Tiêu chuẩn TCVN 13292:2021 về Xác định hàm lượng curcurminoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV-Vis

• Số hiệu: TCVN13292:2021
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2021

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13292:2021

NGUYÊN LIỆU VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHỨA NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA) - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CURCUMINOID BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR UV-VIS

Raw materials and health supplements containing turmeric (Curcuma tonga) - Determination of curcuminoids content by high performance liquid chromatographic method with UV-Vis detection

Lời nói đầu

TCVN 13292:2021 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2016.16 Curcuminoids in turmeric raw materials and dietary supplements Liquid. Chromatography with UV-Vis detection;

TCVN 13292:2021 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

NGUYÊN LIỆU VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHỨA NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA) - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CURCUMINOID BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR UV-VIS

...

...

...

CẢNH BÁO: Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-Vis để xác định hàm lượng các curcuminoid [bao gồm curcumin (CUR), demethoxycurcumin (DMC) và bis- demethoxycurcumin (BDMC)] trong củ nghệ vàng (Curcuma longa) và thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ nghệ vàng hoặc có kết hợp nghệ vàng với các thành phần khác.

2  Nguyên tắc

Mẫu thử được chiết bằng metanol, sử dụng máy lắc. Các mẫu dự kiến có hàm lượng chất phân tích cao cần được pha loãng trước khi phân tích. Định lượng curcuminoid bằng phương pháp ngoại chuẩn với ba chất chuẩn CUR, DMC và BDMC.

3  Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước cất hai lần, đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Metanol (CH₃OH).

3.2  Axetonitril (CH₃CN).

...

...

...

3.4  Pha động

3.4.1  Pha động A (axit formic 0,1 % trong nước)

Trộn 1 mL axit formic với 999 mL nước, lắc đều, rung siêu âm để loại khí.

3.4.2  Pha động B (axit formic 0,1 % trong axetronitril)

Trộn 1 mL axit formic với 999 mL axetonitril, lắc đều, rung siêu âm để loại khí.

3.5  Chất chuẩn Curcumin (CUR), ví dụ: ASB-00003926 (ChromaDex)[1].

3.6  Chất chuẩn Demethoxycurcumin (DMC), ví dụ: ASB-00004230^[1].

3.7  Chất chuẩn Bisdemethoxycurcumin (BDMC), ví dụ: ASB-00004231 ^[1].

3.8  Dung dịch chuẩn curcuminoid

...

...

...

3.8.1.1  Dung dịch chuẩn gốc CUR, 1000 μg/ml (CUR-1000)

Cân một lượng chính xác khoảng 10,0 mg chất chuẩn CUR (3.5), chuyển vào bình định mức 10 mL (4.12) . Pha loãng đến vạch bằng metanol (3.1 1), trộn đều và bảo quản trong lọ có nắp vặn kín ở -20 °C. Dung dịch đã chuẩn bị có thể bền trong 4 tuần.

Nồng độ thực tế được tính lại theo độ tinh khiết và lượng cân chuẩn CUR.

3.8.1.2  Dung dịch chuẩn gốc DMC, 1000 μg/ml (DMC-1000)

Cân một lượng chính xác khoảng 10,0 mg chất chuẩn DMC (3.6 6), chuyển vào bình định mức 10 mL (4.12) . Pha loãng đến vạch bằng metanol (3.1), trộn đều và bảo quản trong lọ có nắp vặn kín ở -20 °C. Dung dịch đã chuẩn bị có thể bền trong 4 tuần.

Nồng độ thực tế được tính lại theo độ tinh khiết và lượng cân chuẩn DMC.

3.8.1.3  Dung dịch chuẩn gốc BDMC, 1000 μg/ml (BDMC-1000)

Cân một lượng chính xác khoảng 10,0 mg chất chuẩn BDMC (3.7 7), chuyển vào bình định mức 10 mL. Pha loãng đến vạch bằng metanol (3.1 1), trộn đều và bảo quản trong lọ có nắp vặn kín ở -20 °C. Dung dịch đã chuẩn bị có thể bền trong 4 tuần.

