Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13370:2021 về Vi sinh vật Phát hiện Salmonella spp. sử dụng thạch IRIS Salmonella

• Số hiệu: TCVN13370:2021
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2021

Pepton	10,00 g
Natri Clorua	5,00 g
Đệm phosphat	5,06 g
Nước vừa đủ	1 L

Bảo quản thành phần môi trường khô ở nhiệt độ từ 2 °C đến 30 °C.

5.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan 20,06 g các thành phần vào 1 L nước. Trộn đều cho đến khi môi trường tan hoàn toàn. Phân phối vào các ống nghiệm hoặc lọ nhỏ (6.4) sao cho huyền phù gốc có thể pha loãng đến tỷ lệ 1/10 hoặc 1/4. Tiệt trùng bằng nồi hấp áp lực (6.3) ở nhiệt độ 121 °C trong thời gian 15 min. Để thạch nguội đến nhiệt độ phòng.

pH của môi trường sử dụng ngay là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

CHÚ THÍCH 1: Thành phần môi trường có thể được điều chỉnh để có hiệu năng tối ưu.

CHÚ THÍCH 2: Thành phần của môi trường tăng sinh Salmonella phù hợp với môi trường nước đệm pepton.

Bảo quản môi trường đã chuẩn bị ở nhiệt độ từ 2 °C đến 25 °C.

5.2  Môi trường tăng sinh Salmonella hai lần đệm ^[2]^)

5.2.1  Thành phần

...

...

...

10,00 g

Natri Clorua

5,00 g

Đệm phosphat

10,12 g

Nước vừa đủ

1 L

Bảo quản thành phần môi trường khô ở nhiệt độ từ 2 °C đến 30 °C.

5.2.2  Chuẩn bị

...

...

...

pH của môi trường sử dụng ngay là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

Bảo quản môi trường đã chuẩn bị ở nhiệt độ từ 2 °C đến 25 °C.

5.3  Môi trường tăng sinh Salmonella bổ sung Tween ^2)

Môi trường tăng sinh Salmonella (5.1) bổ sung Tween^® 80 [polyoxyetylen (20) sorbitan monooleat) nồng độ 10 g/L.

5.4  Chất bổ sung IRIS Salmonella^® dạng viên ^[3]^), chứa natri sulfadiazine (hàm lượng từ 1 % đến 20 %) và novobiocine (hàm lượng từ 0,1 % đến 1 %), bao gồm loại sử dụng cho 225 mL canh thang và loại sử dụng cho 90 mL canh thang.

5.5  Chất bổ sung IRIS Salmonella^® dạng lỏng ^3), chứa natri sulfadiazine (hàm lượng > 0,1 %) và novobiocine (hàm lượng > 0,1 %), dựng trong lọ (vial) dung tích 50 mL.

5.6  Chất bổ sung CSD ^3), dạng lỏng đựng trong lọ dung tích 100 mL hoặc dạng viên tương ứng với 10 g và 25 g phần mẫu thử.

5.7  Thạch IRIS Salmonella^® ^3)

5.7.1  Thành phần

...

...

...

10,0 g

Chất chiết nấm men

5,0 g

Natri clorua

5,0 g

Đệm phosphat

7,0 g

Các chất ức chế chọn lọc

10,2 g

...

...

...

1,0 g

Thạch dùng cho vi sinh vật

16,0 g

Chất hỗ trợ quan sát vi khuẩn

6,5 g

Nước vừa đủ

1 L

Bảo quản thành phần môi trường khô ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

5.7.2  Chuẩn bị

...

...

...

pH của môi trường sử dụng ngay là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

Bảo quản môi trường đã chuẩn bị ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

5.7.3  Thử nghiệm hiệu năng đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy

Các kết quả điển hình sau ủ 24 h ở nhiệt độ 37 °C trên thạch IRIS Salmonella^®:

Chủng Salmonella Typhimurium WDCM 00031:

Sinh trưởng tốt, khuẩn lạc màu hồng sẫm

Chủng Salmonella Enteritidis WDCM 00030:

Sinh trưởng tốt, khuẩn lạc màu hồng sẫm

Chủng Enterobacter aerogenes WDCM 00175:

...

