỡng bán đặc

B.12.1 Thành phần

...

...

...

3,0 g

Pepton

5,0 g

Thạch

4 g đến 9 g^1)

Nước

1 000 ml

1) phụ thuộc vào sức đông của thạch

B.12.2. Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH đến 7,0 sau khi thanh trùng, nếu cần.

Chuyển môi trường vào các bình có dung tích thích hợp.

Thành trùng ở 121^oC trong 20 phút.

B.12.3. Chuẩn bị đĩa thạch

Cho vào mỗi đĩa Petri nhỏ đã thanh trùng (6.13) khoảng 15 ml môi trường mới chuẩn bị. Đĩa thạch chưa cần làm khô.

B.13.  Dung dịch muối

B.13.1. Thành phần

Natri clorua

8,5 g

...

...

...

1 000 ml

B.13.2. Chuẩn bị

Hoà tan natri clorua trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH đến 7,0 sau khi thanh trùng, nếu cần.

Chia lượng dung dịch vào các bình sao cho có được 90 ml đến 100 ml sau khi thanh trùng.

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121^oC trong 20 phút.

Phụ lục C

(Qui định)

...

...

...

C.1 Đặc tính vi khuẩn học

Loại bỏ sự lan truyền của proteus trên thạch đỏ phenol/lục sáng (5.2.4.1) trong khi không ức chế sự sinh trưởng của Salmonella.

C.2 Phương pháp thử

C.2.1 Môi trường

Chuẩn bị thạch đỏ phenol/lục sáng theo B.4 nhưng với các nồng độ lục sáng khác nhau từ 4,5 mg/l đến 6 mg/l.

C.2.2 Cách tiến hành

Cấy chất nuôi cấy thuần khiết Proteus lên một loạt các đĩa thạch có các nồng độ lục sáng khác nhau và một loạt tương tự đĩa với chất nuôi cấy Salmonella, và nuôi cấy các đĩa này ở 35^oC hoặc 37^oC (theo thoả thuận) không quá 24 h.

Nồng độ lục sáng thích hợp sẽ làm Salmonella phát triển với những khuẩn lạc điển hình màu hồng, đường kính 1 mm đến 2 mm, và ức chế sự phát triển của Proteus; có nghĩa là không có sự lan truyền của Proteus.

Nồng độ lục sáng như trên được sử dụng để chuẩn bị dung dịch lục sáng (xem B.4.3).

...

...

...

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp tiêu chuẩn ria cấy đĩa môi trường thạch