Nồng độ thực tế được tính lại theo độ tinh khiết và lượng cân chuẩn BDMC.

...

...

...

Từ các dung dịch chuẩn gốc CUR-1000 (3.8.1.1), DMC-1000 (3.8.1.2) và BDMC-1000 (3.8.1.3), tiến hành pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp với nồng độ CUR trong khoảng từ 5 đến 300 μg/mL, nồng độ DMC và BDMC trong khoảng từ 1 μg/mL đến 100 μg/mL, sử dụng dung môi metanol. Các dung dịch chuẩn hỗn hợp sử dụng trong ngày.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng (HPLC), gồm bơm hai kênh, bộ bơm mẫu tự động, detector UV-Vis.

4.2  Cột sắc ký, ví dụ: Kinetex C18, 2,6 μm, 2,1 mm x 30 mm (Phenomenex)[2].

CHÚ THÍCH: Chiều dài và đường kính của cột có thể được thay đổi theo kỹ thuật sử dụng HPLC.

4.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.4  Máy nghiền ly tâm, với rây cỡ lỗ 0,25 mm.

4.5  Pipet định mức, dung tích 25 mL.

...

...

...

4.7  Máy lắc Vortex.

4.8  Máy ly tâm, thích hợp cho ống ly âm 50 mL, có thể đạt gia tốc tối đa 21 000g.

4.9  Máy lắc.

4.10  Pipet tự động, có thể phân phối các thể tích 200 μL và 1000 μL.

4.11  Lọ nhỏ, có nắp vặn dùng cho HPLC.

4.12  Bình định mức, dung tích 10 mL.

4.13  Xyranh, dung tích 3 mL.

4.14  Đầu lọc xyranh, 0,2 μm.

4.15  Chai đựng dung môi, dung tích 1000 mL.

...

...

...

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Tham khảo các tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm. Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm, việc lấy mẫu theo thỏa thuận giữa các bên liên quan.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu

6.1.1  Đối với mẫu dạng rắn

6.1.1.1  Đồng nhất mẫu

- Mẫu nghệ khô được nghiền nhỏ bằng máy nghiền ly tâm có rây 0,25 mm (4.4).

- Mẫu viên nén: đồng hóa 20 viên bằng máy nghiền (4.4).

- Viên nang cứng: đồng hóa 20 viên bằng cách trộn đều phần bột trong nang cứng.

...

...

...

Mẫu đã đồng nhất được bảo quản trong ống ly tâm polypropylen (4.6) ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Trộn đều trước khi lấy phần mẫu thử.

6.1.1.2  Chiết phần mẫu thử

Chuẩn bị ba phần mẫu thử đồng thời.

Dùng cân phân tích (4.3) cân khoảng 75 mg mẫu, đối với mẫu dạng viên nang mềm cân 200 mg đến 300 mg cho vào ống ly tâm 50 mL (4.6). Thêm 25 mL metanol (3.1 và lắc trộn đều bằng máy lắc Vortex (4.7) trong 30 s. Lắc bằng máy lắc (4.9) trong 15 min ở nhiệt độ phòng. Ly tâm ở tốc độ 6 000 r/min trong 5 min bằng máy ly tâm (4.8). Lọc 1 mL dịch chiết mẫu thử qua xyranh (4.13) có đầu lọc 0,2 μm (4.14) vào lọ nhỏ (4.11) và bảo quản ở 4 °C, tránh ánh sáng đến khi phân tích.

6.1.2  Đối với mẫu dạng lòng chứa etanol

Lắc trộn đều vài lần trước khi phân tích.

Pha loãng 100 μL mẫu với 900 μL metanol (3.1 và lắc trộn đều bằng máy lắc Vortex (4.7). Lọc dịch qua xyranh có đầu lọc 0,2 μm (4.14) vào lọ nhỏ (4.11) và bảo quản lọ nhỏ ở 4 °C, tránh ánh sáng đến khi phân tích.