...

...

Chủng Escherichia coli WDCM 00013:

Ít bị ức chế, khuẩn lạc không màu

Chủng Staphylococcus aureus WDCM 00034:

Bị ức chế

Chủng Pseudomonas aeruginosa WDCM 00025:

Bị ức chế

5.8  α-Amylase

5.9  Chất trung hòa.

6  Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

6.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

6.2  Dụng cụ đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

6.3  Nồi hấp áp lực, có thể kiểm soát ở nhiệt độ 121 °C.

6.4  Ống nghiệm hoặc lọ nhỏ (vial).

6.5  Bình định mức, dung tích 1 L.

6.6  Máy trộn nhu động.

6.7  Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính 90 mm.

6.8  Pipet xả hết, vô trùng, dung tích danh nghĩa 1 mL, được chia vạch 0,1 mL.

6.9  Micropipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.

...

...

...

6.11  Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 37 °C ± 1 °C và 41,5 °C ± 1 °C.

6.12  Que cấy vòng vô trùng, đường kính khoảng 3 mm (dung tích 10 μl) và kim cấy hoặc que cấy.

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

8  Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị phần mẫu thử theo phần tương ứng của bộ TCVN 6507 (ISO 6887).

9  Cách tiến hành

9.1  Mẫu thực phẩm, mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu môi trường

...

...

...

CHÚ THÍCH 1: Chuẩn bị huyền phù ban đầu trong môi trường tăng sinh bổ sung Tween (5.3) để tăng sinh đối với các nền mẫu chứa hàm lượng chất béo lớn hơn 20 %.

CHÚ THÍCH 2: Sử dụng môi trường tăng sinh hai lần đệm (5.2) hoặc môi trường tăng sinh Salmonella (5.1) đối với các nền mẫu axit hoặc nền mẫu axit hóa.

Thêm chất bổ sung IRIS Salmonella^® dạng lỏng (5.5) hoặc chất bổ sung IRIS Salmonella^® dạng viên (5.4). Nếu sử dụng chất bổ sung dạng lỏng, thêm vào với nồng độ 0,1 mL/g mẫu (ví dụ: thêm 2,5 mL vào 25 g phần mẫu thử). Nếu sử dụng chất bổ sung dạng viên, cho trực tiếp một viên chất bổ sung thích hợp tương ứng với 225 mL canh thang (đối với phần mẫu thử 25 g) hoặc với 90 mL canh thang (đối với phần mẫu thử 10 g).

CHÚ THÍCH 3: Các mẫu bề mặt sau khi rửa (mẫu môi trường) có thể chứa các chất khử trùng, nên sử dụng 10 % chất trung hòa (5.9) và 90 % môi trường tăng sinh Salmonella sau đó thêm chất bổ sung CSD (5.6) dạng lỏng (nồng độ 0,1 mL/g phần mẫu thử) hoặc dạng viên (một viên, loại tương ứng với 10 g hoặc 25 g phần mẫu thử). Có thể sử dụng gạc, bọt biển hoặc miếng vải ngâm trong dung dịch trung hòa.

Trộn đều, sử dụng máy trộn nhu động (6.6) nếu cần.

Ủ canh thang trong tủ ấm (6.11) ở nhiệt độ 41,5 °C ± 1,0 °C, thời gian ủ từ 16 h đến 24 h.

Dùng que cấy vòng vô trùng (6.12), lấy 10 μL dịch môi trường tăng sinh và ria cấy lên bề mặt đĩa thạch IRIS Salmonella^® (5.7).

Ủ đĩa thạch ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C trong thời gian 24 h ± 3 h.

9.2  Mẫu bột ngũ cốc và sản phẩm từ bột ngũ cốc

...

...

...

CHÚ THÍCH: Thêm amylase (5.8) với nồng độ 0,1 g/L đối với các mẫu sản phẩm ngũ cốc dành cho trẻ nhỏ.

Thêm chất bổ sung IRIS Salmonella^® dạng lỏng (5.5) với nồng độ 0,1 mL/g mẫu (ví dụ: thêm 12,5 mL vào 125 g phần mẫu thử).

Trộn đều, sử dụng máy trộn nhu động (6.6) nếu cần.

Ủ canh thang trong tủ ấm (6.11) ở nhiệt độ 41,5 °C ± 1,0 °C, thời gian ủ từ 18 h đến 24 h.

Dùng que cấy vòng vô trùng (6.12), lấy 10 μL dịch môi trường tăng sinh và ria cấy lên bề mặt đĩa thạch IRIS Salmonella^® (5.7).

Ủ đĩa thạch ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C trong thời gian 24 h ± 3 h.

9.3  Mẫu sữa bột

Bằng cách vô trùng, cho 1(x) g phần mẫu thử vào 9(x) mL môi trường tăng sinh Salmonella (5.1) đã được làm ấm đến nhiệt độ 41,5 °C.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng môi trường tăng sinh hai lần đệm (5.2) đối với các nền mẫu axit hoặc nền mẫu axit hóa.

...

...

...

Trộn đều, sử dụng máy trộn nhu động (6.6) nếu cần.

Ủ canh thang trong tủ ấm (6.11) ở nhiệt độ 41,5 °C ± 1,0 °C, thời gian ủ từ 18 h đến 24 h.

Dùng que cấy vòng vô trùng (6.12), lấy 10 μL dịch môi trường tăng sinh và ria cấy lên bề mặt đĩa thạch IRIS Salmonella^® (5.7).

Ủ đĩa thạch ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C trong thời gian 24 h ± 3 h.

9.4  Mẫu thức ăn công thức dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, có hoặc không có probiotic

9.4.1  Mẫu có khối lượng dưới 50 g

Bằng cách vô trùng, cho 1(x) g phần mẫu thử vào 9(x) mL môi trường tăng sinh Salmonella (5.1).

CHÚ THÍCH: có thể sử dụng môi trường tăng sinh hai lần đệm (5.2) hoặc môi trường tăng sinh Salmonella (5.1) đối với các nền mẫu chứa probiotic.

Thêm chất bổ sung IRIS Salmonella^® (5.4 hoặc 5.5) hoặc chất bổ sung CSD (5.6), dạng lỏng hoặc dạng viên. Nếu sử dụng chất bổ sung dạng lỏng, thêm vào với nồng độ 0,1 mL/g mẫu (ví dụ: thêm 2,5 mL vào 25 g phần mẫu thử). Nếu sử dụng chất bổ sung dạng viên, cho trực tiếp một viên chất bổ sung thích hợp tương ứng với phần mẫu thử 25 g hoặc với phần mẫu thử 10 g; đối với phần mẫu thử lớn hơn 25 g, có thể dùng kết hợp một số viên chất bổ sung (ví dụ: dùng 3 viên chất bổ sung loại 25 g cho 75 g phần mẫu thử).

...

...

...

Ủ canh thang trong tủ ấm (6.11) ở nhiệt độ 41,5 °C ± 1,0 °C, thời gian ủ từ 16 h đến 24 h nếu sử dụng chất bổ sung IRIS Salmonella^® và từ 16 h đến 22 h nếu sử dụng chất bổ sung CSD.

Dùng que cấy vòng vô trùng (6.12), lấy 10 μL dịch môi trường tăng sinh và ria cấy lên bề mặt đĩa thạch IRIS Salmonella^® (5.7).

Ủ đĩa thạch ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C trong thời gian 24 h ± 3 h.

9.4.2  Mẫu có khối lượng từ 50 g đến 375 g

Bằng cách vô trùng, cho 1(x) g phần mẫu thử vào 3(x) mL môi trường tăng sinh Salmonella (5.1) đã được làm ấm đến nhiệt độ 41,5 °C.