6.2  Xác định bằng HPLC

6.2.1  Điều kiện vận hành HPLC

...

...

...

- Detector: UV-Vis ở bước sóng 425 nm;

- Nhiệt độ cột: 55 °C;

- Thể tích mẫu bơm: 1,0 μL;

- Tốc độ dòng pha động: 1,4 mL/min theo chương trình rửa giải gradient như sau:

Thời gian, min

% B

Tốc độ dòng, mL/min

0

28

...

...

...

1,0

28

1,40

2,0

30

1,40

4,0

30

1,40

...

...

...

50

1,75

6,0

50

1,75

8,5

28

1,40

Ổn định cột bằng pha động A.

...

...

...

6.2.2  Dựng đường chuẩn

Để thiết bị ổn định tốc độ dòng và áp suất sau đó tiến hành bơm lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp đã chuẩn bị sẵn (3.8.2) vào hệ thống HPLC.

Xác định diện tích hoặc chiều cao pic của từng chất phân tích CUR, DMC và BDMC trong bộ dung dịch chuẩn hiệu chuẩn và các chuẩn được thêm vào. Đảm bảo rằng các diện tích pic chuẩn hiệu chuẩn được thêm vào nằm trong phạm vi sai lệch 5 % so với diện tích píc chuẩn hiệu chuẩn ban đầu.

Dựng đồ thị nồng độ chất phân tích (trục x) CUR, DMC và BDMC so với diện tích pic riêng lẻ (trục y). Sử dụng phân tích bình phương tối thiểu để xác định độ dốc, giao điểm và hệ số tương quan (R2) của đường phù hợp nhất đối với mỗi chất phân tích.

6.2.3  Phân tích mẫu thử

Bơm mẫu thử với cùng điều kiện như bơm chuẩn, xác định diện tích hoặc chiều cao pic. Dựa vào đường chuẩn của từng chất phân tích, xác định hàm lượng CUR, DMC và BDMC có trong mẫu thử.

Nếu diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu lớn hơn diện tích pic hoặc chiều cao pic của chuẩn cao nhất thì phải tiến hành pha loãng mẫu trong metanol (3.1 và bơm lại. Cứ sau mười lần bơm mẫu lại bơm các dung dịch hiệu chuẩn hỗn hợp vì mục đích kiểm soát chất lượng.

Từ đường chuẩn và diện tích pic của mỗi chất phân tích trong các mẫu, tính nồng độ của CUR, DMC và BDMC trong mỗi dung dịch mẫu. Nếu diện tích pic của bất kỳ chất phân tích nào nằm cao quá đường chuẩn của chất phân tích đó, pha loãng dịch chiết tỷ lệ 1 : 10 hoặc tỷ lệ 1 : 20 trong metanol, sau đó lọc và phân tích lại dịch chiết.

7  Tính kết quả

...

...

...

(1)

Trong đó:

C  là nồng độ của mỗi chất phân tích từ đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít (mg/L);

V  là thể tích chiết, tính bằng lít (ở đây V = 0,025 lít);

k  là hệ số pha loãng;

m  là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

Hàm lượng curcuminoid là tổng hàm lượng của ba chất phân tích CUR, DMC, BDMC. Báo cáo kết quả hàm lượng curcuminoid trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên gam (mg/g), là hàm lượng trung bình với độ tin cậy 95 %, theo Công thức (2):

...

...

...

Trong đó:

  là giá trị trung bình của kết quả phân tích ba lần lặp lại, biểu thị bằng miligam trên gam (mg/g);

t_a,v  là giá trị của chuẩn t (ở đây giá trị t là 4,303 với ba lần lặp lại và a = 0,05);

 là sai số chuẩn, được tính theo Công thức (3):

(3)

Trong đó:

s  là độ lệch chuẩn;

n  là số lần lặp lại (ở đây n = 3).

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thòng tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

...

...

...

Hình A.1 - Sắc ký đồ phân tích của hỗn hợp dung dịch chuẩn

Hình A.2 - Sắc ký đồ phân tích của mẫu củ nghệ vàng