CHÚ THÍCH 1: Có thể sử dụng môi trường tăng sinh hai lần đệm (5.2) hoặc môi trường tăng sinh Salmonella (5.1) đối với các nền mẫu chứa probiotic.

Thêm chất bổ sung CSD dạng lỏng (5.6) với nồng độ 0,1 mL/g mẫu (ví dụ: thêm 37,5 mL vào 375 g phần mẫu thử). Nếu sử dụng chất bổ sung dạng viên, có thể dùng kết hợp một số viên chất bổ sung.

CHÚ THÍCH 2: Có thể tiến hành theo quy trình pha loãng 1/10 [cho 1(x) g phần mẫu thử vào 9(x) mL môi trường tăng sinh] và sử dụng chất bổ sung IRIS Salmonella^®.

Trộn đều, sử dụng máy trộn nhu động (6.6) nếu cần.

...

...

...

Dùng que cấy vòng vô trùng (6.12), lấy 10 μL dịch môi trường tăng sinh và ria cấy lên bề mặt đĩa thạch IRIS Salmonella^® (5.7).

Ủ đĩa thạch ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C trong thời gian 24 h ± 3 h.

9.5  Lưu ý

Canh thang sau khi ủ (xem 9.1 đến 9.4) có thể giữ đến 3 ngày ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trước khi chuyển sang thạch IRIS Salmonella.

Thạch IRIS Salmonella sau khi ủ có thể giữ đến 3 ngày ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trước khi đọc kết quả (xem Điều 10) và tiến hành bước khẳng định (xem Điều 11).

10  Đọc kết quả

Hình thái các khuẩn lạc trên thạch IRIS Salmonella^® bao gồm:

+ Salmonella spp.:

Khuẩn lạc đặc trưng có màu từ hồng đến hồng sẫm

...

...

...

Khuẩn lạc đặc trưng không màu

+ Enterobacter spp., Klebsiella spp.:

Khuẩn lạc đặc trưng màu từ lục lam đến tím

+ Proteus spp.:

Khuẩn lạc đặc trưng từ không màu đến màu nâu nhạt

+ Các vi khuẩn Gram dương:

Bị ức chế.

11  Khẳng định

Các kết quả dương tính giả định đều phải được khẳng định bởi một trong các phương pháp sau:

...

...

...

b) các phương pháp khác đã được xác nhận giá trị sử dụng hoặc đã được chuẩn hóa theo ISO 16140-6 (ví dụ: phép thử Salmonella Latex), sử dụng các khuẩn lạc đặc trưng được phân lập trên môi trường IRIS Salmonella.

Trong trường hợp có kết quả không đồng nhất (dương tính giả định với phương pháp thay thế, nhưng không khẳng định được bởi một trong các phương pháp nêu trên), phòng thử nghiệm phải thực hiện các bước cần thiết để đảm bảo tính hợp lệ của kết quả. Ví dụ: có thể tiến hành các phép thử sinh hóa hoặc đoạn dò nucleic theo TCVN 6404 (ISO 7218).

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

e) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được cho là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Mẫu thịt bò xay được cấy chủng Salmonella Typhimurium A00C060. Các mức cấy chủng như sau:

+ Mức 0 cfu/25 mL

+ Mức từ 1 đến 10 cfu/25 mL

+ Mức từ 5 đến 50 cfu/25 mL

Mười bảy phòng thử nghiệm tham gia phép thử liên phòng. Mỗi phòng thử nghiệm nhận được 48 mẫu, gồm 24 mẫu tiến hành theo phương pháp chuẩn [TCVN 10780-1:2017 (ISO 6579-1:2017)] và 24 mẫu tiến hành theo phương pháp thay thế nêu trong tiêu chuẩn này. Ngoài ra, có một mẫu định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ưa ấm trong mẫu không cấy chủng theo TCVN 4884 (ISO 4833).

...

...

...

a) Độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối

Độ chính xác là mức độ gần nhau giữa kết quả thử nghiệm và giá trị tham chiếu được chấp nhận.

Độ đặc hiệu tương đối là mức độ mà một phương pháp chịu hoặc không chịu ảnh hưởng bởi các thành phần không phải là thành phần đích trong mẫu nhiều thành phần. Độ đặc hiệu tương đối thể hiện khả năng của phương pháp để đo hoặc định lượng chính xác một chất phân tích nhất định trong mẫu thử mà không bị nhiễu bởi các thành phần không phải là thành phần đích, ví dụ: ảnh hưởng của nền mẫu hoặc nhiễu nền.

Độ nhạy tương đối là khả năng của phương pháp thay thế để phát hiện hai lượng chất phân tích khác nhau được đo trước đó bằng phương pháp chuẩn, sử dụng một chất nền nhất định, trên toàn bộ dải đo. Sự thay đổi về số lượng tối thiểu (sự gia tăng nồng độ x của chất phân tích) tạo ra sự thay đổi đáng kể trong tín hiệu đo được (đáp ứng y).

Bảng A.1 - So sánh độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu

Thông số

Nghiên cứu liên phòng

Nghiên cứu so sánh phương pháp

Cấy BPWW bổ sung 16 h ở 41,5 °C

...

...

...

Độ chính xác tương đối (AC), %

99,7

89,7

90,0

Độ nhạy (SE), %

100,0

87,4

88,0

Độ đặc hiệu (SP), %

...

...

...

91,6

91,0

b) Độ chụm (độ lặp lại và độ tái lập)

Độ lặp lại trong phân tích định tính là phần trăm cơ hội thu được cùng một kết quả (tức là đều dương tính hoặc đều âm tính) với hai mẫu giống hệt nhau được phân tích bởi cùng một phòng thử nghiệm, trong các điều kiện lặp lại (nghĩa là bởi một người thực hiện sử dụng cùng một dụng cụ và thuốc thử, trong phạm vi thời gian cách nhau ngắn nhất đến mức có thể).

Độ tái lập trong phân tích định tính là phần trăm cơ hội thu được cùng một kết quả đối với hai mẫu giống hệt nhau được phân tích bởi hai phòng thử nghiệm khác nhau.

Bảng A.2 - So sánh độ lặp lại và độ tái lập

Độ lặp lại, %

Độ tái lập, %

...

...

...

Phương pháp chuẩn

[TCVN 10780-1 (ISO 6579-1)]

Phương pháp sử dụng thạch IRIS Salmonella

Phương pháp chuẩn

[TCVN 10780-1 (ISO 6579-1)]

Phương pháp sử dụng thạch IRIS Salmonella

Mức 0

97,8

100,0

...

...

...

100,0

Mức 1

100,0

100,0

100,0

100,0

Mức 2

100,0

100,0

...

...

...

100,0

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] NF Validation (2015), IRIS Salmonella method for the detection of Salmonella

[2] Solabia SAS (2021), IRIS Salmonella - Detection method for Salmonellae, Technical Data Sheet, Env8-2021

[3] AOAC 967.27 Salmonella in foods. Identification

[4] AOAC 978.24 Salmonella spp. in foods. Biochemical identification kit method

[5] AOAC 989.12 Salmonella spp., Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods. Biochemical identification kit method

[6] AOAC 991.13 Salmonella, Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods. Biochemical system identification (Vitek GNI+) screening method

...

...

...

[8] TCVN 4884 (ISO 4833) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh vật

[9] TCVN 12365-2:2018 (ISO 16140-2:2016) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp - Phần 2: Quy trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn

[1]^) Sử dụng sản phẩm của Biokar-diagnostics, 60002 Beauvais Cedex, Pháp. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

[2]^) Sử dụng sản phẩm của Biokar-diagnostics, 60002 Beauvais Cedex, Pháp. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

[3]^) Sử dụng sản phẩm của Biokar-diagnostics, 60002 Beauvais Cedex, Pháp.